1、微生物学检验微生物学检验国家卫生和计划生育委员会规划教材国家卫生和计划生育委员会规划教材 微生物学检验微生物学检验微生物学检验微生物学检验国家卫生和计划生育委员会规划教材国家卫生和计划生育委员会规划教材 第十四章真菌检验技术返回总目录返回总目录本 章 内 容第一节 真菌形态检验技术 1第二节 真菌培养技术2第三节 真菌的鉴定方法3第四节 真菌药物敏感试验4学习目标及重点学习目标：掌握真菌的检验方法 熟悉真菌标本采集及注意事项；真菌的鉴定程序；真菌药物 敏感试验方法 了解常用抗真菌药物本章重点：临床真菌标本的采集和处理 真菌的形态学检查、培养技术和鉴定试验 真菌药物敏感试验第一节 真菌形态检验技
2、术一、标本的采集和处理 1.标本的采集根据真菌感染部位采集不同的标本取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本深部真菌感染浅部真菌感染标本来源要适宜用药前采集标本严格无菌操作标本量要充足立即送检2.标本采集注意事项第一节 真菌形态检验技术临床标本分离培养直接检查免疫学检查观察菌落生化反应染色镜检直接镜检3.检验程序核酸检测其他鉴定试验形态学检查病理组织标本动物实验镜检PASHE第一节 真菌形态检验技术二、直接镜检 标本处理液：（1）KOH溶液 适于检查致密的难以透明的材料（2）生理盐水 用于观察真菌的出芽现象（3）水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液 透明力较强，只限于不透明的标本
3、镜检（加温）毛发或皮屑等注意真菌与其他混杂物的鉴别标本+标本处理液第一节 真菌形态检验技术三、染色镜检1.革兰染色：各种真菌均为革兰阳性（图1）2.乳酸酚棉蓝染色：染成蓝色（图2）3.墨汁染色：背景染成黑色，菌体不着色（图3）4.荧光染色：荧光显微镜下发出荧光5.糖原染色：多糖成分呈红色，核为蓝色，背景为淡绿色返回章内容返回章内容（图1）（图3）（图2）第一节 真菌形态检验技术第二节 真菌培养技术一、基本条件 1.常用工具 平皿、试管、接种针、接种环、接种钩、培养箱等一、基本条件 2.培养基 真菌营养要求不高，最适pH 4.06.0常用的培养基:培养基名称培养基用途沙氏培养基真菌的常规培养放线
4、菌酮-氯霉素琼脂真菌的常规培养玉米粉吐温-80琼脂观察白假丝酵母菌的厚膜孢子马铃薯葡萄糖琼脂 观察真菌菌落色素，用于鉴别尿素琼脂生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌）心脑浸液葡萄糖血琼脂显色鉴定培养基深部真菌培养真菌的培养与鉴定第二节 真菌培养技术显色鉴定培养基真菌特异性酶的底物（无色）产色基团代谢基质产色基团游离（显色）真菌的酶分解代谢基质原理第二节 真菌培养技术白色念珠菌：热带念珠菌：克柔念珠菌：光滑念珠菌：近平滑念珠菌：蓝绿色蓝灰色、铁蓝色粉红色紫色白色第二节 真菌培养技术二、培养方法仅用于培养生长繁殖较快的真菌观察真菌结构及生长发育过程多用于菌种传代接种与保存试管培养法大培养法小培养
5、法玻璃棒载玻片培养基盖玻片无菌蒸馏水第二节 真菌培养技术三、生长现象 类酵母型菌落丝状菌落观察菌落生长速度、菌落大小、表面形态、性质、颜色、边缘、底部等酵母型菌落返回章内容第二节 真菌培养技术 检测真菌对单糖、多糖、醇类等发酵情况糖（醇）类发酵试验 检测真菌对糖类中的碳源利用能力的试验，主要用于鉴定酵母菌同化碳源试验 检测真菌对氮源利用能力的试验，主要用于鉴定酵母菌同化氮源试验 某些真菌具有明胶酶，可分解明胶蛋白，使其失去凝胶性质而不能凝固明胶液化试验 某些真菌具有尿素酶，可分解尿素尿素分解试验一、常用生化试验第三节 真菌的鉴定方法二、免疫学检查 提取真菌抗原，进行皮内注射或斑贴试验，观察注射
6、或试验部位有无红肿硬结出现皮肤试验 检测真菌的抗原或抗体，例如：胶乳凝集试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术、放射免疫分析等血清学检测第三节 真菌的鉴定方法三、其它鉴定诊断方法 l.厚膜孢子形成试验 接种玉米粉吐温-80琼脂 25孵育13天待测菌每天于显微镜下观察应用：白假丝酵母菌的鉴定方法：结果：白假丝酵母菌在72小时内可观察到丰富的假菌丝，假菌丝顶端见12个厚膜孢子厚膜孢子假菌丝第三节 真菌的鉴定方法 2.芽管形成试验 方法：待测菌+0.51ml血清37水浴23小时镜检应用：白假丝酵母菌的鉴定 三、其它鉴定诊断方法结果：绝大部分白假丝酵母菌可形成典型的放大镜柄状芽管芽管第三节 真菌的鉴定方
7、法三、其它鉴定诊断方法 3.动物接种4.病理组织检查5.核酸检测6.真菌毒素的检测用于分离病原性真菌、确定真菌的致病性、研究抗真菌药物用于深部真菌感染的诊断用于真菌的分型鉴定有ELISA、生物学方法、薄层层析法、高效液相色谱法等多种方法7.G试验用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断返回章内容返回章内容第三节 真菌的鉴定方法第四节 真菌药物敏感试验 指导临床用药 监控耐药菌株的发生和耐药性变化 预期研究新药的潜在疗效药敏试验目的一、临床常用抗真菌药物 多烯类：如两性霉素B、制霉菌素等 吡咯类：如酮康唑、伊曲康唑等 其他：如氟胞嘧啶据化学结构分类 作用于真菌细胞膜：如两性霉素B等 作用于真菌
8、细胞壁：如尼可霉素Z等 干扰真菌DNA合成：如5-氟胞嘧啶等 其他：如大蒜新素及冰醋酸等据作用机制分类第四节 真菌药物敏感试验二、酵母菌药敏试验方法微量稀释法 1试验前准备RPMI 1640培养基（含L-谷氨酰胺、酚红，不含碳酸氢钠）培养基以培养基依次作10倍稀释，浓度范围：原液10倍于试验终浓度药液稀释配成最高试验浓度的10倍（水溶性药物）或100倍（脂溶性药物）药物原液配制用培养基稀释成11035103 CFU/ml待检菌液制备第四节 真菌药物敏感试验2方法35孵育48h（假丝酵母菌）或72h（新型隐球菌），观察结果各孔接种0.1ml工作浓度的菌液将药液加至无菌96孔微量板稀释药物第四节
9、真菌药物敏感试验3结果判断 4.质量控制 采用标准菌株作为每次测定质控菌株，其MIC应落在预期值范围内 通常指完全抑制待测菌生长（孔内液体完全透明）的最低药物浓度 吡咯类和氟胞嘧啶：与对照孔相比50%生长被抑制的最低药物浓度MIC第四节 真菌药物敏感试验二、酵母菌药敏试验方法纸片扩散法 1试验前准备培养基商品化含药物纸片药物纸片用无菌生理盐水调整至0.5麦氏单位待检菌液制备含葡萄糖和亚甲蓝的M-H琼脂第四节 真菌药物敏感试验 二、酵母菌药敏试验方法纸片扩散法 2方法用无菌棉签蘸取菌液 35孵育1824小时若生长不良可延长至48小时贴上药物纸片 均匀涂布接种M-H琼脂药物纸片接种菌液第四节 真菌药物敏感试验 4.质量控制标准质控菌株的抑菌环直径必须在质控允许范围二、酵母菌药敏试验 方法纸片扩散法 读取80%抑制生长时的抑菌环直径，环内的微小菌落（20%）可忽略不计。据抑菌环直径判断结果3.结果判断返回章内容返回章内容第四节 真菌药物敏感试验
