1、基于PCR的染色体步查技术染色体步查染色体步查(Chromosome walking)(Chromosome walking)是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发,逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸组成的方法和过程。经典的染色体步查方法比较烦琐，适合于长距离步行，而基于PCR的染色体步行技术相对而言则比较简便，适合于短距离步行。基于PCR的染色体步查技术 典型的PCR反应需要2个分别位于目的序列两端的引物，而在染色体步行时目的序列只有一端是已知的，因此利用PCR技术进行染色体步行的关键在于提供PCR需要的另一个引物。q利用载体或接头的利用载体或接头的PCR
2、PCR技术技术q利用引物错配的染色体步查技术利用引物错配的染色体步查技术q利用随机引物的染色体步查技术利用随机引物的染色体步查技术(TAIL-PCR)(TAIL-PCR)q利用载体或接头的利用载体或接头的PCRPCR技术技术 这类方法的第一步通常都是酶切基因组DNA，连接载体或接头,以提供PCR需要的另一端引物.v利用载体的PCRv利用接头的PCRv寡聚盒介导的PCRv环状PCR I-PCR(Inverse PCR)P-PCR(Panhandle PCR)v利用载体的PCR 1989年，Shyamala等利用单特异引物PCR(single specific primer PCR,SSPPCR)
3、以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运操纵子为起点进行连续步查。用PstI+AraIM酶切基因组DNA，PstI+XmaI酶切载体DNA,然后连接基因组片段和载体片段，用根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物进行扩增.由于非特异片段没有特异引物的结合位点,即使有载体连接到非特异片段，它也不能得到大量扩增，而使特异片段得到有效扩增。在这种方法中，如果用合适的接头代替载体效果也会一样。这种方法原理简单，实验设计简便，但操作较为繁琐，特异性较低，即使用嵌套引物扩增也往往会造成非特异性扩增，产物仍需杂交进一步确定。之后出现了一些方法利用不同的技术增强PCR的特异性。v利用接头的PCR 1995年，Sie
4、bert结合Vectorette PCR和Suppression PCR设计改进了利用接头的PCR。(1)选择合适的酶切位点酶切总基因组；(2)用连接反应将人工合成的接头连接在酶切片断两端；(3)S-PCR(suppression PCR)所连接的双链接头是反向重复序列。A,如果PCR产物的两末端是双链接头序列，由于反向末端重复序列的存在，每条DNA链的末端就要形成panhandle结构，故而阻止PCR的指数增加。B,如果PCR产物一端是特异引物序列，另一端是接头序列时形不成panhandle结构，PCR扩增正常进行。(4)vectorette接头由一条长链和一条短链组成;短链3端用-NH2封
5、闭,使接头中的短链不会在PCR开始时自身延长;在第一个延伸反应中,接头引物无模板配对,只有特异引物起作用延伸出一条单链;在第二个延伸反应中,接头引物才能以第一个反应中延伸出的单链为模板开始扩增.NH2NH2Gel electrophoresis analysis of the representative PCR products derived from L.borgpetersenii genomic DNA.The PCR walking templates were prepared from EcoRV-digested DNA or from PvuII digested L.bo
6、rgpetersenii genomic DNA.Lane 1,DNA marker;lane 2,primary PCR products from primers AP1 and P12;lane 3,secondary PCR products from primers AP2 and P13.The arrow indicates the PCR fragment that was cloned for sequencing.2000年，Mogens Kilstrup 进一步改进此方法.不要求接头的两条寡核苷酸链一长一短，而使接头两端均为-OH,不含磷酸基团。在第一个变性反应时，和接头
7、引物配对的接头寡核苷酸链会游离出来；在第二个延伸反应中,接头引物才能以第一个反应中延伸出的单链为模板开始扩增.A,B,C EcoRI酶切基因组的扩增产物D,E,F HindIII酶切基因组的扩增产物A,D 只加接头引物B,C,E,F 不同的特异引物和接头引物v寡聚盒介导的PCR 寡聚盒介导PCR是利用双链接头进行染色体步行的方法，为了增加反应的特异性他们在一个特异引物上增加了便于选择特异产物的生物素标记。寡聚盒介导PCR在第一次PCR反应中用带有生物素标记的特异引物进行单引物PCR，合成含有目的序列和接头序列的单链DNA产物，而后用链霉亲和素覆盖的磁珠在反应混合物中捕捉分离带有生物素标记的单链
8、产物，以回收的单链产物为模板用无标记的嵌套特异引物和接头引物进行第二次PCR扩增，终产物纯化后直接进行测序。由于在特异引物上增加了有利于选择特异产物的生物素标记，这种技术的特异性比较高。v环状PCR 环状PCR是能够根据已知序列设计两对嵌套PCR引物进行染色体步行的方法。包括I-PCR(Inverse PCR)P-PCR(Panhandle PCR)I-PCR与P-PCR的不同之处在于前者用DNA连接酶使酶切片段自连产生环状模板，而后者则利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板。I-PCR(Inverse PCR)I-PCR(Inverse PCR):基因组DNA经酶切后自连成环
9、状分子;再用另外一种限制性内切酶在已知序列处切开，又成线状DNA;根据两端序列设计引物进行PCR扩增。I-PCR被用于从酵母基因组DNA中分离YAC克隆末端，也被成功的应用于从植物基因组DNA中分离转座子侧翼的特异区域。主要缺点:需控制酶切片段长度,长度太长会使扩增效率下降;环化反应难以控制，有线状串联体成为副产物甚至是主要产物，导致非特异性扩增.P-PCR(Panhandle PCRP-PCR(Panhandle PCR）与IPCR相比，PPCR是利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板。嵌套PCR(Nested PCR)q利用引物错配的染色体步查技术利用引物错配的染色体步查技
10、术 在PCR过程中总有或多或少的产物是由错配的引物延伸而生成的，这本来是影响PCR反应特异性的不利因素但是PCR是一种相当灵活的技术，Screaton等和Parker等报道的染色体步查技术就是根据PCR的这一性质而设计的。Screaton等发现只用一个引物的PCR反应也能生成少量双链DNA产物，这是由于在不严格的反应条件下引物发生错配引起的。引物的错配可以产生多种长度不同的产物:真实结合位点与另一端错配位点之间的扩增两个错配位点之间的扩增(错配的结果将可以产生一些含有目的片段的产物。)在一系列不同的退火温度下用特异性单引物1分别进行了60个循环的PCR，接着把在不同退火温度下获得的PCR产物合
11、并后用特异引物2作为测序引物共同进行测序。对人类基因组0D44座位步行的结果证明这种方法是可靠的，他们还用这种方法克隆了人类TCRBV2S1基因的启动子序列，所使用的引物中大约有50能够在某一温度下产生大量含有目的序列的产物，并且可以用特异引物2进行测序。与其它方法相比，这种方法速度快、不需要在多个电泳条带中筛选目的片段和克隆。Parker等发现只要在3末端最后2个碱基可以正确配对并且3末端具有部分的同源性，引物不但可以在特异的靶序列而且也可以在非特异序列启动PCR，一个符合上述要求的引物即使有50的碱基发生错配仍然可以有效的诱导延伸反应。他们根据这一发现设计了TGWPCR(Targeted
12、Gene Walking PCR).在TGWPCR中除了两个特异性的嵌套引物外，还需要一组已知与模板DNA有多个杂交位点的步查引物。先以完整的基因组DNA为模板，用特异引物分别与不同的步行引物配对进行一组平行的PCR反应。之后以上述每个反应的产物为模板，用带有放射性标记的嵌套引物和相应的步查引物进行嵌套PCR。反应产物进行电泳，经放射自显影检测后从凝胶中回收带有标记的条带,再一次扩增，产物直接测序.q利用随机引物的染色体步查技术利用随机引物的染色体步查技术 很早就有用随机引物进行染色体步查的技术，但是由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生，这类方法末得到广泛应用.刘耀光等提出的TA
13、IL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)巧妙的解决了这个问题。在利用特异引物和随机引物进行的PCR中一般有3种产物生成：由特异引物和随机引物共同延伸产生的I型产物由特异引物单独延伸生成的II型产物两端由随机引物延伸生成的III型产物。其中I、II型产物中的非特异性产物可以用嵌套特异引物进行嵌套PCR除去。III型产物则不能，因此是PCR中主要的背景。TAIL-PCR用特殊的热循环程序使PCR反应有利于I型产物的扩增，而抑制III型非特异性产物。这种策略的关键关键是TAIL-PCR中使用的较长的高退火温度的嵌套特异引物和较短的低退火温度的随机简并引物，由
14、于两种引物的退火温度有明显的差异，这样就可以通过控制PCR循环中的退火温度决定在PCR反应中何种引物能够占优势，从而控制不同类型产物的生成。在之后的扩增中高严谨度和中严谨度循环交错进行，如此重复这样的交错循环，可以使目的序列的扩增大大超过非特异性产物，从而控制持异产物和非特异产物的生成比例。两端都由特异引物延伸而成的II型产物是由特异引物的错配产生的，这种产物虽然极具竞争性，但是在第二和第三次反应中可以用嵌套特异引物剔除。一般的说，进行两次TAIL-PCR反应就可以把背景降的很低，如果在第二次反应后仍然有明显的III型产物就有必要进行第三次反应.TAIL-PCR的关键是选择合适的特异引物和随机简并引物，一套合适的引物可以使反应表现很高的特异性.
