1、第五章第五章 微生物发酵及工艺控制微生物发酵及工艺控制 第一节 基本概念 第二节 发酵的基本原理 第三节 发酵过程及其工艺控制 第四节 问题分析及处理手段 第五节 发酵过程参数的检测 第六节 发酵过程中的新技术第1页，共60页。学习目标学习目标 了解基本概念、各种发酵方法、发酵基本过程、发酵过程中的新技术、过程参数检测及其自动控制；理解动力学方程，能够运用动力学方程，特别是分批发酵动力学方程进行计算分析；熟练分析发酵过程中的各种影响因素及各有关问题，掌握发酵工艺控制方法及生产中出现的各种问题的处理手段。第2页，共60页。第一节 基本概念 菌体量菌体量 一般指微生物菌体干重量。生长期生长期 指微
2、生物接种后，经短暂迟滞期后，至某种必需营养消耗造成生长限制这一时期。这一时期微生物快速生长，菌体浓度迅速增加。生产期生产期 微生物开始积累代谢产物的时期。二次或隐性生长二次或隐性生长 由于细胞的自溶作用，一些新的营养物质，诸如细胞内的一些糖类蛋白质等被释放出来，又作为细胞营养物质，从而使活细胞在稳定期又缓慢地生长，通常称二次或隐性生长。第3页，共60页。生长相关型（偶联型）生长相关型（偶联型）它的特点是菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰，即表现出产物形成直接与碳源利用有关。这一型中又分为两种情况，即菌体生长型和代谢产物型。其它类型其它类型:菌体生长型、代谢产物型、生长不相关
3、型、生长菌体生长型、代谢产物型、生长不相关型、生长部分相关型。部分相关型。临界比生长速率临界比生长速率 在发酵过程中，不断有菌体细胞的衰老和死亡，也不断有生物合成酶系的蜕变与失活。为了使死亡的细胞和失活的酶系不断得到更新，就必须保持一定的菌体生长速率。满足这种更新需要，从而确保产物持续合成（即保持比生产率稳定）的最低比生长速率称为临界比生长速率，它因菌体细胞的寿命和酶系的稳定性而异。第4页，共60页。第二节 发酵的基本原理 一、发酵方法一、发酵方法 根据发酵条件要求不同，微生物发酵过程可分为好氧发酵和厌氧发酵。好氧发酵有液体表面培养发酵、多孔或颗粒固体培养基表面上发酵和通氧深层发酵几种方法。厌
4、氧发酵采用不通氧的深层发酵。深层发酵反应在一定径高比的圆柱形发酵罐内完成。就其操作方式和工艺流程可分为分批式发酵分批式发酵、流加流加式发酵、半连续发酵、灌流式发酵及连续发酵式发酵、半连续发酵、灌流式发酵及连续发酵等几种方法。第5页，共60页。分批式（分批式（Batch fermentation）发酵）发酵又称间歇式(Intermittent fermentation)发酵或不连续式(Discontinuous fermentation)发酵，也称原位发酵，是把培养液一次性装入发酵罐，灭菌消毒后接入一定量的种子液，在最佳条件下进行发酵培养。经过一段时间完成菌体的生长和产物的合成积累后，将全部培养
5、物取出，结束发酵培养。然后清洗发酵罐，装料、灭菌后再进行下一轮分批操作。第6页，共60页。流加式发酵流加式发酵又称单一补料分批发酵（Fed-batch fermentation），是指在分批式操作的基础上，开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程适当时期，开始连续补加碳源或（和）氮源或（和）其它必须物质，但不取出培养液，直到发酵终点，产率达最大化，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。控制流加式操作的形式有两种，即反馈控制和无反馈控制。第7页，共60页。半连续式发酵半连续式发酵(Semi-continuous fermentation)又称反复分批式或换液式补料发酵。是指菌体和培养液一起装入发酵
6、罐，在菌体生长过程中，每隔一定时间取出部分发酵培养物（行业中称为“带放”），同时补充同等数量的新的培养基，然后继续培养，直到发酵结束，取出全部发酵液。与流加式操作相比，半连续式操作过程发酵罐内得到培养液总体积保持不变，同样可起到解除高浓度基质和产物对发酵的抑制作用。第8页，共60页。灌流式发酵灌流式发酵（Perfusion fermentation）是指菌体与培养液一起装入发酵罐进行培养，在培养过程中一方面不断补充新培养基，同时取出部分条件培养液，但菌体仍然滞留在发酵罐内。灌流式操作，能及时除去有害的代谢产物，并补充营养物质，满足了菌体进一步生长的需求。通过调节灌流速度，可把菌体发酵培养过程控
7、制在稳定的、低废物水平状态下。第9页，共60页。连续式发酵连续式发酵（continuous fermentation）是指菌体与培养液一起装入发酵罐，在菌体培养过程中，不断补充新培养基，同时取出包括培养液和菌体在内的发酵液，发酵体积和菌体浓度等不变，使菌体处于恒定状态的发酵条件，促进了菌体的生长和产物的积累。连续操作保持反应体积不变，发酵罐内物系的组成将不随时间而变。连续发酵使用的反应器可以是搅拌罐式反应器，也可以是管式反应器。连续发酵的控制方式有两种：一种为恒浊器（turbidostat）法，即利用浊度来检测细胞生长状况，通过自控仪表调节输入料液流量，以控制培养液中菌体浓度达到恒定值；另一为
8、恒化器（chemostat）法，它与前者相似之处是维持一定的体积，不同之处是菌体的密度不是直接控制的，而是通过恒定输入的养料中某一种生长限制基质的浓度来控制。第10页，共60页。二、发酵动力学 发酵动力学研究内容主要包括：细胞生长和死亡动力学；基质消耗动力学；氧消耗动力学；CO2生成动力学；产物合成和降解动力学；代谢热生成动力学。菌体生长速率 在液体培养基中微生物群体生长，其生长速率通常用单位体积来表，指单位体积、单位时间里生长的菌体量；在固体培养基表面上的微生物群体生长，其生长速率以单位表面积来表示，指单位时间、单位表面积上生长的菌体量。第11页，共60页。比生长速率是菌体浓度除菌体的生长速
9、率，或菌体浓度除菌体的繁殖速率。在平衡条件下，比生长速率第12页，共60页。基质的消耗速率 指单位时间、单位体积发酵液中消耗的基质量，可表示为：基质的消耗速率常以单位体积发酵液内干菌体质量表示，称基质的比消耗速率，以Qs表示第13页，共60页。ms以基质消耗表示的维持代谢系数（维持因数），维持（M）是指活细胞群体在没有实质性的生长（即生长和死亡处于动态平衡状态）和没有胞外代谢产物合成情况下的生命活动。所需能量由细胞物质的氧化或降解产生。这种用于“维持”的物质代谢称维持代谢，叫做内源代谢（对好氧发酵称“呼吸”），代谢释放能叫维持能。第14页，共60页。代谢产物的生成速率指单位体积、单位时间内产物
10、的生成量，记为up。如果产物生成速率以单位体积发酵液内干菌体质量为基准时，称产物的比生成速率，记为QP。当以产物CO2记时，产物的比生成速率常表示为 。好氧微生物发酵反应中生成CO2量相对于氧的消耗，称呼吸商（RQ）第15页，共60页。微生物发酵动力学微生物发酵动力学 微生物分批培养动力学方程 Monod方程 在特定温度、pH值、营养物类型、营养物浓度等条件下，微生物细胞的比生长速率与限制性营养物的浓度之间存在如下关系：KS限制性营养物质的饱和常数，g/L。KS的物理意义为当比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性营养物质浓度。它的大小表示了微生物对营养物质吸收亲和力大小。KS越大，表示微生物
11、对营养物质的吸收亲和力越小；反之就越大。第16页，共60页。分批培养中基质的消耗速率 us分批培养中产物的形成速率up 产物形成与细胞生长部分相关（混合型）产物形成与细胞生长相关（偶联型）产物形成与细胞生长不相关（非生长偶联型）第17页，共60页。第三节 发酵过程及其工艺控制l发酵过程的影响因素发酵过程的影响因素 温度 温度是指发酵罐中所维持的温度。温度影响微生物发酵化学反应速度；温度也会影响发酵液的物理性质，通过影响粘度、溶解氧量、氧的传递速率等间接影响微生物代谢产物合成；温度也会改变产物合成方向；温度对菌的调节机制亦有关系。发酵温度取决于发酵过程中能量变化，一般与内在因素有关。菌体生长繁殖
12、过程中产生的热是内在因素，称为生物热，是不可改变。另外，与外在因素（搅拌热、蒸发热、辐射热及冷却介质移出的热量有关。第18页，共60页。pH值 在发酵过程中，培养基的pH值同温度一样影响各种酶的活性，进而影响产生菌的生长繁殖及产物的合成。pH值对微生物生长影响很明显，pH值不当，将严重影响菌体生长和产物合成。不同微生物最适生长pH值和最适生产pH值不同。发酵过程中pH值的变化是各种酸和碱的综合结果。一方面是培养基中含有酸性成份（或杂质）。糖被菌体吸收利用后，产生有机酸，并分泌至培养液中。一些生理酸性物质（硫酸铵等）被菌体利用后，会促使氢离子浓度增加，pH值下降。另一方面水解酪蛋白和酵母粉等培养
13、基成份，在其利用后会产生NH3，造成培养液碱性。一些生理碱性物质（硝酸钠、氨基酸、尿素、氨水等）被菌体利用后，将释放出游离NH3或生成碱使pH值上升。第19页，共60页。溶氧量 氧是细胞呼吸的底物，氧浓度的变化对细胞影响很大，也反映了设备的性能。溶氧量是指溶于培养液中的氧，常用绝对含量表示，也可用饱和氧浓度的百分数表示。溶解氧对菌体生长影响是直接的，适宜的溶解氧量保证菌体内的正常氧化还原反应。细胞内氧化还原反应乃至物质之间的转化也需要氧的参与。菌体质量及浓度 生产菌种生长的快慢和产物合成的多少在很大程度上取决于菌体的质量及菌体的浓度。在适当比生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系。菌浓
14、愈大，产物的产量就越大。但是菌浓过高，则会产生其它的影响。如营养的物质消耗过快，培养液的营养成分发生明显的改变，有毒物质的积累，就可能改变菌体的代谢途径，特别是对培养液中的溶解氧影响更为显著。为了获得更高的生产率，需要采用摄氧速率与传氧速率相等时的菌体浓度，即临界菌体浓度。第20页，共60页。培养基 培养基的成分对工业发酵生产尤为重要。先进的培养基组成对高产、稳产和经济发酵的过程是关键因素。因为培养基组成不仅影响微生物的生长繁殖过程，也影响产物合成过程。二氧化碳 二氧化碳是微生物在生长繁殖过程中的代谢产物，也是合成某些产物的基质。通常二氧化碳对菌体生长有直接影响。二氧化碳也影响发酵产物的形成。
15、二氧化碳可能使发酵液pH下降，进而影响细胞生长、繁殖及产物合成，二氧化碳可能与其它物质及生长必需的金属离子发生化学反应形成碳酸盐沉淀，或造成氧的过量消耗使溶解下降，从而间接地影响发酵产物的合成。第21页，共60页。加料方式 加料方式有以下三种：一次性加料、一次性投入主料中间补料方式、连续加料。泡沫 发酵培养液中存在一定数量的泡沫是正常的，泡沫的存在可以增加气-液接触的面积，增加氧在发酵液中的传递。但如果培养液中长时间存在大量的泡沫，则会对发酵产生极其不利的影响：降低了发酵罐的装料系数；影响了菌体的生长；增加了染菌的机会；泡沫降低发酵物产量，大量存在时，会从排气管中排出泡沫，引起“逃液”现象。第
16、22页，共60页。压力 罐压是指罐体内的压力，由压力表读出。培养基灭菌和发酵过程都需要检测压力变化，罐压的意义在于罐体内维持正常压力防止外界空气进入造成杂菌污染。因此，必须使发酵系统压力保持高于外界大气压力，罐压影响CO2和O2的溶解度，增加罐压，气体溶解度提高，缩小气泡体积，可避免“逃液”现象。但过高压力影响微生物DNA复制，使DNA含量下降，从而降低生长速度，高压还降低微生物的硫酸盐还原能力。搅拌 搅拌影响气体的传递速度和发酵液混合均匀程度。搅拌可以阻止或减少菌丝结成团块和颗粒，减小菌丝和液体间的扩散阻力，利于溶解氧进入菌体，同时尽快排出细胞代谢产生的废气和废物，有利于细胞的代谢活动。第2
17、3页，共60页。产物浓度 产物浓度是指发酵液中所含目标产物的量。可以用质量表示，也可用标准单位表示，如g/ml和效价单位u/ml等。产物量的高低反映了发酵是否正常，并可判断发酵周期。产物浓度高，设备的生产能力大，便于发酵液的后处理，但过分提高产物浓度可能会使设备生产能力下降（因为要延长发酵时间），也可能造成对菌体代谢抑制或阻遏，还可能发生其它反应而降低最终产品收得率，对后序处理不利。产物浓度过高有时也抑制菌体本身生长，对发酵不利。发酵时间 发酵时间是指菌种接入发酵罐之时起至发酵液从罐内放出为止的时间间隔。发酵时间尽可能短，还要考虑提高产物收得率，降低物耗率，以提高经济效益。过度缩短发酵时间，就
18、会减少产物的产量，另外发酵液中还残存较多量糖、氨基酸、消沫油、无机盐离子等对发酵液过滤和产物提取时的树脂交换有影响，增加溶媒萃取中乳化作用等。第24页，共60页。l发酵过程工艺控制发酵过程工艺控制 温度的控制 工业上发酵温度控制，一般通过自动控制或手动控制调节夹套或蛇管中的换热介质量及温度的方案来实现温度调节。pH值的控制 工业上控制pH值的方法根据菌种特性和培养基性质，选择适当培养基成份和配比，有些成分可在中间补料时补充调节；加入适量缓冲溶剂,以控制培养基pH的变化。常用缓冲溶剂有碳酸钙、磷酸盐等；直接加酸加碱进行控制；其它。如采用多加油、糖的办法,以及适当降低空气流量来调节，以降低pH值；
19、补加酸碱物质(尿素等)；提高通气量加速脂肪酸代谢也可调节，以提高pH；采用中空纤维过滤器进行细胞循环(过滤发酵液,除去酸等)亦可使pH升高。第25页，共60页。溶氧的控制 溶解氧量的调节可通过调节通气量大小及搅拌强度实现（空气流量增大、增加搅拌转速可使供氧量提高，反之下降）。控制发酵液中菌丝浓度也可调节氧的供需情况，通过控制培养基浓度来实现菌丝浓度控制。生产中还可以通过调节罐温、排去二氧化碳、改善发酵液的物理性质、液化培养基、中间加水、使用表面活性剂等方法来控制溶氧浓度。控制补料速率及罐压及空气中氧气含量也可调节溶氧量。菌体质量与浓度控制 工业上控制菌体浓度是通过定期测定发酵液中菌体的浓度，进
20、而采取适当手段控制菌体浓度范围。主要依靠调节培养基的中限制性基质的浓度来控制菌体的比生长速率，进而控制菌体的浓度。还可以利用菌体代谢产生二氧化碳量来控制补料率和稀释率，以控制菌体生长和浓度。控制接种量的大小，也可控制发酵液中的菌体浓度。对于补料分批发酵，可以控制稀释率的大小，来控制菌体的浓度。第26页，共60页。发酵过程培养基浓度控制 发酵过程培养基浓度可采用补料或补加灭菌水来加以控制。补加灭菌水除了可以调节浓度外，还可降低发酵液的粘度。另外，也可采用适量速效和迟效碳源、氨源配比来控制基质浓度，以满足机体生长需要及避免速效营养物的分解代谢阻遏。控制碳源浓度可采用经验方法和动力学方法，在发酵过程
21、中通过补料控制。为了调节发酵过程中菌体生长和防止衰老自溶，通过补加氮源，控制其浓度。主要方法有：补加具有生长代谢调节作用的有机氮源，如酵母粉、玉米浆、尿素、氨水及硫酸铵等。发酵后期，糖利用缓慢，菌体浓度变薄，pH下降，加尿素后改变并提高产量；当pH下降，常用氨水调节；当pH升高时，可用硫酸铵调节。其它无机化合物的控制 采用补加或一次性加入至培养基中，其浓度要经试验进行确定。前体浓度控制采用少量多次或连续流加的方法加入。第27页，共60页。二氧化碳的控制 生产上一般采取调节搅拌速率及通气量的方法控制调节液相中二氧化碳浓度。加料方式的控制 补料操作控制系统分为有反馈控制和无反馈控制两类。压力的控制
22、 不同生物对压力环境的耐受程度不同，一般维持在0.20.5105pa。控制罐压方法一般为调节空气进口阀门或排气出口阀门的开启度，变化进入或排出气体的流量，维持工艺所需的压力。第28页，共60页。发酵时间的控制 放罐时间有的掌握在菌丝开始自溶（一般菌丝自溶前总有些迹象，如氨基氮开始升高，pH上升，菌丝碎片增多，过滤速率降低等）前；有的掌握在部分菌丝自溶后；有的用残留糖/氮作为放罐标准，以使菌体内的残留产品都全部释放出来。生产中如出现异常：如染菌、代谢异常时，应根据不同情况对发酵时间进行进行调整，一般按正常确定时间进行。放罐前的发酵控制 在接近放罐时，补糖、补料或加消沫剂都要慎重考虑残留物质对提炼
23、工序的影响。补糖需根据后期糖的消耗速率，计算到放罐时允许的残糖量来控制。消沫剂（尤其是消沫油）在不必要时可早些停止添加。其它，如通氨水、滴加葡萄糖或调节pH值等也应根据发酵具体情况，尽量早些结束。第29页，共60页。染菌及其防治、处理染菌及其防治、处理1 1染菌分析染菌分析培养液是否污染菌可从三方面进行分析：无菌试验无菌试验、培养液的显微镜检查、培养液生化指标变化情况。无菌试验是判断染菌的主要依据。无菌试验 显微镜检查法显微镜检查法（镜检法）用革兰染色法对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征进行区别、判断是否染菌。如发现有与生产菌形态特征不一样的其它微
24、生物的存在，就可判断为发生了染菌。第四节 问题分析及处理手段第30页，共60页。肉汤培养法肉汤培养法 用组成为0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、0.5%氯化钠、0.8%蛋白胨、0.4%酚红溶液（pH=7.2）的葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37、27进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断是否有杂菌。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体的检查。平板划线培养平板划线培养 将待检样品在无菌平板上划线，分别于37、27进行培养，一般24小时后即可进行镜检观察，检查是否染菌。为了提高平板培养的灵敏度，也可以将需要检查的样品
25、先置于37条件下培养6小时，使杂菌迅速增殖后再划线培养。双碟培养法双碟培养法 种子罐和发酵罐培养基灭菌后就取样，称为消后取样，以后通常种子罐及发酵罐每隔8小时取样一次（？）（必要时种子罐每隔4小时取样一次），种子罐取样时在装有9mL肉汤的试管内加入25mL试样，然后在无菌室内通过无菌操作在事先铺好琼脂培养基的双碟内划线。剩下的肉汤培养物，在37条件下培养6小时后复划一次，即另划一双碟以作比较。发酵取样时，用空白试管取样515mL左右，于在37条件下培养6小时后划碟，双碟放置在37条件下培养，24小时内的双碟，每隔23小时在灯光下检查一次，以防生长缓慢的杂菌漏检。第31页，共60页。2 2染菌判
26、断染菌判断 （1）判断依据 以肉汤和双碟培养的反应为主，镜检为辅。每8(4、2)小时一次的无菌试验，至少用2只酚红肉汤及1只双碟同时取样。试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。（2）染菌率的统计 染菌罐批次应包括染菌重消后的重复染菌批（次）在内。%100%次总投罐批次染菌批罐发酵染菌率第32页，共60页。3 3染菌情况分析染菌情况分析（1）染菌因素染菌因素公用系统公用系统a.空气系统空气系统 水冷式空气冷却器穿孔，导致空气系统进水；空气夹套加热器穿孔，导致蒸汽进入空气系统，使空气的相对湿度空气的相对湿度在60%以上，导致空气除菌
27、过滤器失效。b.蒸汽系统蒸汽系统 不饱和蒸汽(过热蒸汽过热蒸汽和低温过湿蒸汽低温过湿蒸汽)都将影响灭菌效果，尤其是过热的干蒸汽，无法保证空罐灭菌的效果。c.种子系统种子系统 设置接种站，将所有种子罐的接种管路都引至接种站。接种时，无论哪个种子罐的种子都将通过接种站和接种总管移入发酵罐。.这样的配置易产生消毒死角，单罐染菌易造成整个系统污染，使种子罐和发酵罐的大规模染菌机率大为增加。第33页，共60页。d.补料系统补料系统 总补料罐染菌造成整个补料系统和被补料发酵罐的染菌。e.培养基连消系统培养基连消系统 连续灭菌时管线较长，连消塔、维持罐和管路内壁易发生结垢现象。维持罐内的存料由于长期与高温蒸
28、汽接触，易变性结块，其中蛋白质变性会形成海绵状物质，糖类变性会产生炭化物，这两种物质都具有很高的比表面积，容易“藏污纳垢”，形成死角，导致培养基灭菌不彻底。连消塔混料不匀也会导致生料进入维持罐而造成染菌。连消设备中的喷淋冷却蛇管穿孔，导致喷淋冷却水进入已灭菌完毕的培养基中。连消系统的各个环节，例如阀门、法兰垫片泄漏，也会造成打料系统染菌。第34页，共60页。设备渗漏和死角设备渗漏和死角 a.阀门泄漏阀门泄漏 最常见，例如：种子罐排气阀泄漏，导致接种时罐压“掉掉压压”造成染菌。维持罐罐底阀渗漏，部分生料未经维持而通过旁通管路进入罐中。尤其值得注意的是罐上的冷却水阀，一旦泄漏不仅会导致空罐灭菌温度
29、不够，还可能由于冷水与蒸汽接触时的剧烈撞击导致冷却盘管焊缝处的损坏渗漏。b.罐或空气管路上监控仪表套筒渗漏罐或空气管路上监控仪表套筒渗漏，导致导热油流入罐中；减速机油封渗漏，导致润滑油沿搅拌轴流入罐中；罐内冷却盘管穿孔，导致冷却水渗入罐中。c.设备存在死角设备存在死角 罐内部件如挡板、人梯、搅拌轴拉杆、联轴器、冷却管及支撑件、监控仪表套筒焊接处、空气分布管内、罐底阀等处容易存料，形成死角而造成染菌；罐顶部位，由于发酵过程中可能发生的泡沫顶罐，泡沫粘到发酵罐封头上的人孔、视镜口、各种接管口处，若清洗不及时不彻底，粘料会变成硬块，形成死角。第35页，共60页。操作不合理操作不合理固形物含量多的培养
30、基灭菌不彻底。a.实罐灭菌实罐灭菌罐内空气未排尽，形成“假压力”，致使实际灭菌温度不足；实罐灭菌升温阶段泡沫顶罐，泡沫中夹带培养基灭菌不彻底；实罐灭菌过程中阀门调节迅速，料液大幅波动。b.连续灭菌连续灭菌操作的致死温度或维持时间不足；连续灭菌过程中阀门调节过于迅速，或蒸汽压力剧烈波动，都会导致维持罐内料液发生返混，使灭菌时间无法保证，更严重的是未达到致死温度的“生料”进入维持罐而导致染菌。c.空罐灭菌阀门开度不合理，空罐灭菌阀门开度不合理，造成罐内蒸汽流动不畅，形成死角。d.空气除菌过滤器灭菌不合理空气除菌过滤器灭菌不合理，造成灭菌不彻底，造成过滤器滤芯的损坏，导致有菌空气进入罐中。e.罐的清
31、洗工作不彻底罐的清洗工作不彻底，尤其是染菌罐的处理措施不到位。异常情况的发生也能导致染菌，比如大范围的停电，造成空压机停止运行，空气系统压力“掉压”，不仅导致罐压“掉0”，严重的还可能发生料液倒流进入空气系统的现象，污染空气过滤器。第36页，共60页。（2）染菌分析及判断）染菌分析及判断染菌规模染菌规模 个别罐偶尔染菌偶尔染菌应重点分析灭菌操作过程是否合理，种子的无菌情况，其次要从罐体方面分析，检查是否有设备阀门渗漏及死角现象。个别罐连续染菌连续染菌应重点从罐体设备本身寻找原因：检查所有与罐直接相连的阀门是否泄漏，罐内是否有渗漏和死角，检查空气除菌过滤器是否损坏失效。种子罐种子罐大规模染菌应重
32、点检查斜面、母瓶的无菌状况。发酵罐发酵罐大规模染菌应重点从补料系统方面查找原因。种子罐和发酵罐同时大规模染菌，空空气系统气系统出现问题的可能性是最大的。染菌类型染菌类型 发酵过程染菌，多种菌型出现的机率多，单菌型机率较少。染的是耐热芽孢杆菌耐热芽孢杆菌时，这与培养基灭菌不彻底或设备内有“死角”关系甚大。杂菌是不耐热的球菌或杆菌时不耐热的球菌或杆菌时，可从空气净化系统、冷却系统、种子带菌、设备渗漏和操作等进行追查。染大肠杆菌大肠杆菌则怀疑是否有脏水污染，如蛇管穿孔。若污染是真菌真菌，就可能是由于设备或冷却盘管的渗透。第37页，共60页。染菌时间染菌时间 消后培养基就染菌，通常是培养基或设备灭菌不
33、彻底以及设备等原因造成的。消后未染菌，接种后开始染菌，应重点从母瓶状况和接种操作环节方面查找原因。消后和接种都未染菌，发酵前期开始染菌，且杂菌繁殖速度很快，应重点从空气系统查找原因。发酵中后期染菌，大多是因为补料系统方面的原因，也不排除空气系统和设备方面的问题。染菌原因复杂，可能是多种因素迭加而成的，因此对以上三方面的情况要结合分析，根据具体情况和实际经验综合判断，绝不能硬搬硬套。第38页，共60页。4防止和制服染菌的方法防止和制服染菌的方法（1）重视日常工作）重视日常工作观察水冷式空气冷却器的出口温度和下吹口水量观察水冷式空气冷却器的出口温度和下吹口水量，湿热季节应加大检查频率，发生穿孔现象
34、能及时发现。观察经过空气夹套加热器加热后的空气温度和预总空气过滤器的下吹口排放情况，检测各罐分过滤器的下吹口空气湿度，保证进罐的空气相对湿度不高于60%。空气除菌过滤器定期灭菌空气除菌过滤器定期灭菌。应保证蒸汽的质量，严格按操作规程操作，避免因温度过高、流量过大或结束时的切换操作过猛而损坏滤芯。观察总蒸汽温度和压力是否对应观察总蒸汽温度和压力是否对应，保证所用蒸汽均为饱和蒸汽。如果是过热蒸汽，应使用蒸汽增湿装置；如果是过湿蒸汽，应适当延长空消时间。定期拆检连消塔、维持罐定期拆检连消塔、维持罐，检查内件坚固情况、存料及结垢情况，及时清理内垢。检查喷淋冷却管路及物料管路上相关阀门的泄漏情况。第39
35、页，共60页。强化菌种保藏管理强化菌种保藏管理，严格执行无菌室管理制度，避免在种子扩培、移种过程中发生污染。对菌种培养基和器具进行严格的灭菌操作，保证灭菌锅内的空气排尽，以免形成“假压力”而导致灭菌不彻底。认真做好罐的清理、冲洗工作，认真做好罐的清理、冲洗工作，清除死角。原则上每批罐放罐并将有害气体置换完全后，应下罐检查。重点是清理易存料的罐内部件如挡板、人梯、搅拌轴拉杆、联轴器、冷却管及支撑件、监控仪表套筒焊接处、空气分布管内、罐底阀等；认真冲洗罐顶部位的人孔、视镜口、各种接管口，清除泡沫；检查冷却盘管、监控仪表套筒、减速机轴封的情况，及时发现泄漏点。定期进行碱水煮罐。定期进行碱水煮罐。用碱
36、水煮罐是最有效的办法：碱水配制浓度不低于1mol/L，体积加到接近排气口，蒸汽加热至90以上，微开罐底蒸汽阀，全开排气阀，保持碱水在微沸状态，煮8小时以上。如果条件允许，通过连消系统将碱水打入罐中是更好的选择。完成后通过罐底管路用空气压入另一个发酵罐继续煮罐。一般三个月到半年煮一轮即可。第40页，共60页。根据培养基情况选择正确的灭菌形式。根据培养基情况选择正确的灭菌形式。一般来说，淀粉质原料在升温过快或混合不均匀时容易结块，使团块中心部位“夹生夹生”，蒸汽不易进入，在发酵过程中这些团块会散开，而造成染菌。同样由于培养基中诸如麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多，在投料时溅到罐壁或罐内的各种支架上
37、，容易形成堆积，这些堆积物在灭菌过程中由于传热较慢，一些杂菌也不易被杀灭，在后续过程中堆积物重新返回至发酵液中造成染菌。淀粉类培养基的灭菌采用实罐灭菌较好，一般在升温前先通过搅拌混合均匀，并加入一定量的淀粉酶进行液化；有大颗粒存在时应先经过筛除去，再进行灭菌；对于麸皮、黄豆饼粉一类的固形物含量较多的培养基，采用罐外预先配料，再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为有效。第41页，共60页。严格按标准操作规程进行灭菌严格按标准操作规程进行灭菌，合理控制灭菌指标在规定范围，避免超标如：在实罐灭菌操作的升温阶段，应合理控制主消蒸汽阀和排气阀的开度，防止升温过快，一方面易发生泡沫顶罐而逃液；一方面冷空气可能未完
38、全排尽，使罐内温度与压力表指示不对应，产生所谓“假压力”，培养基及罐顶局部空间的温度达不到灭菌要求。对发酵辅助设备仪表进行定期保养和检修对发酵辅助设备仪表进行定期保养和检修第42页，共60页。（2）异常情况处理）异常情况处理对染菌罐放罐后的处理对染菌罐放罐后的处理 对于连续染菌的罐，除常规的下罐检查、清理冲洗外，根据染菌原因的判断，应拆检罐上所有阀门及相关管路上的阀门，进行打压试漏打压试漏，泄漏的立即更换；拆检相关设备，如维持罐、除菌过滤器等。这些工作完成后，在进罐之前，还要进行甲醛熏蒸12个小时以上。甲醛熏蒸对于浅表部位和排气系统的灭菌效果较为明显，但对硬垢的灭菌效果不理想，应进行碱水煮罐。
39、以上工作都应制度化、规范化，及时记录，做到有章可寻，有据可查。种子培养期染菌的处理种子培养期染菌的处理 对于已染菌的种子，不能移入发酵罐，应经灭菌后弃掉，并对种子罐及管道等进行仔细检查和彻底灭菌。同时采用备用种子，选择生长正常无杂菌的种子接入发酵罐，继续进行发酵生产。如无备用种子，进行“倒种倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵生产。第43页，共60页。发酵早期染菌处理发酵早期染菌处理 如果早期染菌，原则上可适当改变生长参数改变生长参数，使有利于生产菌而不利于染菌的生长，如降低发酵温度、调节pH值、调整补料量、补加培养基等；加入某些抑制染菌的化合物，条件是这种化合物对生产菌无害，对生产影响不大
40、和在下游精制阶段能被完全去除；如培养基中碳、氮含量还比较高时，终止发酵，将培养基加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵；如果染菌已造成很大危害染菌已造成很大危害，培养基中碳、氮源消耗量已比较多，则可放掉部分发酵液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌后，再接种进行发酵。第44页，共60页。中后期染菌的处理中后期染菌的处理 a.加入一定量的杀菌剂杀菌剂或抗生素抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长，继续进行发酵生产。如抗生素发酵，发酵液中已产生一定浓度的抗生素，对染菌已有一定抑制作用。b.可降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等。c.如果发酵液中产物浓度已达一定数值，则可放罐
41、。对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至120以上，保持30分钟后才能排放。第45页，共60页。噬菌体污染的防止及处理噬菌体污染的防止及处理 噬菌体可通过环境污染、设备的渗漏或“死角”、空气净化系统、培养基灭菌过程、补料过程及操作过程等进入发酵系统而引起染菌。感染噬菌体后，常使发酵液理化性质发生变化。如氨基酸发酵过程中，感染噬菌体后，常使发酵液的光密度在发酵初期不上升或回降；pH值逐渐上升，可到8.0以上，氨的利用率停止；镜检时可发现菌体数量显著减少，找不到完整的菌体；CO2排气量异常，产物含量急剧下降；发酵液发红、发灰、泡沫很多等。当噬菌体危害严重时，稠厚的发酵液经过数小时后即迅速变稀，泡
42、沫增多，短期内大量菌丝自溶，在平板上出现典型的噬菌斑，菌的代谢和产物合成均停滞。防止噬菌体污染是一项系统工程，从培养基的制备、灭菌，种子培养，空气净化系统，环境卫生，设备、管道、车间布局及职工工作责任心等诸多方面，分段检查把关，才能做到根治噬菌体的危害。第46页，共60页。生产中一旦污染噬菌体，可采取下列措施生产中一旦污染噬菌体，可采取下列措施a.a.并罐法并罐法 利用噬菌体只能在处于生长繁殖细胞中增殖生长繁殖细胞中增殖的特点，当发现发酵罐初期污染噬菌体时，可采用并罐法。即将其它罐批发酵1618小时左右的发酵液，以等体积混合后分别发酵，利用其活力旺盛的种子，不进行加热灭菌，亦不需另行补种，便可
43、正常发酵。但要肯定，并入罐的发酵液不能染杂菌，否则两罐都将染菌。b.b.轮换使用菌种或使用抗性菌株轮换使用菌种或使用抗性菌株 发现噬菌体后，停止搅拌，小通风，降低pH值，立即培养要轮换的菌种或抗性种子，培养好后接入发酵罐，并补加1/3正常量的玉米浆（不调pH值）、磷酸盐和镁盐。如pH值仍偏高，不开搅拌，适当通风，至pH值正常，OD值增长后，再开搅拌正常发酵。c.c.放罐重消放罐重消d.d.罐内灭噬菌体法罐内灭噬菌体法 发现噬菌体后，停止搅拌，小通风，降低pH值，间接加热到7080，并自顶盖计量器管道（或接种，加油管）内通入蒸汽，自排气口排出。因噬菌体不耐热噬菌体不耐热，加热可杀死发酵液内的噬菌
44、体，通蒸汽杀死发酵罐及管道内的噬菌体。冷却后，如pH值过高，停止搅拌，小通风，降低pH值，接入2倍量的原菌种，至pH值正常后开始搅拌。e.e.噬菌体污染情况严重噬菌体污染情况严重，上述方法无法解决时，应调换菌种，或停产全面消毒，待空间和环境中噬菌体密度下降后，再恢复生产。第47页，共60页。（3 3）合理安装与设计）合理安装与设计 管路的配置和安装管路的配置和安装。和无菌环境直接接触的管路同样也要求无菌，对这些管路的配置和安装有三个原则：a与蒸汽管路直接或间接相连，可用蒸汽直接消毒;b管路尽量短，弯头和阀门尽量少，阀门与罐体直接相连的短节在不影响操作的前提下尽量短;c直接与罐体相连的截止阀必须
45、倒装。在发酵罐数量不大的情况下，建议采用公用接种管路方在发酵罐数量不大的情况下，建议采用公用接种管路方案，不要采用接种站方式案，不要采用接种站方式。a a发酵罐的排气管路建议单独配置，避免采用主管汇集的方式，如果通气量较大，最好一台罐的排气管对应一台旋风分离器，这样就彻底避免了因逃液或倒压引起的各罐串联染菌的现象。b b接触无菌环境的管路最好使用不锈钢材质，法兰、弯头等管件焊接安装时，必须采用氩气保护焊接方式，避免采用电焊，以保证焊缝的平滑和洁净，不留死角。c c接触料液的管路，其法兰垫圈不要用石棉板材质的，使用过程中会发生老化分层现象而形成死角，最好选用耐腐蚀且光滑的聚四氟乙烯材质。垫片的安
46、装注意中心对正，以免凸出部位挡料，而凹入部位存料。第48页，共60页。发泡及其控制发泡及其控制泡沫产生原因 发酵过程中通入大量空气，并配有机械搅拌，将气流粉碎产生大量气泡。另外，菌体代谢过程中产生CO2气体及代谢产物及菌体本身使发酵液粘度增大，引起泡沫产生。如培养基内含有各种饼粉、酵母粉、蛋白胨、玉米浆等发泡性蛋白质极易产生泡沫。泡沫的控制及消除减少泡沫形成的机会 减少泡沫形成的机会是控制泡沫的内在内素。因此减少泡沫可以从通气搅拌的剧烈程度、罐压高低和培养基组成、原材料性质等着手。消除已形成的泡沫 生产上一般采用机械法、化学法和分离回流法进行消泡。机械消泡是靠机械引起的强烈振动或压力的变化促使
47、气泡破裂。机械消泡可分为罐内消泡和罐外消泡两种方法。前者靠罐内消泡浆转动打碎泡沫；后者是将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或离心力来消除泡沫。第49页，共60页。消沫剂消沫（化学消沫）是靠加入表面活性物质，降低泡沫的局部表面张力，使泡沫破裂的方法。常用消沫剂主要有天然油脂类，高碳醇、脂肪酸和酯类，聚醚类，硅酮类4大类。其中以天然油脂类和聚醚类最为常用。消沫剂的用法可以一次添加、少次多量与多次少量，效果各不相同。分离回流法是利用特殊分离装置，将逃逸泡沫中的气体和料液、菌体分离，经过过滤除菌的气体排入大气，而料液和菌体通过回流管回流入罐。这种设备称为尾气处理器，它利用逃液和排气本身的动力工作，没有
48、动力和原料消耗，可有效增加装料系数。适用于通气量大，易产生泡沫的发酵生产，在需要严禁菌株外逃的场合，如基因工程菌的生产，则必须使用尾气处理器。第50页，共60页。发酵液异常及其处理发酵液异常及其处理（1）发酵液转稀 污染噬菌体污染噬菌体，使菌体自溶。可补入抗噬菌体的种子液进行挽救；罐温长时间偏高罐温长时间偏高，注意罐温变化及时调整；泡沫多，大量逃液泡沫多，大量逃液，加消沫剂无效，被迫采取间歇停搅拌的方法，就在停搅拌的几分钟内溶氧迅速下降到零，菌丝窒息死亡，造成菌丝自溶变稀。在刚出现变稀苗头时及时补充氮源可以促进繁殖新菌体，使发酵恢复正常；有些品种，补入碳源也可防止变稀。补入氮源或碳源后，由于改
49、变了发酵液表面张力，泡沫上升的情况也有所改善。第51页，共60页。（2）发酵液过浓 是发酵液中氮源过多，造成菌体浓度大大增加，降低了溶氧浓度，影响发酵正常进行。向发酵罐内补入大量水，除了使菌体浓度稍加稀释外，还可降低发酵液粘度。视实际情况可分批或一次补水，补水量为发酵液体积5%30%。（3）糖、氮代谢缓慢 原因很多 a a孢子及种子质量不好，培养基消毒不好，培养基中磷酸盐浓度下降等。这类情况可以补充适量合适的氮源或补充一部分磷酸盐。如链霉素发酵前期菌丝生长阶段，若磷酸盐含量过低，必须立即补入一定量磷酸盐，以利于生长，补料过迟效果就差。b b培养中期出现碳/氮缓慢利用时，补加1020mg/kg无
50、机磷会有一定效果。c c发酵后期残糖太高时，可适当提高罐温，利于提高发酵单位及糖氮利用。有些品种发酵中，出现糖氮代谢及发酵单位生长间歇停顿，影响生产，有时pH上升，氨水通不进，发酵单位下跌，这往往与菌种的性能有关。第52页，共60页。（4）pH不正常不正常 由于培养基的灭菌质量、原料质量和水的pH值及发酵过程控制（如空气流量太大，可以使pH上升；加糖、加油过多或过于集中可以引起pH下降等）引起的。当pH不正常时，可以加入酸或碱来调节，也可以加入一些生理酸性或生理碱性物质来调节。（5）菌体生长异常菌体生长异常 a种子质量差或种子低温放置时间长，导致菌体数量较少、停滞期延长、发酵液内菌体数量增长缓
