1、外源外源DNA载体载体DNA重组分子重组分子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞扩增或表达扩增或表达表达表达连接连接转化或转导转化或转导电穿孔或显微注射电穿孔或显微注射受体细胞受体细胞1 DNA片段的体外连接片段的体外连接2 重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞3 重组噬菌体重组噬菌体DNA的体外包装与转导的体外包装与转导4 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染1 DNA片段的体外连接片段的体外连接一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接二、平末端二、平末端的连接的连接三、三、PCR产物的连接产物的连接四、四、体外连接应注意的事项体外连接应注意的事项五、体外连接的结果五
2、、体外连接的结果体外连接体外连接DNA连接酶连接酶：由大肠杆菌基因组由大肠杆菌基因组DNA编码，以编码，以NAD+作为能源辅助因子。作为能源辅助因子。；只能连接粘性末端T4 DNA连接酶：连接酶：由大肠杆菌由大肠杆菌T4噬菌体噬菌体DNA编编码，以码，以ATP作为能源辅助因子。作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以连接平末端年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分分子及单链子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应分子，所以在基因克隆中应用广泛。用广泛。连接酶连接酶一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接利用粘性末端单链间的碱基互补，并用利用粘性末端单链间的碱基互补，并用DNA连接
3、酶把相互靠近的连接酶把相互靠近的5端磷酸端磷酸与与3-OH连到连到一起。一起。1.两段两段DNA的连接的连接依靠粘性末端依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接片断与载体的连接依靠粘性末端依靠粘性末端3.载体载体与载体的连接与载体的连接二、平末端（二、平末端（blunt end）的连接）的连接5端与端与3端并列靠近的时间太短，不容易端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。被连接酶连接。1.直接连接直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的效率很低，只有粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3
4、-OH-PP-HO-5 3 1972年，斯坦福大学的年，斯坦福大学的P.Labban和和P.Kaiser提出。提出。（1）同聚物加尾法）同聚物加尾法 2.人工加尾形成人工加尾形成“粘性末端粘性末端”末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶能在没有模板的情能在没有模板的情况下给况下给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾加尾碱基互补碱基互补缺点缺点：优点优点：能把任何能把任何片段连接片段连接起来起来不能把不能把插入片插入片段再切段再切下来。下来。非酶切位点非酶切位点用用T4 DNA连接酶连
5、到平端连接酶连到平端DNA上，然上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物）衔接物(linker)连接连接 linker用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限的特定限制性内切酶识别位点序列的制性内切酶识别位点序列的平端双链平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker：linker的作用的作用 缺点：缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段切下完整的插入片段2）能给载体连接上）能给载体
6、连接上Polylinker:优点：优点：DNA接头接头(adapter)连接法连接法1978年康内尔大学的年康内尔大学的吴瑞吴瑞教授发明。教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用用T4DNA连接酶连到连接酶连到DNA分子的两分子的两端，直接成为人工粘性末端。端，直接成为人工粘性末端。adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。切位点序列）。adapter的作用的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCC
7、GG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我连接接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与影响与DNA片段的连接。片段的连接。优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先用小牛肠先用小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶（CIP）处理接头，）处理接头，水解掉其水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。端的磷酸，防止自我连接。（以后再用（以后再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶加上磷酸。）加上磷酸。）防止自我连接防止自
8、我连接载体自连及去磷酸化示意图载体自连及去磷酸化示意图5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP处理处理-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5GATCCCGG-HO-GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG5 5H
9、O-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNADNA片断连接。片断连接。三、三、PCR产物的连接产物的连接1.在引物的在引物的5端设计酶切位点端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；符合载体的多克隆位点；（1）设计原则）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构3端端1520bp与模板互补；与模板互补；5端端610bp是某个内切酶的识别序列。是某个内切酶的识别序列。（5端多余的端多余的35bp属属保护碱基保护碱基）避免与所扩增的避免与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重
10、复。片断内部酶切位点重复。引物引物1GCAGAATTC 互补序列互补序列模板模板EcoRI位点位点5-3 GCAGAATTC 互补序列互补序列5-3 3 模板模板GCAGAATTC 互补序列互补序列 PCR产物产物5-3 3 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列互补序列模板模板BamH I 位点位点-5 3-5 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互补序列互补序列-5 3-模板模板5 GCTAGCCGG PCR产物产物 互补序列互补序列-5 3-引物引物2带酶切位点的带酶切位点的PCR产物产物GCAGAATTC PCR产物产物5-3 GC
11、TAGCCGG PCR产物产物-5 3-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点位点BamHI位点位点AATTC PCR产物产物5-3 GCTAG PCR产物产物-5 3-GCEcoRI BamHI两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！2.与与T载体直接连接载体直接连接（1）PCR产物两个产物两个3端一般都有一个端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在聚合酶的特性：在DNA双双链的链的3端再加上一个多余的核苷酸端再加上一个多余的核苷酸（优先加（优先加A）。）。（2）T载体的两个载体的两个3端人为地各加一个端人为地各加一个T利用利用Taq DNA聚合酶，当原料中只聚合酶，当
12、原料中只有有dTTP时，被迫在平端载体上添加时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA四、四、DNA体外连接应注意的事项体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。尽量避免平端连接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切）用相同的酶切（2）用同尾酶切）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生都产生GATC4个碱基的粘性末端。个碱基的粘性末端。2.DNA插入的方向正确插入的方
13、向正确（1）用双酶切）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的开放阅读框（插入基因的开放阅读框（ORF）正确）正确（1）DNA定向插入定向插入（2）起始密码）起始密码尤其当尤其当载体上有载体上有ATG起始密码的时候，起始密码的时候，更要注意。更要注意。ATGGAATTC载体载体ATGCGGAATTCT插入片断插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组重组但移码突变！但移码突变！4.防止载体自身环化连接防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量）提高插入
14、片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的载体切口的5磷酸被除去，不能自我连磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。接。但可以与插入片断以单链连接。5 3 载体载体插入片断插入片断五、载体和外源五、载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果1.载体自身环化连接载体自身环化连接2.载体之间互相连接载体之间互相连接3.插入片段互相连接插入片段互相连接4.一个载体与几个插入片段重组一个载体与几个插入片段重组五、载体和外源五、载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的
15、连接结果5.几个载体与一个插入片段重组几个载体与一个插入片段重组7（能存活）（能存活）（能存活）（能存活）（不能存活）（不能存活）（能存活）（能存活）（能存活）（能存活）中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学院院士、美国斯坦福大学教授斯坦利中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学院院士、美国斯坦福大学教授斯坦利科恩科恩(Stanley N.Cohen)从批准该专利到从批准该专利到该专利该专利1997年年12月月2日失效的日失效的17年年中，该专利一共中，该专利一共许可了许可了468家公司家公司，两所大学共获得两所大学共获得了许可费收入约了许可费收入约2.55亿亿美元。美元。2 重组体导入细菌
16、细胞重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备二、重组二、重组DNA导导入大肠杆菌入大肠杆菌1.热休克法热休克法2.电转化法电转化法4.体外包装的噬菌体外包装的噬菌体的转导体的转导重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞3.农杆菌介导法农杆菌介导法黑膜试验黑膜试验不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层1.目的目的增加受体菌增加受体菌细胞膜的通细胞膜的通透性。透性。一、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备使用丧失了使用丧失了限制体系限制体系的大肠杆菌。的大肠杆菌。如如K12系列的大肠杆菌。系列的大肠杆菌。2.菌种菌种用用CaCl2处理大肠杆菌
17、，能增加膜的通透性。处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理制备原理50-100mmol/LCaCl2 4.制备过程制备过程培养大培养大肠杆菌肠杆菌OD600至至0.5On ice 5-10 min4离心离心3000g 10min收集收集菌菌用冰冷的用冰冷的50mMCaCl2重悬重悬4离心离心收集菌收集菌4离心离心收集菌收集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的50mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的50mMCaCl2重悬（重悬（15%甘油）甘油）3离心离心3重悬重悬2冰浴冰浴二、重组二、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌（1）转化（）转化（transf
18、ormation)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒DNA的过程。的过程。（2）转染（）转染（transfection)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。1.外源外源DNA导入细菌的几种方法导入细菌的几种方法（3）转导（）转导（transduction)借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。每每 gDNA转化成功的细菌克隆数。转化成功的细菌克隆数。3.转化方法转化方法 2.转化率转化率简单简单，但转化效率不高，但转化效率不高（1）热休克法（）热休克法（heat shock）转化效率高转化效率高10ng载载体体DNA100 L感感受态菌受态菌
19、 On ice混混合，静置合，静置10分钟分钟42C 1分钟分钟加入加入1mL LB培养基培养基37摇摇1小时小时10-100 L转化转化液涂含抗菌素液涂含抗菌素的平板的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）热休克法）热休克法LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，2C离心集菌离心集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离离心集菌心集菌冰冷的水冰冷的水重悬菌体重悬菌体2C离离心收集菌心收集菌体体少量冰冷少量冰冷的水重悬的水重悬分装成分装成 50-300 L 电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F 脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质粒质粒DN
20、A On ice混合混合加入加入1mLSOC培养液培养液37C中速中速震荡震荡60分钟分钟10-100 L转化液涂转化液涂含抗菌素的平板含抗菌素的平板转化转化10-100 L转转化液化液涂于含抗涂于含抗菌素的平菌素的平板板37过夜过夜环形重组质粒环形重组质粒 质粒自我连接质粒自我连接:干扰因素干扰因素线性载体或线性载体或DNADNA片断进入细菌会被降解。片断进入细菌会被降解。环形质粒数环形质粒数（1）重组质粒）重组质粒 5.影响转化率的因素影响转化率的因素生长状态生长状态制备感受态菌必须使用制备感受态菌必须使用对数生长期对数生长期的菌。的菌。必须在冰冷的条件下制备。必须在冰冷的条件下制备。要充
21、分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下以下CaCl2处理处理使用感受态菌时必须迅速融化使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞）感受态细胞 （competent cells)把重组的噬菌体把重组的噬菌体 DNA或或Cosmid质粒质粒DNA包装成具有感染能力的包装成具有感染能力的 噬菌体颗粒。噬菌体颗粒。（1）体外包装（）体外包装（in vitro packaging）（2）转导（）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的通过受体菌细胞表面的 DNA接受器位
22、接受器位点（点（receptor site)，使带有外源基因的，使带有外源基因的重组体重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。注入受体大肠杆菌进行扩增。3 重组重组 噬菌体噬菌体DNA的体外包装与转导的体外包装与转导cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在感染细菌后，在32下培养细菌时能够保下培养细菌时能够保持溶源性。持溶源性。但当温度升高到但当温度升高到4445时，就会导致时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的基因
23、突变的 噬菌体噬菌体 但由于该噬菌体的但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。所以细菌还不裂解。cI857其它基因其它基因溶源状态（溶源状态（DNA不转录、不翻译）不转录、不翻译）DNA阻遏阻遏 蛋白蛋白阻遏阻遏 蛋白蛋白4445 DNA转录、翻译合成外壳蛋白转录、翻译合成外壳蛋白32 噬菌体噬菌体1外壳蛋白基因外壳蛋白基因E发生了无义突变，不发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（蛋白（尾部蛋白尾部蛋白）。）。在在cI857基因突变的基因突变的 噬菌体的基础上，噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型选择两种外壳
24、蛋白的突变型 噬菌体。噬菌体。（4）互补型噬菌体互补型噬菌体 外壳蛋白基因外壳蛋白基因D发生了无义突变，不发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（成其它外壳蛋白（头部头部、尾部蛋白）。、尾部蛋白）。噬菌体噬菌体2(5)体体外外包包装装过过程程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每 g DNA能形成能形成106噬菌斑）。噬菌斑）。（6）转导转导 74 重组克隆载体导入真核细胞重组克隆载体导入真核细胞一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞二、导入植
25、物细胞二、导入植物细胞三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞外源基因导入真核细外源基因导入真核细胞胞转化率高的菌株；转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。不育的菌株（不会与其他酵母接合）。一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择菌株选择如：如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31（1）利用原生质球进行转化）利用原生质球进行转化 2.酵母的转化方法酵母的转化方法 酵母酵母原生质球原生质球感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因插入外源基因 的酵母载体
26、的酵母载体PEG（聚乙二醇）使（聚乙二醇）使细胞壁细胞壁具有通透性，允具有通透性，允许许DNA进入。进入。CaCl2使使细胞膜细胞膜具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。转化转化n原生质球原生质球(Spheroplast)指指细胞壁细胞壁未被全部去掉的未被全部去掉的细菌细胞，它呈圆球状，可以人为地通过溶菌酶细菌细胞，它呈圆球状，可以人为地通过溶菌酶或青霉素处理革兰氏阴性细菌而获得。或青霉素处理革兰氏阴性细菌而获得。n该类菌细胞壁肽聚糖虽被除去，但外壁层中该类菌细胞壁肽聚糖虽被除去，但外壁层中脂多脂多糖、脂蛋白仍然保留糖、脂蛋白仍然保留，外壁的结构尚存。所以，外壁的结构尚存。所以，原
27、生质球较之原生质球较之原生质体原生质体对外界环境具一定抗性，对外界环境具一定抗性，并能在普通培养基上生长。并能在普通培养基上生长。酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态40%PEG 4000（2）利用）利用Li+盐进行转化盐进行转化叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡看护培养基看护培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗二、导入植物细胞二、导入植物细胞1.叶盘法（叶盘法（leaf disk)植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶纤维素酶和果胶酶和果胶酶DNA混合入电混合入电击缓冲液击缓冲液电转仪电转仪1-2kV,3-2
28、5 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化2.电击法（电击法（electroporation)又称高速微型子弹射击法（又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m钨弹头钨弹头 吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入3.基因枪法（基因枪法（gene gun）支撑板支撑板4.农杆菌农杆菌（agrobacterium）介导介导（1）原理：）原理：三、导入哺乳动物细胞三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法HEPES4-羟乙基哌嗪乙磺酸羟乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羟乙基羟乙基)哌嗪哌嗪-N-2-乙烷磺酸乙烷磺酸缓冲盐水缓冲
29、盐水（将（将1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖葡聚糖(glucan or dextran)和和1g HEPES溶解在溶解在90ml的蒸馏水，用的蒸馏水，用0.5M NaOH调节至所需调节至所需pH值，再用蒸馏水定容至值，再用蒸馏水定容至100ml即可。）即可。）与含有氯化钙和与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多依据不同的细胞类型，平皿上最多能有能有10%的细胞能吸收的细胞能吸收DNA沉淀。沉淀。（2）特点：）特点：脂质体有商业试剂盒（
30、如脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。）。2.脂质体（脂质体（lipofectin）载体法）载体法脂类包埋脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。，通过细胞膜进入细胞。直接把外源直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。使其整合到染色体上。3.显微注射法显微注射法(microinjection)二乙氨乙基（二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖传染法葡萄糖传染法葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNADNA可可以进入到细胞核里。以进入到细胞核里。DEAE-dextran细胞细胞外源外源DNA预处理预处理摄入摄入DEAE-dextran外源外源DNA细胞细胞混合混合DEAE-dextran对细胞有毒对细胞有毒!5.病毒（病毒（virus）介导）介导外源基因外源基因导入细胞导入细胞的方法的方法7
