1、选修选修3 现代生物科技专题现代生物科技专题专题专题1 基因工程基因工程基因工程是指按照基因工程是指按照 ，进行，进行严格的设计，并通过严格的设计，并通过 DNA重组和重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是生物类型和生物产品。由于基因工程是在在 水平上进行设计和施工水平上进行设计和施工的，因此又叫做的，因此又叫做 。一、基因工程的概念一、基因工程的概念人们的意愿人们的意愿体外体外DNA重组技术重组技术DNA分子分子操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作
2、水平基本过程基本过程结果结果生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物(定向定向改造生物遗传特性改造生物遗传特性)实质：实质：基因重组基因重组基因工程的特点：基因工程的特点：将抗虫基因移植到棉花的细胞中，使棉将抗虫基因移植到棉花的细胞中，使棉花具有抗虫害的作用。假如你作为一名研究者花具有抗虫害的作用。假如你作为一名研究者来完成这一项工作，那么你会遇到哪些困难或来完成这一项工作，那么你会遇到哪些困难或需要解决哪些问题呢？需要解决哪些问题呢？1 1、如何将抗虫基因（目的基因）从某种生物、如何将抗虫基因（目的基因）从某种生物的的
3、DNADNA上切割下来？上切割下来？2 2、如何使抗虫基因（目的基因）与棉花的、如何使抗虫基因（目的基因）与棉花的DNADNA连接起来？连接起来？基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：苏云金芽孢杆苏云金芽孢杆菌菌(有抗虫特性有抗虫特性)普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNADNA拼接拼接导入导入棉花细胞棉花细胞(含抗虫基因含抗虫基因)棉花植株棉花植株(有抗虫特性有抗虫特性)提取提取 通过观察抗虫棉的培育过程，你认为关通过观察抗虫棉的培育过程，你认为关键的步骤是什么？键的步骤是什么？关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取。关键
4、步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取。关键步骤二：抗虫基因与运载体关键步骤二：抗虫基因与运载体DNADNA连接。连接。关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。通过观察抗虫棉的培育过程，你认为关键的通过观察抗虫棉的培育过程，你认为关键的步骤是什么？步骤是什么？工具：基因的剪刀工具：基因的剪刀限制性内切酶限制性内切酶工具：基因的针线工具：基因的针线DNA连接酶连接酶工具：基因的运输工具工具：基因的运输工具运载体运载体二、基因操作的工具二、基因操作的工具1.2.11.2.1限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.来源：来源：主要是从主要是从 中分离纯化出来的。中分离纯化出来
5、的。2.功能：功能：能够识别双链能够识别双链DNA分子的某种分子的某种 核核苷酸序列，并且使每一条链中苷酸序列，并且使每一条链中 部位的两部位的两个核苷酸之间的个核苷酸之间的 断开，因此具有断开，因此具有 性。性。特定特定原核生物原核生物特定特定磷酸二酯键磷酸二酯键特异特异现在已知的核酸限制性内切酶均不能切割现在已知的核酸限制性内切酶均不能切割RNA 定义：定义：限制性内切酶在双链分子上能识别的特定限制性内切酶在双链分子上能识别的特定核苷酸序列。又称为识别位点、切割位点或靶位点。核苷酸序列。又称为识别位点、切割位点或靶位点。长度：长度：大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由 个核苷个
6、核苷酸组成。酸组成。也有也有4 4、5 5或或8 8个核苷酸的。个核苷酸的。结构特点：结构特点：具有具有结构，即：回文结结构，即：回文结构。构。6 经限制酶切割产生的经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种片段末端通常有两种形式：形式：和和 。前者是限制酶。前者是限制酶在它识别序列的在它识别序列的 将将DNA的两条链切开的两条链切开产生的，后者是限制酶在它识别序列的产生的，后者是限制酶在它识别序列的 切切开产生的。开产生的。黏性末端黏性末端平末端平末端中心轴线两侧中心轴线两侧中心轴线中心轴线G A A T T CGC T T A AA A T T CG限制酶切割限制酶切割DNA分子示意图分子
7、示意图 C T T A A G黏性末端黏性末端EcoREcoR C C C G G G限制酶切割限制酶切割DNA分子示意图分子示意图 G G G C C C平末端平末端SmaSma C C C G G GG G GC C C1.不同不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；黏性末端都相同；2.同一个同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端的黏性末端一般一般不相同；不相同；3.不同限制酶切割形成的黏性末端，如互补不同限制酶切割形成的黏性末端，如互补则可以相互重新配对。则可以相互重新配对。1：下列关于限制酶的说法正确的是（：
8、下列关于限制酶的说法正确的是（）A.限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少 B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C.不同的限制酶切割不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端后都会形成黏性末端 D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键B2.现有一长度为现有一长度为3 000个碱基对个碱基对(bp)的线性的线性DNA分子，用限制分子，用限制酶切后，进行凝胶电泳，使降酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶解产物分开。用酶H单独酶切，单独酶切，结果如图结果如图1。用酶。用
9、酶B单独酶切，单独酶切，结果如图结果如图2。用酶。用酶H和酶和酶B同时同时酶切，结果如图酶切，结果如图3。该。该DNA分分子的结构及其酶切图谱是子的结构及其酶切图谱是()A3.限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分分子上特定的核苷酸序列。如图为四种限制酶子上特定的核苷酸序列。如图为四种限制酶BamH，EcoR，Hind以及以及Bgl 的辨识序的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互片段末端可以互补黏合，其正确的末端互补序列应该为补
10、黏合，其正确的末端互补序列应该为:A.BamH和和EcoR；末端互补序列；末端互补序列-AATT-B.BamH和和Hind；末端互补序列；末端互补序列-GATC-C.EcoR和和Hind；末端互补序列；末端互补序列-AATT-D.BamH和和Bgl；末端互补序列；末端互补序列-GATC-D4.一环状一环状DNA分子，设其长度为分子，设其长度为1。限制性内切酶。限制性内切酶A在其上的切点位于在其上的切点位于0.0处；限制性内切酶处；限制性内切酶B在其上的切在其上的切点位于点位于0.3处；限制性内切酶处；限制性内切酶C的切点未知。但的切点未知。但C单独单独切或与切或与A或或B同时切的结果如下表，请
11、确定同时切的结果如下表，请确定C在该环在该环形形DNA分子的切点应位于图中的分子的切点应位于图中的:A.0.2和和0.4处处 B.0.4和和0.6处处C.0.5和和0.7处处 D.0.6和和0.9处处A1。分类：。分类：根据酶的来源不同，可分为两类：一类是根据酶的来源不同，可分为两类：一类是从从 中分离得到的，称为中分离得到的，称为 连连接酶；另一类是从接酶；另一类是从 中分离出来中分离出来的，称为的，称为 连接酶。连接酶。1.2.2 基因的的针线基因的的针线DNADNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌E.coliDNAT4噬菌体噬菌体T4DNA2。两种。两种DNA连接酶的比较：连接酶的比较：（1
12、）相同点：）相同点：都缝合都缝合 键。键。（2）区别：）区别：EcoliDNA连接酶只能将双链连接酶只能将双链DNA片段片段互补的互补的 之间连接起来，而不能将双链之间连接起来，而不能将双链DNA片段片段 之间进行连接；而之间进行连接；而T4DNA连接连接酶既可以酶既可以“缝合缝合”双链双链DNA片段互补的片段互补的 ，又可以又可以“缝合缝合”双链双链DNA片段的片段的 。但连。但连接平末端的之间的效率较接平末端的之间的效率较 。（3 3）连接的部位：）连接的部位：磷酸二酯键（在磷酸二酯键（在“梯子梯子”的扶手的扶手处），处），不是氢键（在不是氢键（在“梯子梯子”的踏板处）。的踏板处）。DNA
13、连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶作用实质作用实质催化相邻二个核苷酸形成磷酸二酯键催化相邻二个核苷酸形成磷酸二酯键模板模板不需要不需要需要需要连接连接DNA链的方式链的方式双链双链单链单链作用过程作用过程在两个在两个DNA片段片段之间形成磷酸二酯之间形成磷酸二酯键键以一条以一条DNA链为模板，将链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补键形成一条与模板链互补的的DNA链链作用结果作用结果将将DNA双链上的双链上的两个缺口同时连接两个缺口同时连接起来起来合成新的合成新的DNA分子分子名
14、名 称称作作 用用应用应用DNA连接酶连接酶限制性核酸内限制性核酸内切酶切酶DNA聚合酶聚合酶RNA聚合酶聚合酶解旋酶解旋酶逆转录酶逆转录酶连接两个连接两个DNADNA片段片段切割某种特定的脱氧切割某种特定的脱氧核苷酸序列核苷酸序列在脱氧核苷酸链上添在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧核苷酸加单个脱氧核苷酸在核苷酸链上添加单在核苷酸链上添加单个核苷酸个核苷酸使碱基间氢键断裂形使碱基间氢键断裂形成单脱氧核苷酸链成单脱氧核苷酸链以以RNARNA为模板合成为模板合成DNADNA基因工程基因工程DNADNA复制复制转录转录DNADNA复制复制及转录及转录逆转录、逆转录、基因工程基因工程迄今为止，所发现的迄今为
15、止，所发现的DNA连接酶都不具有连连接酶都不具有连接单链接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。的酶。DNA连接酶有连接单链连接酶有连接单链DNA的本领吗？的本领吗？使用限制性内切酶时，需同时使用解旋酶吗？使用使用限制性内切酶时，需同时使用解旋酶吗？使用DNA连接酶时，需同时使用连接酶时，需同时使用DNA聚合酶吗？聚合酶吗？1。切割。切割DNA时，用限制性内切酶打开磷酸二酯键，此时，用限制性内切酶打开磷酸二酯键，此过程在加热条件下（常用过程在加热条件下（常用37）下进行，（氢键的键能）下进行，（
16、氢键的键能很小）两个切点之间的氢键不用解旋酶便会自动断开很小）两个切点之间的氢键不用解旋酶便会自动断开（其它部位的氢键不会打开，因为其它部位仍有磷酸二（其它部位的氢键不会打开，因为其它部位仍有磷酸二酯键这种相当于连接骨架的键的支持）。这样就获得了酯键这种相当于连接骨架的键的支持）。这样就获得了黏性末端。所以黏性末端。所以不需要解旋酶不需要解旋酶。2。在重组。在重组DNA时，可用时，可用DNA连接酶的连接磷酸二酯连接酶的连接磷酸二酯键，至于氢键，它们会通过碱基互补，自动形成。不键，至于氢键，它们会通过碱基互补，自动形成。不需消耗能量，需消耗能量，不需不需DNA聚合酶聚合酶。1.2.3 1.2.3
17、 基因的运输工具基因的运输工具运载体运载体作用：作用：具备的条件具备的条件种类：种类：将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。能在宿主细胞内复制并稳定地保存能在宿主细胞内复制并稳定地保存具有多个限制酶切点具有多个限制酶切点具有某些标记基因具有某些标记基因质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒、噬菌体和动植物病毒。使用运载使用运载体的目的体的目的用它作为运载用它作为运载工具，将目的基因送到宿工具，将目的基因送到宿主细胞中去。主细胞中去。质粒的特点质粒的特点 （）质粒上会存在某些标记基因，标记基因有（）质粒上会存在某些标记基因，标记基因有什么用途？什么用途？（）要想将某个特定基因与质粒相连，至少需
18、（）要想将某个特定基因与质粒相连，至少需要用几种限制性内切酶和几种要用几种限制性内切酶和几种DNA连接酶处理？连接酶处理？思考思考质粒：是一种质粒：是一种 的、的、，并具有，并具有 能力的能力的 。裸露裸露结构简单结构简单独立于细菌染色体（拟核）之外独立于细菌染色体（拟核）之外自我复制自我复制双链环状双链环状DNA分子分子鉴别和筛选含有目的基因的细胞鉴别和筛选含有目的基因的细胞-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-AGGATCTTAAGAGAGCCATACTTAAGGTATG-TCCTAGAATT CTCTCG
19、GTATGAATTCCATAC-判断判断：下列二个：下列二个DNA分子（片段），哪一个是分子（片段），哪一个是目的基因，哪一个是运载体？目的基因，哪一个是运载体？1、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，、在基因工程中使用的限制性核酸内切酶，其作用是其作用是()A、将目的基因从染色体上切割出来、将目的基因从染色体上切割出来 B、识别并切割特定的、识别并切割特定的DNA核苷酸序列核苷酸序列 C、将目的基因与运载体结合、将目的基因与运载体结合 D、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞B2、基因工程是、基因工程是DNA分子水平的操作，下列有分子水平的操作，下列有关基因工程的叙述中，错误的是关
20、基因工程的叙述中，错误的是 A、限制酶只用于切割获取目的基因、限制酶只用于切割获取目的基因 B、载体与目的基因必须用同一种限制酶处理、载体与目的基因必须用同一种限制酶处理 C、基因工程所用的工具酶是限制酶，、基因工程所用的工具酶是限制酶，DNA连连接酶接酶 D、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需、带有目的基因的载体是否进入受体细胞需检测检测A3、作为基因的运输工具、作为基因的运输工具运载体，必须具备的条运载体，必须具备的条件之一及理由是件之一及理由是()A、能够在宿主细胞中稳定的保存下来并大量复制，、能够在宿主细胞中稳定的保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因以便提供大量的目的基因 B、
21、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达 C、具有某些标记基因，以便目的基因能够与其结合、具有某些标记基因，以便目的基因能够与其结合 D、它的参与能够使目的基因在宿主细胞中复制并稳、它的参与能够使目的基因在宿主细胞中复制并稳定保存定保存D4、不属于质粒被选为基因运载体的理、不属于质粒被选为基因运载体的理由是由是（）A能复制能复制 B.有多个限制酶切点有多个限制酶切点 C具有标记基因具有标记基因 D它是环状它是环状DNAD三、基因操作的基本步骤三、基因操作的基本步骤1 1、获取目的基因、获取目的基因2 2、构建基因表达载体、构建基因表达载体3 3、将目的
22、基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测和鉴定、目的基因的检测和鉴定目前被较广泛提取使用的目的基因有：目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。1.1.目的基因的概念：目的基因的概念：人们需要的特定基因。人们需要的特定基因。（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取:1.1.什么是基因文库？什么是基因文库？种类种类基因组文库：基因组文库：cDNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因含有一种生物的含有一
23、种生物的部分部分基因基因（1）从基因文库中获取目的基因）从基因文库中获取目的基因2.获取目的基因的方法：获取目的基因的方法：基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）第一步：反转录酶以第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互互补的补的DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。杂交分子。第二步：核酸酶使第二步：核酸酶使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链链降解，使之变成单链的降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下合成另一条互补的下合成另一条互补的DNA链，
24、形成双链链，形成双链DNA分子。分子。cDNAcDNA合成过程是：合成过程是：怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？根据基因的有关信息：如基因的核苷酸序列、根据基因的有关信息：如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等。、基因的翻译产物蛋白质等。概念：概念：PCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。条件：条件：_、_、_、_.前提条件：前提条件：_原理：原理：_聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外
25、特定特定DNA片段片段DNA复制复制已知核苷酸序列的基因已知核苷酸序列的基因四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）酶）一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列（2）利用）利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因引物：引物：20个左右碱基、根据个左右碱基、根据已知目的基因的核苷酸序已知目的基因的核苷酸序列合成的短列合成的短DNA单链单链方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：指数指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增5 5/3 3/G
26、GG GT TC C3 3/5 5/A AG GC CC C5 5/3 3/引物引物G GG G变性变性复性复性延伸延伸5 5/3 3/A AG G引物引物第一步：将反应体系（包括双链模板、第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至子等）加热至9095，使双链，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单模板两条链之间的氢键打开，变成单链链DNA，作为互补链聚合反应的模板。，作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至第二步：将反应体系降温至555560 60
27、，使两种引物分别与模板使两种引物分别与模板DNADNA链链33端的互端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。补序列互补配对，这个过程称为复性。第三步：将反应体系升温至第三步：将反应体系升温至7075，在耐高温的在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的提供的3-OH上，使上，使DNA链延伸链延伸,产生一产生一条与模板链互补的条与模板链互补的DNA链。链。PCRPCR技术扩增目的基因的过程：技术扩增目的基因的过程：PCRPCR技术扩增目的基因的过程：技术扩增目的基因的过程：PCR技术扩增过程技术扩增过程a、DNA
28、变性（变性（90-95）：双链）：双链DNA模板模板 在热作用下，在热作用下，断裂，形成断裂，形成_ b、复性（、复性（55-60）：系统温度降低，引物）：系统温度降低，引物 与与DNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c、延伸（、延伸（70-75）：在）：在Taq酶的作用下，酶的作用下，从引物的从引物的5端端3端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补的的_。氢键氢键单链单链DNA双链双链DNA链链l每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍。一倍。30轮循环可获得轮循环可获得-230（1.07109)个个基因片段基因片段DNADNA复制与复
29、制与PCRPCR技术的比较技术的比较项目项目DNA复制复制PCR技术技术场所场所细胞核内细胞核内生物体外生物体外原理原理碱基互补配对碱基互补配对碱基互补配对碱基互补配对酶酶DNA聚合酶、解旋酶聚合酶、解旋酶热稳定热稳定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）酶）条件条件模板、模板、ATP、引物链、常温、引物链、常温模板、模板、ATP、引物链、温、引物链、温度变化（度变化（909555607075)原料原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸特点特点形成的是整个形成的是整个DNA分子，一分子，一个细胞周期只复制一次个细胞周期只复制一次短时间内形成大量目的基因短时间内形成大量目的基因DN
30、A片段片段有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，导入受体植物，没有进行表达载体的构建没有进行表达载体的构建，这种方，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。基因工程。将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？如果这么做，结果会怎样？（二）
31、基因表达载体的构建（二）基因表达载体的构建核心核心质粒质粒DNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNA连接酶连接酶重组重组DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端 目的基因与运载体结合的结果可能有几目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？种情况？基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因保证质粒拷贝数保证质粒拷贝数筛选重组子筛选重组子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区(编码区上游编码区上游)(编码区下游编码区下游)启动子
32、启动子终止子终止子基因基因是是RNA聚合酶的结聚合酶的结合位点，起动并催合位点，起动并催化转录化转录mRNA终止转录终止转录mRNA外显子外显子内含子内含子例。植物学家在培育抗虫棉时，对目的基因作适当例。植物学家在培育抗虫棉时，对目的基因作适当的修饰，使得目的基因在棉花植株的整个生长发育的修饰，使得目的基因在棉花植株的整个生长发育期都表达，以防止害虫侵害，这种对目的基因所作期都表达，以防止害虫侵害，这种对目的基因所作的修饰发生在（的修饰发生在（）A、内含子、内含子 B、外显子、外显子 C、编码区、编码区 D、非编码区、非编码区D基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因工程操作中，只有使用受体生
33、物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达。基因的启动子才比较有利于基因的表达。通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞中无法转录。子，只将编码序列导入受体细胞中无法转录。（三）将目的基因导入受体细胞（三）将目的基因导入受体细胞动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农
34、杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法 感受态细胞吸感受态细胞吸 收收DNADNA分子分子农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌农杆菌：生活在土壤中。能在自然条件下感染双子叶植物生活在土壤中。能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物无感染能力。和裸子植物，而对大多数单子叶植物无感染能力。过程：过程：构建表达载体（重组构建表达载体（重组Ti质粒）质粒）转入农杆菌转入农杆菌导入植物细胞导入植物细胞目的基因插入植物细胞染色目的基因插入植物细胞染色体体DNA中中培养再生成植株培养再生成植株筛选出表现新性状的植株筛选出表现新性状的植株1.1.将目的基因导入植物
35、细胞之将目的基因导入植物细胞之根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？该如何做？显微注射技术显微注射技术2.2.将目的基因导入动物细胞之将目的基因导入动物细胞之感受态细胞感受态细胞3 3、将目的基因导入微生物细胞：、将目的基因导入微生物细胞：(A)(A)常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌大肠杆菌(最广泛最广泛)
36、、枯草、枯草杆菌、土壤农杆菌杆菌、土壤农杆菌(B)(B)导入途径：导入途径：受体细胞受体细胞(细菌细菌)CaClCaCl2 2处理处理细菌细胞壁通透性增加细菌细胞壁通透性增加感受态细胞与感受态细胞与重组质粒混合重组质粒混合感受态细胞吸感受态细胞吸收重组质粒收重组质粒主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞方法原因原因：繁殖快，单细：繁殖快，单细胞，遗传物质少。胞，遗传物质少。（-4）因为大肠杆菌等细菌的细胞壁成分主要是因为大肠杆菌等细菌的细胞壁成分主要是肽聚糖，因此一般要先用肽聚糖，因此一般要先用Ca2 处理，以处理，以增加细菌细胞壁的通透性增加细菌细胞壁的通透性。思考：为
37、什么要用思考：为什么要用Ca2处理细胞？处理细胞？（四）目的基因的检测与鉴定（四）目的基因的检测与鉴定检测检测检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录检测目的基因是否转录出了出了mRNA检测目的基因是否翻检测目的基因是否翻译成蛋白质译成蛋白质DNA分子分子杂交杂交DNA-RNADNA-RNA分子杂交分子杂交抗原抗原抗抗体杂交体杂交 如果显示出杂交带，就表明待测样品含有如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。目的基因或目的基因已经转录。1、检测转基因生物染色体是否插入了目的基因：、检测转基因生物染色体是
38、否插入了目的基因：Southern杂交杂交DNA和和DNA分子之间的杂交分子之间的杂交第一步第一步:将将受体生物受体生物DNA提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂提取出来，经过适当的酶切后，走琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；糖凝胶电泳，将不同大小的片段分开；第二步，将凝胶上的第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步，用标记了放射性同位素的目的第三步，用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针片段作为探针与硝与硝酸纤维素膜上的酸纤维素膜上的DNA进行杂交；进行杂交；第四步，将第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；光底片压在硝酸纤维
39、素膜上，在暗处使底片感光；第五步，将第五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑条带（光底片冲洗，如果在底片上出现黑条带（杂交带杂交带），），则表明受体植物染色体则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。上有目的基因。、检测目的基因是否转录出、检测目的基因是否转录出RNA:Northern杂交杂交DNA和和RNA分子之间的杂交。分子之间的杂交。具体做法与具体做法与Southern杂交相同，只是第一步从杂交相同，只是第一步从受体植物中提取的是受体植物中提取的是mRNA而不是而不是DNA，杂交，杂交带的显现也与带的显现也与Southern杂交相同。杂交相同。、检测目的基因是否翻译成蛋白质：、检测目的基
40、因是否翻译成蛋白质：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特
41、异结合。由抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。Western杂交杂交蛋白质分子（抗原蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交抗体）之间的杂交、进行个体生物学水平鉴定：、进行个体生物学水平鉴定：、抗虫或抗病检测：、抗虫或抗病检测：对抗虫或抗病基因导入植物细胞后是否赋予植物对抗虫或抗病基因导入植物
42、细胞后是否赋予植物相关的抗性所进行的接种实验，以确定是否具有相关的抗性所进行的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。抗性以及抗性的程度。、对基因工程产品与天然产品进行、对基因工程产品与天然产品进行活性比较活性比较 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。是不可能的。
43、大肠杆菌没有内质网和高尔基体怎大肠杆菌没有内质网和高尔基体怎样合成胰岛素样合成胰岛素?在实验室中将人胰岛素基因在实验室中将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因链的人工合成基因分别组合到分别组合到E.coli的不同质粒上，然后再移至菌体的不同质粒上，然后再移至菌体内，着种重组质粒在内，着种重组质粒在E.coli细胞内进行正常的复制细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有和表达，从而使带有A、B链基因的工程菌株分别产链基因的工程菌株分别产生人胰岛素生人胰岛素A、B链，然后链，然后再用人工的方法再用人工的方法，在体外，在体外通过二硫键使这通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。条链连接成有活性的人胰
44、岛素。基本操作如下：基本操作如下：（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNAcDNA）。）。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如
45、果培养杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。1.1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是的内容，正确的组合是C2.（2010浙江高考浙江高考T2）在用基因工程技术）在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是作错
46、误的是A。用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的。用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸核酸B。用。用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体和载体 C。将重组。将重组DNA分子导入烟草原生质体分子导入烟草原生质体D。用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞。用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞A3.在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是得该基因的最佳方法是A 用用mRNA为模板逆转录合成为模板逆转录合成DNA B以以4种脱氧核苷酸为原料人工合成种脱氧核苷酸为原料人工合成C将供体将供体DNA片段转入受体细胞中
47、，再进一片段转入受体细胞中，再进一步筛选步筛选D由蛋白质的氨基酸序列推测由蛋白质的氨基酸序列推测mRNAB 现在只知道序列信息。现在只知道序列信息。A和和C都必须有真实的材料都必须有真实的材料才行，比如才行，比如mRNA或者或者DNA片段。片段。D已知已知DNA碱基序碱基序列了，推测列了，推测mRNA根本没有意义。根本没有意义。B可以在已知序列可以在已知序列信息的情况下，合成想要的信息的情况下，合成想要的DNA片段。但是一个限制片段。但是一个限制条件就是条件就是DNA必须不能太长。必须不能太长。4.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基
48、因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是棉。下列叙述不正确的是A基因中的启动子、终止子等调控序列对于抗虫基基因中的启动子、终止子等调控序列对于抗虫基因在棉花细胞中的表达是不可缺少因在棉花细胞中的表达是不可缺少B重组重组DNA分子中增加一个碱基对，不一定导致毒分子中增加一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失蛋白的毒性丧失C抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物，抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘作物，从而造成基因污染从而造成基因污染D转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性
49、来确定的抗生素抗性来确定的D5.为了防止转基因作物的目的基因，通过花为了防止转基因作物的目的基因，通过花粉转移到自然界中其他植物体内，科学家设粉转移到自然界中其他植物体内，科学家设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中，其原因是组中，其原因是A叶绿体基因组不会进入到生殖细胞中叶绿体基因组不会进入到生殖细胞中 B植物杂交的后代不会出现一定的性状分植物杂交的后代不会出现一定的性状分离比离比C转基因植物中的质基因与其他植物间不转基因植物中的质基因与其他植物间不能通过花粉发生基因交流能通过花粉发生基因交流D转基因植物与其他植物间不能通过花粉转基因植物与其他植物
50、间不能通过花粉发生基因交流发生基因交流C6.下列关于基因工程的叙述，正确的是下列关于基因工程的叙述，正确的是(双选双选)()A.目的基因和受体细胞均可来自于动、植物或微生目的基因和受体细胞均可来自于动、植物或微生物物B.限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、RNA聚合酶、聚合酶、DNA连接酶是连接酶是常用的工具酶常用的工具酶C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性生物活性D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞的细胞和促进目的基因的表达和促进目的基因的表达CA(08山东山东)35为扩大可耕地面积，增加
