1、 其他常用实验室技术其他常用实验室技术u第一节第一节 免疫组化技术免疫组化技术u第二节第二节 真菌检查真菌检查u第三节第三节 变应原检测变应原检测u第四节第四节 滤过紫外线检查滤过紫外线检查u第五节第五节 性病检查性病检查u第六节第六节 蠕形螨、疥螨和阴虱检查蠕形螨、疥螨和阴虱检查u第七节第七节 分子生物学技术分子生物学技术第一节第一节 免疫组化技术免疫组化技术一、适应证一、适应证 大疱性皮肤病、结缔组织病等自身大疱性皮肤病、结缔组织病等自身免疫性皮肤病、某些感染性皮肤病及皮免疫性皮肤病、某些感染性皮肤病及皮肤肿瘤的诊断和鉴别诊断。肤肿瘤的诊断和鉴别诊断。二、方法、原理及结果分析二、方法、原理
2、及结果分析a、直接免疫荧光法（、直接免疫荧光法（DIF）b、间接免疫荧光法（、间接免疫荧光法（IIF）c、免疫酶标法、免疫酶标法ua、直接免疫荧光法（、直接免疫荧光法（DIF）：主要用于）：主要用于检测病变组织或细胞中存在的抗体或补检测病变组织或细胞中存在的抗体或补体。将冷冻切片组织固定于玻片上，滴体。将冷冻切片组织固定于玻片上，滴加荧光素标记的抗人免疫球蛋白或抗体加荧光素标记的抗人免疫球蛋白或抗体C3抗体，经孵育、清洗等处理后，置于抗体，经孵育、清洗等处理后，置于荧光显微镜下观察。若组织中有抗人免荧光显微镜下观察。若组织中有抗人免疫球蛋白或疫球蛋白或C3沉积，则荧光抗体与之结沉积，则荧光抗体
3、与之结合呈现荧光。合呈现荧光。u荧光显示的部位通常为棘细胞膜、皮肤荧光显示的部位通常为棘细胞膜、皮肤基底膜带、血管壁。基底膜带、血管壁。q 棘细胞间：天疱疮皮损可见棘细胞间棘细胞间：天疱疮皮损可见棘细胞间IgG、IgA、IgM或或C3沉积呈网状。沉积呈网状。q 皮肤基底膜带皮肤基底膜带：红斑狼疮：基底膜带红斑狼疮：基底膜带90%以上出现以上出现IgG、C3沉积，呈颗粒状沉积，呈颗粒状 类天疱疮：基底膜带类天疱疮：基底膜带90%以上出现以上出现IgG、C3沉积，呈线状沉积，呈线状 线性线性IgA大疱病：大疱病：IgA线状沉积于基底膜带。线状沉积于基底膜带。q 血管壁：多种皮肤血管炎的皮肤血管壁有
4、血管壁：多种皮肤血管炎的皮肤血管壁有IgM、C3沉积，皮肌炎的病变肌肉间质血管壁有沉积，皮肌炎的病变肌肉间质血管壁有IgM、C3沉积。沉积。b、间接免疫荧光法、间接免疫荧光法u主要用于检测血清中血清中存在的自身主要用于检测血清中血清中存在的自身抗体，并可做抗体滴度测定。底物取自抗体，并可做抗体滴度测定。底物取自正常人皮肤或动物组织，将患者血清滴正常人皮肤或动物组织，将患者血清滴于底物上，再滴加荧光标记的抗人免疫于底物上，再滴加荧光标记的抗人免疫球蛋白抗体等，荧光显微镜下观察。若球蛋白抗体等，荧光显微镜下观察。若血清中存在循环自身抗体，荧光标记的血清中存在循环自身抗体，荧光标记的抗人球蛋白抗体即
5、可与结合到底物上的抗人球蛋白抗体即可与结合到底物上的抗体结合，呈现荧光。抗体结合，呈现荧光。c、免疫酶标法、免疫酶标法u机制与间接免疫荧光法类似，主要标记机制与间接免疫荧光法类似，主要标记细胞的某种特异性成分，可用于肿瘤的细胞的某种特异性成分，可用于肿瘤的鉴别诊断。鉴别诊断。第二节第二节 真菌检查真菌检查u一、采集标本：一、采集标本：1、浅部真菌的标本：毛发、皮屑、浅部真菌的标本：毛发、皮屑、甲屑、痂。甲屑、痂。2、深部真菌的标本：痰、尿液、粪、深部真菌的标本：痰、尿液、粪便、脓液、口腔、或阴道分泌物、血液、便、脓液、口腔、或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织。脑脊液、各种穿刺液和
6、活检组织。u二、检查方法二、检查方法 1、直接涂片：取标本置玻片上，加一滴、直接涂片：取标本置玻片上，加一滴10%KOH溶液，溶液，盖上盖玻片盖上盖玻片酒精灯上微热酒精灯上微热轻压盖玻片使标本透明轻压盖玻片使标本透明低倍镜下检查有无菌丝及孢子低倍镜下检查有无菌丝及孢子高倍镜下证实。此法不高倍镜下证实。此法不能确定菌种。能确定菌种。2、墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的的孢子。、墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的的孢子。取一小滴墨汁与标本混合，盖上盖玻片后直接镜检。取一小滴墨汁与标本混合，盖上盖玻片后直接镜检。3、涂片或组织切片染色：染色可更好地显示真菌形态、涂片或组织切片染色：染色可更
7、好地显示真菌形态和结构。革兰染色适应于白念、孢子丝菌等，瑞氏染色和结构。革兰染色适应于白念、孢子丝菌等，瑞氏染色适应于组织包浆菌，适应于组织包浆菌，PAS染色可将多数真菌染成红色。染色可将多数真菌染成红色。4、培养检查：使真菌检出率高，确定菌种。标本、培养检查：使真菌检出率高，确定菌种。标本接接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上室温或室温或37下培养下培养1-3周周鉴定菌种。鉴定菌种。第三节第三节 变应原检测变应原检测u 一、斑贴试验一、斑贴试验 根据受试物的性质配制适当浓度的浸液、溶液、软膏或原物根据受试物的性质配制适当浓度的浸液、溶液、软膏或原物作为试剂，以适当的方法
8、将其贴于皮肤，一定时间后观察机体作为试剂，以适当的方法将其贴于皮肤，一定时间后观察机体是否对其产生超敏反应。临床上用于检测是否对其产生超敏反应。临床上用于检测IV型超敏反应。型超敏反应。适应症：接触性皮炎、职业性皮炎、手部湿疹、化妆品适应症：接触性皮炎、职业性皮炎、手部湿疹、化妆品 皮炎皮炎方法：受试物方法：受试物制成浸液、溶液、软膏或原物制成浸液、溶液、软膏或原物置于置于4层层1cm1cm 纱布上，用稍大透明玻璃纸覆盖，周边固定。同时纱布上，用稍大透明玻璃纸覆盖，周边固定。同时做多个不同试验物时，用铝制小室斑试器做多个不同试验物时，用铝制小室斑试器贴于背部或前臂屈贴于背部或前臂屈侧，每两个间
9、隔大于侧，每两个间隔大于4cm。并设阴性对照。并设阴性对照。结果及意义：一般在结果及意义：一般在48小时去除斑贴，间隔小时去除斑贴，间隔30分钟观察结果。分钟观察结果。受试部位无反应受试部位无反应 为（为（）皮肤有淡红斑为可疑反应（皮肤有淡红斑为可疑反应（）出现轻度红斑、浸润及少量丘疹为阳性（出现轻度红斑、浸润及少量丘疹为阳性（+）出现水肿性红斑、丘疹或水疱为强阳性（出现水肿性红斑、丘疹或水疱为强阳性（+）显著红肿或浸润聚合性水疱或大疱为超强阳性反应（显著红肿或浸润聚合性水疱或大疱为超强阳性反应（+）临床意义：阳性者说明患者对受试物过敏，但应排除原发性刺激临床意义：阳性者说明患者对受试物过敏，
10、但应排除原发性刺激或假阳性反应；原发刺激反应除去受试物皮肤反应会减弱；真或假阳性反应；原发刺激反应除去受试物皮肤反应会减弱；真阳性反应除去受试物后阳性反应除去受试物后24-48小时反应增强。小时反应增强。u注意事项：不宜在皮肤病急性发作期间进行试注意事项：不宜在皮肤病急性发作期间进行试验，不宜用高浓度的原发性刺激物测试；受试验，不宜用高浓度的原发性刺激物测试；受试前至少前至少1周及受试期间避免使用糖皮质激素或周及受试期间避免使用糖皮质激素或免疫抑制剂，受试前免疫抑制剂，受试前3天或受试期间避免使用天或受试期间避免使用抗组胺药物，以免出现假阴性；受试期间避免抗组胺药物，以免出现假阴性；受试期间避
11、免淋浴淋湿斑贴、避免过度牵拉斑贴部位或过度淋浴淋湿斑贴、避免过度牵拉斑贴部位或过度体力活动；可疑反应可重复试验；在受试期间体力活动；可疑反应可重复试验；在受试期间发生全身过敏反应如荨麻疹、哮喘等或局部炎发生全身过敏反应如荨麻疹、哮喘等或局部炎症反应过重应及时到医院就诊，必要时终止试症反应过重应及时到医院就诊，必要时终止试验。验。u二、点刺试验及划破试验二、点刺试验及划破试验适应症：荨麻疹、特应性皮炎、药疹等适应症：荨麻疹、特应性皮炎、药疹等方法：一般选前臂屈侧为受试部位，局部清洁消方法：一般选前臂屈侧为受试部位，局部清洁消毒毒待待2分钟后按说明书滴试剂及点刺分钟后按说明书滴试剂及点刺5-10分
12、分钟后拭去试液钟后拭去试液20-30分钟读试验结果。分钟读试验结果。结果：与阴性对照（生理盐水）相同为结果：与阴性对照（生理盐水）相同为（-）；）；与阳性对照（组胺）相同为阳性与阳性对照（组胺）相同为阳性（+）；）；较强为（较强为（+）；较弱为（）；较弱为（+）或（）或（+）u三、皮内试验三、皮内试验 目前最常用于药物速发型超敏反应目前最常用于药物速发型超敏反应第四节第四节 滤过紫外线灯检查滤过紫外线灯检查u 滤过紫外线（滤过紫外线（Wood灯）是由高压汞灯作为发射光源，灯）是由高压汞灯作为发射光源，通过由含通过由含9%镍氧化物的钡硅酸滤片发出镍氧化物的钡硅酸滤片发出320-400mm波长波长
13、的光波。的光波。u 方法：暗室内患处置于方法：暗室内患处置于Wood灯下直接照射。灯下直接照射。临床意义：临床意义：铁锈色小孢子菌铁锈色小孢子菌 白癣白癣 羊毛状小孢子菌羊毛状小孢子菌 亮绿色荧光亮绿色荧光 石膏样小孢子菌石膏样小孢子菌 黄癣黄癣 -暗绿色荧光暗绿色荧光 花斑癣花斑癣 马拉色菌马拉色菌 棕色荧光棕色荧光 紫色毛癣菌紫色毛癣菌 无荧光无荧光 断发毛癣菌断发毛癣菌 无荧光无荧光 红红 癣癣 -珊瑚红色荧光珊瑚红色荧光 痤疮丙酸杆菌痤疮丙酸杆菌 -黄白色荧光黄白色荧光 假单胞菌感染假单胞菌感染 绿色荧光绿色荧光第五节第五节 性病检查性病检查u淋球菌检查淋球菌检查u衣原体检查衣原体检查
14、u支原体检查支原体检查u梅毒螺旋体检查梅毒螺旋体检查u杜克雷嗜血杆菌检查杜克雷嗜血杆菌检查u醋酸白试验醋酸白试验u毛滴虫检查毛滴虫检查淋球菌检查淋球菌检查适应症适应症 直接涂片直接涂片淋球菌感染的急性期检查淋球菌感染的急性期检查 分离培养分离培养慢性淋病与无症状感染者慢性淋病与无症状感染者方法方法 1.标本采集：男性用含无菌生理盐水的藻酸钙棉拭子，标本采集：男性用含无菌生理盐水的藻酸钙棉拭子，伸入尿道伸入尿道2cm-4cm，轻轻转动取出分泌物；女性先用无，轻轻转动取出分泌物；女性先用无菌的脱脂棉擦去阴道内粘液，用无菌的藻酸钙脱脂棉拭菌的脱脂棉擦去阴道内粘液，用无菌的藻酸钙脱脂棉拭子插入宫颈内子
15、插入宫颈内1cm-2cm处旋转取出分泌物；患结膜炎的处旋转取出分泌物；患结膜炎的新生儿取结膜分泌物；前列腺炎患者经按摩后取前列腺新生儿取结膜分泌物；前列腺炎患者经按摩后取前列腺液。液。2.直接涂片：加热固定后革兰氏染色直接涂片：加热固定后革兰氏染色油镜下观察。油镜下观察。3.细胞培养：标本立即接种于血琼脂或巧克力琼脂培养细胞培养：标本立即接种于血琼脂或巧克力琼脂培养基。置于基。置于5-10%的的CO2 孵箱，相对湿度孵箱，相对湿度80%以上，以上，35-37，24-48h培养后，挑可疑菌落后涂片镜检。也可用培养后，挑可疑菌落后涂片镜检。也可用氧化酶试验或糖发酵试验进一步证实。氧化酶试验或糖发酵
16、试验进一步证实。结果结果 涂片：镜检见大量多核细胞，细胞内外可找到成双排列，涂片：镜检见大量多核细胞，细胞内外可找到成双排列，呈肾形的革兰氏阴性双球菌。呈肾形的革兰氏阴性双球菌。培养：平皿上见圆形、稍凸、湿润、光滑、透明到灰白培养：平皿上见圆形、稍凸、湿润、光滑、透明到灰白色菌落，直径色菌落，直径0.5-1.0mm。临床意义临床意义 直接涂片阳性可初步诊断，阴性不能排除诊断，培养直接涂片阳性可初步诊断，阴性不能排除诊断，培养 阳性可确诊。阳性可确诊。注意事项注意事项取材时拭子伸入尿道口和宫颈口的深度要足取材时拭子伸入尿道口和宫颈口的深度要足够；男性患者最好在清晨首次排尿前或排尿后数小时采够；男
17、性患者最好在清晨首次排尿前或排尿后数小时采集标本；涂片时动作要轻柔，防止细胞破裂变形，涂片集标本；涂片时动作要轻柔，防止细胞破裂变形，涂片厚度、固定及革兰染色时间要合适。厚度、固定及革兰染色时间要合适。淋球菌直接涂片镜检淋球菌直接涂片镜检衣原体检查衣原体检查1、细胞培养法、细胞培养法 将每份标本接种于将每份标本接种于3个培养瓶中，置个培养瓶中，置37培养培养3-4日，日，取出盖玻片，经吉姆萨染色后镜检，查包涵体。取出盖玻片，经吉姆萨染色后镜检，查包涵体。2、衣原体抗原检测法、衣原体抗原检测法 用商品试剂盒检测用商品试剂盒检测3、免疫荧光法、免疫荧光法 采集标本同淋球菌，吉姆萨染色采集标本同淋球
18、菌，吉姆萨染色1小时，再用小时，再用95%乙醇乙醇淋洗涂片，干燥。油镜下阳性标本可在上皮细胞质内找淋洗涂片，干燥。油镜下阳性标本可在上皮细胞质内找 到到1个个-3个或更多个呈兰色、深兰色或暗紫色包涵体。个或更多个呈兰色、深兰色或暗紫色包涵体。支原体检查支原体检查v 采集标本同淋球菌检查。也可用采集标本同淋球菌检查。也可用10ml中段尿离中段尿离心，取心，取 沉渣接种于液体培养基上，置沉渣接种于液体培养基上，置5-10环境中，环境中，37恒温箱内培养恒温箱内培养24-72小时，观察颜小时，观察颜色变化，如由黄色变为粉红色，可能有解脲支色变化，如由黄色变为粉红色，可能有解脲支原体生长。取原体生长。
19、取0.2ml培养物接种到固体培养基上，培养物接种到固体培养基上，培养培养48小时，有典型小时，有典型“油煎蛋油煎蛋”状菌落中患者状菌落中患者为阳性，可诊断支原体感染。为阳性，可诊断支原体感染。梅毒螺旋体检查梅毒螺旋体检查（一）梅毒螺旋体直接检查（一）梅毒螺旋体直接检查 方法方法 取病灶组织渗透液、淋巴结穿刺液或组织取病灶组织渗透液、淋巴结穿刺液或组织研磨液用暗视野显微镜检查，也可用镀银染色研磨液用暗视野显微镜检查，也可用镀银染色(棕黑色棕黑色)、吉姆萨染色、吉姆萨染色(桃红色桃红色)或墨汁负染色后或墨汁负染色后用普通光学显微镜检查，或用直接免疫荧光用普通光学显微镜检查，或用直接免疫荧光（绿色荧
20、光）技术检查。（绿色荧光）技术检查。（二）（二）非梅毒螺旋体抗原血清试验非梅毒螺旋体抗原血清试验 快速血浆反应素环状卡片试验（快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）1、卡片定性试验：、卡片定性试验：取取50ul待检血清加入卡片的圆圈待检血清加入卡片的圆圈内，涂均匀。用专用滴管加入摇匀的抗原内，涂均匀。用专用滴管加入摇匀的抗原1滴，旋转滴，旋转8分分钟后观察结果。钟后观察结果。结果阳性：卡片圆圈中出现黑色凝聚颗粒和絮片。结果阳性：卡片圆圈中出现黑色凝聚颗粒和絮片。结果阴性：无凝聚块，仅见均匀亮灰色。结果阴性：无凝聚块，仅见均匀亮灰色。2、卡片定量试验：、卡片定量试验：把待检血清用等量盐水作六个稀把
21、待检血清用等量盐水作六个稀释度，即释度，即1:1；1:2；1:4；1:8；1:16；1:32，每个稀释度，每个稀释度取取50ul血清加入卡片圆圈中。血清加入卡片圆圈中。（三）梅毒螺旋体颗粒凝集试验（三）梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）阳性结果可明确诊断阳性结果可明确诊断梅毒螺旋体检查临床意义梅毒螺旋体检查临床意义 RPR为筛选试验为筛选试验,其敏感性高而特异性低其敏感性高而特异性低,可出现假阳性或假阴性。可出现假阳性或假阴性。假阴性结果常见于：一期梅毒硬下疳出现后假阴性结果常见于：一期梅毒硬下疳出现后2-3周内；周内；感染梅毒立即治疗；感染梅毒立即治疗；晚期梅毒；晚期梅毒；二期梅毒的二期梅毒
22、的“前带现象前带现象”。假阳性结果常见于：某些结缔组织病；自身免疫性假阳性结果常见于：某些结缔组织病；自身免疫性 疾病患者；海洛因成瘾者；少疾病患者；海洛因成瘾者；少 数孕妇及老人等。数孕妇及老人等。TPPA试验，阳性结果可明确诊断。试验，阳性结果可明确诊断。杜克雷嗜血杆菌检查杜克雷嗜血杆菌检查1、直接涂片、直接涂片 从淋巴结潜行穿刺取材，一次推涂成片，从淋巴结潜行穿刺取材，一次推涂成片，如见到呈鱼群状排列的细菌，即可做出如见到呈鱼群状排列的细菌，即可做出初步诊断。初步诊断。2、细菌培养、细菌培养 用含血清和低浓度万古霉素的选择培养用含血清和低浓度万古霉素的选择培养基培养，基培养，24-48小
23、时后，菌落直径小时后，菌落直径1-2mm，色灰黄、凸起、粗糙并能在培养基上推色灰黄、凸起、粗糙并能在培养基上推动，镜检或生化反应可确诊。动，镜检或生化反应可确诊。醋酸白试验醋酸白试验 人类乳头瘤病毒感染的上皮细胞与人类乳头瘤病毒感染的上皮细胞与正常细胞产生的角蛋白不同，能被冰醋正常细胞产生的角蛋白不同，能被冰醋酸致白，用酸致白，用5的冰醋酸的冰醋酸2-5分钟后观察，分钟后观察，皮损变为白色、周围组织不变色为阳性，皮损变为白色、周围组织不变色为阳性，可诊断为尖锐湿疣。可诊断为尖锐湿疣。毛滴虫检查毛滴虫检查悬滴法悬滴法 加一滴温生理盐水于玻片上，在阴道后穹隆、子宫加一滴温生理盐水于玻片上，在阴道后
24、穹隆、子宫颈或阴道壁上试取分泌物混于温生理盐水中，立即在低颈或阴道壁上试取分泌物混于温生理盐水中，立即在低倍镜下镜检，如有滴虫可见其呈波状移动。（男性可取倍镜下镜检，如有滴虫可见其呈波状移动。（男性可取尿道分泌物、前列腺液或尿沉渣检查）尿道分泌物、前列腺液或尿沉渣检查）涂片染色法涂片染色法 将分泌物涂在玻片上，待自然干燥后用革兰氏染色将分泌物涂在玻片上，待自然干燥后用革兰氏染色或吉姆萨染色法等，镜检可见毛滴虫或吉姆萨染色法等，镜检可见毛滴虫。第六节第六节 蠕形螨、疥螨和阴虱检查蠕形螨、疥螨和阴虱检查一蠕形螨检查一蠕形螨检查挤刮法挤刮法 选取鼻沟、颊部及颧部选取鼻沟、颊部及颧部等皮损区，用刮刀或
25、手挤压，等皮损区，用刮刀或手挤压，将挤出物置于玻片上，滴一将挤出物置于玻片上，滴一滴生理盐水，盖上盖玻片并滴生理盐水，盖上盖玻片并轻轻压平，镜检有无蠕形螨。轻轻压平，镜检有无蠕形螨。透明胶带法透明胶带法 将透明胶带贴于上述部将透明胶带贴于上述部位，数小时或过夜后，取下位，数小时或过夜后，取下胶带复贴于载玻片上，镜检胶带复贴于载玻片上，镜检可见蠕形螨。可见蠕形螨。二疥螨的检查二疥螨的检查 选择指缝或手腕选择指缝或手腕屈侧等未经搔抓的丘屈侧等未经搔抓的丘疱疹、水疱或隧道，疱疹、水疱或隧道，用消毒针头挑出隧道用消毒针头挑出隧道盲端灰白色小点置玻盲端灰白色小点置玻片上，滴一滴生理盐片上，滴一滴生理盐水
26、，加盖玻片，镜检水，加盖玻片，镜检可见疥螨或虫卵。可见疥螨或虫卵。三阴虱的检查三阴虱的检查 用剪刀剪下有阴用剪刀剪下有阴虱或虫卵的阴毛，用虱或虫卵的阴毛，用75%的乙醇或的乙醇或5%-10%的甲醛溶液固定的甲醛溶液固定后放在玻片上，滴一后放在玻片上，滴一滴滴10%KOH，镜检，镜检可见阴虱和虫卵。可见阴虱和虫卵。第七节第七节 分子生物学技术分子生物学技术 分子生物学技术迅速发展，目前最分子生物学技术迅速发展，目前最有前景的是有前景的是PCR技术和基因芯片技术。技术和基因芯片技术。PCR技术是用于体外选择性扩增特技术是用于体外选择性扩增特异性核酸片段的一项技术，是在模板异性核酸片段的一项技术，是在模板DNA、引物、四种脱氧核糖核酸存在的、引物、四种脱氧核糖核酸存在的条件下，体外模拟依赖于条件下，体外模拟依赖于DNA聚合酶的聚合酶的DNA酶促合成，由变形、退火、延伸等酶促合成，由变形、退火、延伸等三个连续步骤反复循环的过程。三个连续步骤反复循环的过程。
