1、肿瘤生物治疗最新进展肿瘤生物治疗最新进展及产业化开发及产业化开发广州蓝星生物科技开发有限公司 王虹第1页，共72页。增强机体抗肿瘤免疫；诱导肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤血管的形成；提高宿主对肿瘤常规治疗的耐受力或加速损伤的恢复。肿瘤生物治疗主要策略体现在以下几方面肿瘤生物治疗主要策略体现在以下几方面：第2页，共72页。以单抗介导的靶向性抗肿瘤药物正成为肿瘤生物治疗产业化开发的热点。1997年美国上市的利妥昔单抗（rituximab）为重组嵌合抗CD20单克隆抗体，用于治疗淋巴瘤，标志着单抗已进入临床应用阶段。第3页，共72页。第4页，共72页。第5页，共72页。ChimericNon-Hodgkin
2、s lymphoma Genentech November 1997 ChimericOrgan rejection prophylaxis NovartisMay 1998ChimericR h e u m a t o i d arthritis,Crohns diseaseohnson&JohnsonAugust 1998CDR-graftedOrgan rejection prophylaxisRocheDecember 1997CDR-graftedRespiratory syncytial virus MedimmuneJune 1998CDR-graftedMetastatic b
3、reast cancerGenentechSeptember 1998CDR-graftedMetastatic breast cancerGenentechSeptember 1998CDR-graftedAcute myeloid leukemiaAmerican Home ProductsMay 2000第6页，共72页。MurineRadiolabeledNon-Hodgkins Lymphoma IDEC Pharmaceuticals and Schering AGMarch 2002Phage DisplayRheumatoid arthritisAbbott Laborator
4、iesDecember 2002CDR-graftedModerate to severe persistent asthmaGenentech and NovartisJune 2003MurineRadiolabeledCD20 positive,follicular,Non-Hodgkins Lymphoma Corixa and GlaxoSmithKlineJune 2003CDR-graftedChronic moderate-to-severe psoriasisGenentech and XomaOctober 2003ChimericColorectal cancerImcl
5、one and Bristol-Myers SquibbFebruary 2004CDR-grafted GenentechFebruary 2004第7页，共72页。2003年治疗用单抗的销售总额已超过52亿美元。2006年预计5060个治疗性单抗上市。2010年预计单抗销售额200亿美元。美国已占全球单抗市场90%一支独秀。完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段。第8页，共72页。抗单抗药物两大类抗单抗药物两大类 抗肿瘤单抗拮抗血管生成单抗Avastin（2004年）抗肿瘤单抗偶联物抗生素与单抗偶联Mylolarg（2001年）性单抗Zevalin（2002年）第9页，共72页。内皮因子（E
6、ndoglin）：膜结合性糖蛋白；分子量180KD；肿瘤组织边缘血管，尤其是新生血管内皮细胞高表达。近年来单抗药物研究具有以下特点：近年来单抗药物研究具有以下特点：第一、寻找新的分子靶点第一、寻找新的分子靶点第10页，共72页。内皮因子Endoglin（又称CD105）作为生成血管内皮细胞特异标记物，正成为抑制肿瘤血管生成、治疗肿瘤的重要靶分子；动物实验表明：抗CD105单抗与免疫毒素连接，可使肿瘤完全消失，现已进入临床试验阶段。多种内皮细胞生长因子的单抗也显示了较好的实验效果，如人抗血管内皮生长因子（VEGF）现已进入了人体临床试验。第11页，共72页。目前人源化单抗的产业化技术已较为成熟。
7、转基因小鼠产生人源化单抗（1997年）；核糖体展示技术（1999年）;噬菌体表达系统；第二、抗体的人源化第二、抗体的人源化第12页，共72页。灭活小鼠Ig基因；克隆并完整转入全部或大部分人Ig基因座，并在小鼠体内表达；产生单抗具有“鼠糖基化模式”；操作程序复杂。第13页，共72页。核糖体展示核糖体展示(ribosome display)核糖体展示技术的核心是利用体外核糖体表达载体构建 sc Fv抗体库,并于体外转录为 m RNA,体外翻译表达,随后以固相化的抗原分子亲和筛选出核糖体-m RNA-sc Fv复合物中的高亲和力 sc Fv。这种技术在实验中不用任何细胞,是第一个完全在体外筛选有功能
8、蛋白的方法。第14页，共72页。该技术克服了其他一些蛋白质筛选技术(如噬菌体展示)需转化细菌或真核细胞,因效率不高而降低库容,减少抗体多样性的局限,并避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库容下降,同时亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题。由于核糖体展示技术的体外翻译、体外筛选的特点,大大缩短了实验周期,具有省时省力、方便快速的特点。第15页，共72页。v噬菌体抗体库噬菌体抗体库原理：采用RTPCR技术将全套人抗体重链V区基因克隆出来，在噬菌体表面以抗体外壳融合蛋白的形式表达分泌，经筛选后获得特异性抗体。该技术不经过繁杂的杂交瘤途径，即可获得全人源化抗体。从
9、理论上讲该抗体库可筛选出任何一种单抗。第16页，共72页。v噬菌体抗体库噬菌体抗体库 与传统杂交瘤技术相比有极大的优越性，现正取代杂交瘤技术。主要特点：简单易行，采用经典的PCR分子克隆等技术，即可操作；在短期内（数周）可筛选106108个克隆；筛选获得的抗体库抗体可用原核表达系统表达，无需组织培养，极大降低了成本；制备的抗体通常为Fab片段或ScFv抗体，没有Fc段，亲和力有一定影响（某些肿瘤治疗性单抗亲和力太强反而不好），但如果对某些抗体基因进行改构，同样可获得亲和力强的抗体。第17页，共72页。第三、偶联物分子的小型化第三、偶联物分子的小型化 研制小型化单抗药物对提高药物疗效有重要意义，
10、通过酶切方法获得的Fab片断，其分子量相当于完整单抗的1/3，而通过基因工程技术制备的单链单抗ScFv，相当于完整单抗的1/6。例如单抗Fab片段与平阳霉素构成的偶联物有显著抑制肿瘤生长和转移的作用。第18页，共72页。近年发现抗肿瘤抗生素Calicheamicin对肿瘤细胞的杀伤活性比阿霉素强1000倍。Calicheamicin与单抗构成的偶联物对多种肿瘤有良好疗效；2000年美国FDA批准用于治疗免疫髓性白血病的Mylotarg就是单抗与Calicheamicin的偶联物。第四、单抗药物的高效化第四、单抗药物的高效化第19页，共72页。第五、双特异性抗体以激活宿主效应细胞第五、双特异性抗
11、体以激活宿主效应细胞 双特异性抗体的理想目标是当细胞毒性效应细胞接近肿瘤细胞时增强抗体介导的肿瘤杀伤功能，是改善抗体治疗效果的又一发展方向。该抗体的特异性一方面是针对肿瘤细胞，另一方面是针对宿主细胞上的某些受体。理论上，使用双特异性抗体可征募众多效应细胞。第20页，共72页。第六、改变某些氨基酸以增加单抗的亲和力第六、改变某些氨基酸以增加单抗的亲和力 定向诱变可变区的特定氨基酸，可以提高抗体的亲和力，这可通过分子遗传手段结合噬菌体展示文库来实现。先创建一个突变体文库，分离对特定抗原具有最高亲和力的噬菌体。这种方法一般需耗时46个月，抗体的亲和力可提高约50倍左右。当然抗体亲和力太高，抗体易聚体
12、在肿瘤组织外周，反而影响活性。第21页，共72页。第七、抗体导向的酶活化前体药物技术第七、抗体导向的酶活化前体药物技术 前体药物（Prodrug）是指该药物无治疗活性或仅有较低活性，需在体内经过代谢转化为活性型才可显示药物活性；其优点是可降低毒性和延长药物体内的作用时间。在单抗治疗中运用此策略是将单抗与特定的酶进行连接，先注入单抗一酶偶联物，间隔一定时间后再注入前体药物，使其在靶部位活化以杀伤肿瘤细胞。现已有单抗碱性磷酸酶偶联物合并磷酸丝裂霉素，单抗胞嘧啶脱氨酶偶联物合并5Fu；在临床试验中取得了较好效果。第22页，共72页。尽管美国在治疗性单抗的研究方面处于绝对优势；但大多数单克隆抗体药物的
13、靶标没有专利保护或者专利保护已过期。更为重要的是，单抗药物的研发具有自己的特点，即众多公司可以针对同一靶标研究单抗药物，它可以根据同一靶标的不同抗体表位研发具有自主知识产权的药物而又不侵犯别人专利，这一点也会被我国SFDA认证为新药，因此治疗性单抗在我国其有广阔的应用前景。第23页，共72页。v肿瘤治疗性疫苗肿瘤治疗性疫苗 具有良好前景，目前研究主要集中在：对肿瘤免疫原的研究，包括寻找新的肿瘤特异性抗原，以及利用基因工程方法制备或改构某些肿瘤抗原。以达到激活免疫效应细胞。应用细胞因子作为疫苗佐剂可明显增加疫苗的治疗效果，如：GMCSF、CD40L作佐剂，可活化CTL细胞。第24页，共72页。v
14、肿瘤治疗性疫苗肿瘤治疗性疫苗树突状细胞（DC）在肿瘤疫苗诱发机体免疫反应过程中发挥关键性作用。因此用抗原改敏的DC治疗肿瘤被认为最具有发展前景。基因工程亚单位疫苗、抗原表位的选择是新型肿瘤疫苗设计的关键。肿瘤疫苗主要以诱导细胞（Ci）为主；因此T细胞表位预测分析在疫苗设计中显得尤为重要。第25页，共72页。v肿瘤治疗性疫苗肿瘤治疗性疫苗肿瘤的异质性及肿瘤抗原的多样性，使相关抗原的特异性不高，免疫原性不强；用免疫缺陷的裸鼠建立的异体人类肿瘤模型用于肿瘤药物筛选（包括疫苗）。第26页，共72页。vDC疫苗疫苗肿瘤抗原肽或蛋白体外致敏DC 可产生保护性抗肿瘤T细胞介导的免疫，并引起肿瘤消退，如PSM
15、P2肽致敏DC用于37例前列腺癌治疗，30%明显好转。细胞溶解物致敏DC 由于肿瘤抗原不清，采用全血细胞溶解物致敏DC，可以诱发广泛的T细胞反应。此法最大的缺点是：细胞提取物中含有自身抗原，可诱发自身免疫反应。第27页，共72页。vDC疫苗疫苗 DC与肿瘤细胞融合 采用电穿孔法将DC与肿瘤细胞融合，保留了DC的生物学特征，可以诱导T细胞对该肿瘤的细胞毒性作用。目前该方法用于个体化治疗，将肿瘤病人的肿瘤细胞与脐血干细胞来源的DC融合后回输给肿瘤病人体内，具有明显的抗肿瘤效应，临床有效率可达70%以上。第28页，共72页。vDC疫苗疫苗细胞因子基因或肿瘤抗原基因修饰DC 如将IL18、IL12基因
16、转染DC，可明显增加特异性T细胞数量。用肿瘤相关抗原（TAA）基因修饰DC，导致T细胞活化，其诱导的抗肿瘤免疫反应效果优于抗原肽致敏的DC疫苗。第29页，共72页。vDC疫苗疫苗 DC永生化技术 目前DC回输疗法已经试用于临床，并取得了其它方法无可比拟的疗效，在国外正用于各种肿瘤，但作为治疗手段有一重要难题如何大量扩增及保存DC。DC永生化技术:转染癌基因myc基因 转染病毒基因HPV E7基因第30页，共72页。肿瘤治疗性疫苗肿瘤治疗性疫苗上市产品：黑色素疫苗（Corixa公司，加拿大）。临床期：IMCBEC2（Imclone公司），用于肺癌。临床期：HER/Neu基因蛋白疫苗（Corixa
17、公司），用于乳腺癌（2003年6月）；质粒DNA疫苗（Corixa公司），用于肺癌。第31页，共72页。目前肿瘤治疗性疫苗还有诸多问题有待于解决，目前肿瘤治疗性疫苗还有诸多问题有待于解决，主要表现在以下几个方面：主要表现在以下几个方面：第一，众多实体肿瘤缺乏特异性抗原，尽管目前已在实体肿瘤中发现了500多种肿瘤抗原，但只有少数抗原较为特异，且这些抗原免疫原性较弱。在近几年的研究中发现：仅激活CD8+T细胞不足以产生有效的细胞免疫，同时需要CD4+T细胞参与。而目前的疫苗缺乏这种设计。第32页，共72页。第二、疫苗缺乏有效的抗原递呈。现有的疫苗在此环节上存在两个严重问题：一是进入的大部分疫苗与A
18、PC不能充分接触难以实现抗原递呈；二是即使有少量疫苗被APC捕获，也因抗原表达量甚微难以发挥有效的抗原递呈。第33页，共72页。第三、如何打破机体免疫耐受。肿瘤细胞通过下调Fas的表达来逃避Fas介导的细胞凋亡。尽管目前通过采用共刺激分子修饰的疫苗有可能打破机体对肿瘤的免疫耐受，但目前尚缺乏有效的实验数据。第34页，共72页。v新的肿瘤靶基因新的肿瘤靶基因 针对肿瘤相关抗原的靶向治疗（又称分子靶药物）是提高肿瘤治疗效果的重要途径。随着分子生物学的发展，肿瘤新靶基因被不断发现。生存素（Survivin）是近年来新发现的凋亡蛋白抑制因子；阻断生存素的活化（如采用反义核酸技术），可导致肿瘤细胞的凋亡
19、。第35页，共72页。v新的肿瘤靶基因新的肿瘤靶基因 2002年美国科学家在胚胎干细胞、神经干细胞、多种人类肿瘤细胞中发现了一种大量存在于细胞核中的蛋白质（nucleostemin）及其基因，该基因位于人类3号染色体，表达550个氨基酸；目前众多的科学家一致认为该基因亦是某些肿瘤治疗的又一靶基因。第36页，共72页。综上所述，疫苗、细胞因子、肿瘤血管生成抑制剂及单克隆抗体已成为肿瘤治疗的有效方法。它们均涉及到生物医药的重要领域蛋白质表达与纯化技术，这正是生物医药产业化开发的关键所在。我国目前生物技术产业化最大难点。第37页，共72页。v蛋白表达载体蛋白表达载体 原核大肠杆菌表达体系 真核a 酵
20、母 b 哺乳动物细胞CHO细胞 c 昆虫第38页，共72页。大肠杆菌表达是目前最成熟的表达体系。具有操作简单、成本低产量高（表达量10%70%）。缺点：a、大多以包涵体形式出现（尽管设计成分泌型）b、产物缺乏糖基化 c、含有大量内毒素，给纯化带来极大不方便第39页，共72页。酵母是外源基因表达最理想的真核表达体系酵母是外源基因表达最理想的真核表达体系它具有许多优点：遗传背景清楚 具有翻译后修饰加工系统，如糖基化 不产生毒素，不含特异性的病毒 大规模发酵简单，成本低 表达产物分泌到胞外，有利于纯化 表达量可达菌体蛋白10%30%第40页，共72页。v蛋白质表达蛋白质表达蛋白一级结构的改构 （改变
21、或不改变氨基酸）第41页，共72页。增加生物活性或（和）减轻毒性反应增加生物活性或（和）减轻毒性反应 肿瘤的治疗，主要是增加细胞免疫功能。如CEA肿瘤病人体内的CEA是抑制患者细胞免疫功能的蛋白。但如果对CEA的某些氨基酸改构可以明显增加活化T细胞的功能。第42页，共72页。增加生物活性或（和）减轻毒性反应增加生物活性或（和）减轻毒性反应 人TNF突变体较原型TNFN端缺失7个氨基酸第8位脯氨酸 精氨酸第9位脯氨酸 赖氨酸第10位脯氨酸 精氨酸 其生物学活性提高数百倍，毒性减少几十倍。第43页，共72页。生长因子受体（EGFR ）的突变株（EGFRV ）第27外显子中801碱基被去除（胞外区6
22、273位氨基酸缺失），而在融合部位新产生一个甘氨酸。这种缺失融合仅在使肿瘤细胞检测到EGFR 。因此EGFRV 单抗在动物实验中证实仅能结合EGFR 阳性的肿瘤细胞，其特异性较好。第44页，共72页。改变与某些物质的亲和力改变与某些物质的亲和力 1L18是1995年发现的新细胞因子，在结构和功能上与IL12相似。1L18的前体蛋白（Pro-1L-18）为193个氨基酸，24KD。无生物学活性，成熟的1L-18为153个氨基酸，18KD，并以单体形式表现生物学活性，具有抗肿瘤及抗病毒活性。目前的实验表明，1L-18有极强的抗肿瘤作用，并由CD4+T细胞和NK细胞介导的。第45页，共72页。1L1
23、8有两种拮抗剂有两种拮抗剂 1L18受体（1L18R）可溶性1L18结合蛋白（1L18 BP）1L18与1L18受体的结合力要明显低于其它细胞因子与受体的结合力。1L18与1L18R结合蛋白的解离常数（KD）为18.5nmol/L。而其它细胞因子一般为45 nmol/L左右，1L18BP能消除1L18 消杀的生物学活性反应，1L18 BP这1L18 的主要拮抗剂，维持1L18 在体内的活性水平。第46页，共72页。1L18BP 某些肿瘤组织可持续分泌查溶性1L18 BP，从而明显降低血清中1L18 的水平。如果单纯采用1L18 治疗肿瘤病人，1L18 BP含大量中和1L18 而达不到治疗效果。
24、如果将1L18 未点突变（1L18 突变株），而维持或增加1L18 的生物学活性而这种1L18 突变体与1L18 BP的结合力大为降低，即可达到“一石二鸟”的作用。第47页，共72页。增加在体内的半衰期增加在体内的半衰期 黑色素瘤相关的抗原MART1肽表位氨基酸进行置换，该抗原刺激靶CTL活性在3h内失活，而原抗原的半衰期仅22秒。第48页，共72页。单链抗体（单链抗体（SCFV）是抗体可变区的重链和轻链通过连接肽（约20aa左右）相连的融合蛋白。具有：分子量小，可迅速渗透到肿瘤内部或其它靶组织；避免了FC段引起的非特异性细胞毒性及负段原性；制备工艺简单。第49页，共72页。尽管ScFv在肿瘤
25、生物治疗中具有极其广泛的应用前景，但在临床中仍存在几个主要问题：缺乏Fc段，亲和力大多下降 半衰期短，很快从血液清除 稳定性不够第50页，共72页。ScFv基因改构ScFv与人IgG1Fc段连接成融合蛋白，改构后ScFv半衰期延长30倍，生物活性没有下降。在ScFv轻链和重链的可变性适当各加入一个半胱氨酸形成以二硫键固定的Fc段而构成DsFv，证实DsFv结合能力与稳定性均优于ScFv第51页，共72页。蛋白纯化蛋白纯化 不同的治疗目的对不同载体表达蛋白的纯度要求不一样。如肿瘤疫苗第52页，共72页。双水相萃取技术双水相萃取技术 方法：向水相中加入溶入水的高分子大化合物PEG等，可形成密度不同
26、的两相。因两相均含有水，称为双水相。轻相含某种高分子化合物 重相含盐类或一种化合物 体系：PEG/盐（硫酸铵等）；PEG/葡聚糖。第53页，共72页。双水相萃取技术双水相萃取技术从实用角度来讲，细胞碎片分配在下相适宜。核酸等大部分杂质一般在下相，可以同时除去 下相为无机盐，去除成本低 蛋白质位于上相有利保护活性（PEG保护），而下相的高浓度盐会造成蛋白失活。第54页，共72页。第55页，共72页。双水相萃取技术特点双水相萃取技术特点 清除细胞碎片的效率优于一般的离心法和过滤法；该方法关键是把蛋白产物层尽可能分在上层，而细胞碎片分在下层；分离的纯度与色谱层析还有一定的距离。因此该技术用于初步纯化
27、。第56页，共72页。高效疏水色谱（高效疏水色谱（HIC）原理：在高离子强度的盐水溶液淋洗条件下，蛋白质的疏水部分与填料表面的疏水基团相互作用而被吸附。淋洗液的离子强度降低，蛋白质依疏水性特征依次被洗脱。即高盐浓度吸附，低盐浓度洗脱。第57页，共72页。HIC的特征的特征 对基质没有特殊要求，基质表面具有较弱的疏水基团，孔径在25100um 避免使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被分离物质的生物活性。具有“一石四鸟”的作用，尤其是纯化大肠杆菌表达产物时具有除去变性剂（盐酸胍）、使蛋白质折叠（复性）去除杂蛋白，便于变性剂回收。第58页，共72页。HIC：采用高盐时上样、低盐时洗脱。故大多在硫酸
28、铵沉淀或离子交换层析后使用。洗脱条件温和-降低盐浓度调整溶液的pH可调整该蛋白的疏水性，因为蛋白在接近等电点时具有最大的疏水性。第59页，共72页。HIC疏水柱经过再生后，通常可使用2030次；具有高蛋白质的结合容量（10100mgml）；操作简单，自动化程度高；产业化程度极高，目前正广泛用于生物制药。第60页，共72页。高效亲和液相色谱（高效亲和液相色谱（HPAC）1978年，Dhlson首次报道采用HPAC分离LDH同工酶及人血清白蛋白。特点：配体与分离物特异性亲和力分离选择性强，纯化倍数优于其它层析与其它HPLC不同，HPAC不遵循其它色谱具有的理论塔板规律第61页，共72页。HPAC柱
29、子的专用性强。载体为能耐高压的硅酸、有机聚合物目前仅HPAC常常在纯化的最后一步或中间来使用以提高产品纯度，适用于小批量样品分析和制备，目前产业化有一定难度。第62页，共72页。HPAC 亲和柱的制备交联配体到介质上 分两步：第一步活化介质 第二步将配体交联到介质上。第63页，共72页。HPAC配基配基 金属离子（Zn、Ni）染料（三嗪类染料）专一性差、价廉、稳定性好。第64页，共72页。HPAC配基配基 核苷酸配基（ATP）氨基酸配基（组氨碱）植物凝集素能可逆性结合碳水化合物的蛋白质，由于凝集素洗脱条件温合，易于操作，现应用日渐广泛，有较好的产业化趋势。第65页，共72页。凝集素凝集素至少每
30、个分子有两个碳水化合物结合部位，可以用作糖蛋白的亲和配基。每毫升年度可偶联1100mg凝集素，这种活化的介质（溴化氢等）既有商品购买，也可自行活化，可降低成本5060倍；上样时减慢速度有助于凝集素糖蛋白结合；增加柱温到37 有助于结合，降低柱温有助于洗脱。第66页，共72页。凝集素凝集素上样前用高盐洗柱可减少非特异性结合；硼酸盐缓冲液有助于困难的洗脱。因为它能结合某些糖蛋白；在整个过程中应避免使用磷酸盐缓冲液。因为它易于二价离子产生沉淀。第67页，共72页。HPAC配基配基 优点：抗原抗体专一亲和作用，结合力；缺点：洗脱困难，添加变性剂会影响蛋白活性；一种蛋白质一种分离柱，成本高；单抗与载体的
31、偶联有时不太牢固，会在剧烈洗脱时脱落。第68页，共72页。HPAC配基配基由于配基的脱落，对蛋白质的纯度有较大影响，增加了纯化步骤；这种介质的使用寿命只能使用23次（尽管说明书说明可使用510次）；目前在科研上采用的竞争性洗脱，尽管洗脱条件温和，但又一次增加了纯化步骤及成本；目前HPAC用于产品化报道的文献极少，而用于科研的报道极多。第69页，共72页。配基活化化合物及介质配基结合基团 偶联试剂 适合的介质 供应商氨基 溴化氰 琼脂糖 pharmacia 聚丙烯氨基 戊二醛 聚丙烯酰胺-琼脂糖 IBF Sepracor氨基 羟基琥珀酰胺 交联琼脂糖 pharmacia氨基或硫基 甲苯磺酰基或tresyl氯化物 琼脂糖 Pierce Sigma氨基或羧基 碳二亚胺 琼脂糖 Bio-Rad pharmacia 交联琼脂糖 Pierce碳水化合物 酰肼 交联琼脂糖 Bio-Rad Pierce 聚苯乙烯 Sigma第70页，共72页。目前广州蓝星公司生物治疗药物产业化开发目前广州蓝星公司生物治疗药物产业化开发 CEA T细胞表位改构疫苗在原核与真核表达体系的表达高效低毒突变型TNF-在原核系统的表达 类风湿性关节炎融合蛋白在真核系统的表达第71页，共72页。广州蓝星生物科技开发限公司广州蓝星生物科技开发限公司 第72页，共72页。
