1、基因基因多态性多态性 人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数人类基因多态性既来源于基因组中重复序列拷贝数的不同，也来源于单拷贝序列的变异。通常分为的不同，也来源于单拷贝序列的变异。通常分为3大类：大类：123限制性片段长度限制性片段长度多态性多态性，即由于，即由于单个碱基的缺失、单个碱基的缺失、重复和插入所引重复和插入所引起限制性内切酶起限制性内切酶位点的变化，而位点的变化，而导致导致DNA片段长片段长度的变化。度的变化。DNA重复序列的重复序列的多态性多态性，特别是，特别是短串联重复序列，短串联重复序列，如小卫星如小卫星DNA和和微卫星微卫星DNA，并，并主要表现于重复主要表现于重复序
2、列拷贝数的变序列拷贝数的变异异。单核苷酸多态性单核苷酸多态性（SNPs），即，即散在的单个碱基散在的单个碱基的不同，包括单的不同，包括单个碱基的缺失和个碱基的缺失和插入，但更多的插入，但更多的是单个碱基的置是单个碱基的置换换。瘦素及瘦素受体基因多态性对瘦素及瘦素受体基因多态性对营养物质代谢的影响营养物质代谢的影响Distribution of Obesity in the worldObesity is popular around the worldThe population suffering from it increases by the yearDistribution of Ob
3、ese PeopleCountry%America31.0Canada24.8Germany25.5England30.5Italy24.8Belgium18.6France20.6Greece27.0China19.7Japan25.2Korea27.2South Africa22.3.Percentage of Obesity什么是什么是瘦素（瘦素（Leptin,LP)Whats Leptin?瘦素是由肥胖基因编码的蛋白质激素瘦素是由肥胖基因编码的蛋白质激素,主要由脂肪组主要由脂肪组织合成织合成,通过受体介导通过受体介导,作用于靶组织作用于靶组织,抑制食欲并参抑制食欲并参与调节能量代谢、神
4、经内分泌和免疫反应等。与调节能量代谢、神经内分泌和免疫反应等。瘦瘦素的生物学素的生物学特征特征主要主要由白色脂肪组织产生由白色脂肪组织产生。其其前体由前体由167个氨基酸残基组成，个氨基酸残基组成，N末端有末端有21个氨基酸残基信号肽，该前体的信个氨基酸残基信号肽，该前体的信号肽在血液中被切掉而成为号肽在血液中被切掉而成为146氨基酸，分子量为氨基酸，分子量为16KD，具有强亲水性，以单体，具有强亲水性，以单体形式存在血浆中，通常血液浓度约为形式存在血浆中，通常血液浓度约为10-9g/ml。瘦瘦素的分泌规律素的分泌规律 瘦素的分泌呈脉冲式，动物的体重、进食和饥饿状态可以影响脉冲的频瘦素的分泌呈
5、脉冲式，动物的体重、进食和饥饿状态可以影响脉冲的频率和幅度。瘦素率和幅度。瘦素mRNA表达呈日周期变化，夜间表达量最高。禁食使瘦表达呈日周期变化，夜间表达量最高。禁食使瘦素表达和分泌显著减少，同时日周期节律消失，再时食可使之恢复正常。素表达和分泌显著减少，同时日周期节律消失，再时食可使之恢复正常。Regulation of LeptinLiver-CellStomachCNSv Leptin can control the adipo-balance of our body through its regulation on different tissuesRegulation of Lep
6、tinAdipocyte BloodBrain Barrier Blood Vessel Central Nervous SystemMuscle TissueSignal Pathway of Leptin in Cell LevelOBRbOBRbJAK1138Tyr1138TyrJAK 抑制食欲，减少能量摄取抑制食欲，减少能量摄取瘦素瘦素受体受体LRb二聚体二聚体介导介导JAKLRb活化活化磷酸化磷酸化LRb吸引吸引STAT3转运到细胞核附近转运到细胞核附近磷酸化磷酸化抑制弓状核抑制弓状核mRNA表达表达NPY抑制食欲抑制食欲吸引吸引JAK介导反馈抑制介导反馈抑制LRb信号信号结合结合增
7、加能量消耗，抑制脂肪生成增加能量消耗，抑制脂肪生成瘦素瘦素神经中枢神经中枢增加交感增加交感神经活性神经活性外周甲肾外周甲肾上腺激素上腺激素增加增加脂肪细胞膜脂肪细胞膜3受体受体激活激活去偶联蛋白去偶联蛋白合成增加合成增加能量变为能量变为热能热能能量消耗增加能量消耗增加乙酰辅酶乙酰辅酶A羧化酶羧化酶基因表达基因表达抑制脂肪生成抑制脂肪生成活化活化AMPK抑制脂酰辅酶抑制脂酰辅酶A羧化酶羧化酶促进脂肪酸氧化促进脂肪酸氧化中国荷斯坦牛中国荷斯坦牛leptin基因多态性及其基因多态性及其与产奶性能的关系与产奶性能的关系徐凯勇徐凯勇研究目的意义研究目的意义 运用 PCR-RFLP 和 PCR-SSCP
8、检测方法研究中国荷斯坦牛leptin 基因多态性，获得该基因多态位点不同基因型，并计算群体中不同基因型的基因型频率，然后结合个体 DHI 数据，分析该基因多态性与产奶性能的关系。（DHI:dairy herd improvement,奶牛记录体系）研究目的意义研究目的意义 获得中国荷斯坦牛 leptin 基因中与产奶性能（产奶量、乳脂率、乳蛋白率、体细胞计数等）相关的遗传分子标记，为奶牛早期选种提供理论和技术上的参考。补充补充-PCR-RFLP聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(restrition
9、 fragment length polymophism，RFLP):是指由限制性酶切位点间的插入是指由限制性酶切位点间的插入缺失缺失重排或重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。PCR-RFLP:是在是在 PCR 和和 DNA 序列分析基础上产生的序列分析基础上产生的 RFLP 技术。技术。该方法是通过该方法是通过 PCR 扩增一段扩增一段 DNA 片段，然后再选择适片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳，可得到有产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。特异性的电
10、泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。PCR-RFLP 引物特殊要求引物特殊要求PCR产物的长度：产物的长度：200-1000bp酶切后产物片断的大小差距：酶切后产物片断的大小差距：100bp以上以上PCR-RFLP概念单链构象多态性单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)单链单链DNA片段呈复杂的空间构象，这种立体结片段呈复杂的空间构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会使其构象发维持的，当有一个碱基发生改变时，会使其构象发生改变
11、，空间构象有差异的单链生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同酰胺凝胶中受排阻大小不同。通过通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以，可以将构象上有差异的分子分离开。称为单链构象多态将构象上有差异的分子分离开。称为单链构象多态性分析法。性分析法。变性变性 单链折叠单链折叠 电泳电泳材材 料料1.实验样品的来源、采样方法及实验样品的来源、采样方法及 DHI 数据数据 中国荷斯坦牛来自山东省济南市佳宝乳业有限公司第一牧场；从1128 头饲养管理相同且有完整 DHI 数据的产奶牛中，随机选则择年龄胎次相近的 190 头，乳静脉采
12、血 10mL，加入 2mL 酸性柠檬酸葡萄糖溶液（ACD）抗凝，-20保存。材材 料料2.主要仪器设备及实验主要仪器设备及实验试剂试剂 dNTPs Mixture、MgCl2、rTaq DNA 聚合酶、10PCR Buffer、DNA 回收试剂盒、DNAMarker DL2000、Cla酶切试剂等购自 TaKaRa 公司;丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED 等购自 Amresco 公司；蛋白酶 K 等购自美国 Promega 公司；琼脂糖等购自上海生工；Tris 饱和酚等购自北京鼎国生物技术发展中心；Kpn2酶切试剂购自 Fermentas 公司。方方 法法1.基因组基因组 DNA 提取提取
13、2.引物设计引物设计（1）牛leptin 基因外显子 2（EMBL，AY138588）E2FB 引物序列，扩增后片段长度为 320bp；（2）牛外显子2 E2JW 引 物 序 列 引 自 Buchanan 等（2002），扩增后片段长度为 94bp。（3）牛 leptin 基因启动子启动子（GenBank，AB070368）序列设计引物，扩增后片段长度为 172bp。3.Leptin 基因外显子基因外显子 2 区多态性区多态性检测检测4.Leptin 基因启动子区多态性基因启动子区多态性检测检测 PCR 非非变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶-银染银染-条带基条带基因型判定因型判定 琼脂糖凝
14、胶电泳琼脂糖凝胶电泳-条带切割回收条带切割回收-测序测序数据数据统计分析统计分析运用运用 SAS 8.2 软件软件 GLM 程序，程序，分析分析 leptin 基因外显子基因外显子 2 区及区及启启动子区动子区多态位点不同基因型与乳多态位点不同基因型与乳脂率、乳蛋白率、体细胞计数及脂率、乳蛋白率、体细胞计数及产奶量的关系产奶量的关系，获得，获得其最小二乘其最小二乘均值；同时考虑产犊季节、胎次均值；同时考虑产犊季节、胎次及其与基因型的交互效应及其与基因型的交互效应。结结 果果基因组基因组DNALeptin 基因外显子基因外显子 2 区多态性检测区多态性检测结果结果Leptin 基因外显子基因外显
15、子 2 区多态性检测结果区多态性检测结果Leptin 基因启动子区多态性检测结果基因启动子区多态性检测结果Leptin 基因基因外显子外显子 2 区区多态性多态性与产奶性能的与产奶性能的关系关系Leptin 基因基因外显子外显子 2 区区多态性与产奶性能的关系多态性与产奶性能的关系Leptin 基因基因外显子外显子 2 区区多态性与产奶性能的关系多态性与产奶性能的关系Leptin 基因基因外显子外显子 2 区区多态性与产奶性能的关系多态性与产奶性能的关系Leptin 基因基因启动子启动子 区区多态性与产奶性能的关系多态性与产奶性能的关系Leptin 基因基因启动子启动子 区区多态性与产奶性能的关系多态性与产奶性能的关系结结 论论leptin 基因启动子序列 UASMS2 和 PSD 可作为影响中国荷斯坦牛乳脂率和 305 天产奶量的遗传分子标记；外显子 2 区 E2FB 多态位点可以作为奶牛 305 天产奶量和乳脂率的一个遗传分子标记，E2JW 多态位点可以作为提高奶牛乳蛋白率的一个遗传分子标记，而E2FB和E2JW两个多态位点交互作用共同影响 305 天产奶量。
