1、1 色谱法色谱法 色谱法是一种物理或物理化学的分离分析色谱法是一种物理或物理化学的分离分析方法，其分离原理主要是利用物质在流动相和方法，其分离原理主要是利用物质在流动相和固定相中的分配系数、或吸附能力等的固定相中的分配系数、或吸附能力等的差异差异而而得到得到分离分离。随着临床药学的迅速发展，随着临床药学的迅速发展，色谱法色谱法在体内药在体内药物分析中的应用更为广泛，具有不可取代的重要物分析中的应用更为广泛，具有不可取代的重要地位，已成为体内药物分离检测最重要的方法地位，已成为体内药物分离检测最重要的方法2 液相色谱法液相色谱法是应用最广的分离分析方法，是应用最广的分离分析方法，特别是对于复杂样
2、品的分析尤为重要。液相色特别是对于复杂样品的分析尤为重要。液相色谱法的分支很多，谱法的分支很多，广义的液相色谱法包括：高广义的液相色谱法包括：高效液相色谱法、薄层色谱法、超临界流体色谱效液相色谱法、薄层色谱法、超临界流体色谱法、毛细管电泳法等类别，法、毛细管电泳法等类别，而它们又各自包括而它们又各自包括多种方法。多种方法。色谱法包括纸色谱、薄层色谱、凝胶色谱、色谱法包括纸色谱、薄层色谱、凝胶色谱、气相色谱和液相色谱气相色谱和液相色谱3 第一节第一节 薄层色谱法薄层色谱法（TLCTLC）是指将固定相均匀地涂布在具有光洁表面是指将固定相均匀地涂布在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属膜等表面上形成薄层，
3、将的玻璃、塑料或金属膜等表面上形成薄层，将被分离物质点在薄层板的一端，置展开室中，被分离物质点在薄层板的一端，置展开室中，展开剂借毛细管作用从薄层点样的一端展开到展开剂借毛细管作用从薄层点样的一端展开到另一端，在此过程中不同物质可以进行色谱分另一端，在此过程中不同物质可以进行色谱分离。离。根据不同的分离机制，薄层色谱法可以分为根据不同的分离机制，薄层色谱法可以分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色、离子交换薄层色谱和凝胶薄层色谱。谱和凝胶薄层色谱。4薄层色谱的特点：薄层色谱的特点：可以可以同时平行分离多个样品同时平行分离多个样品；分析成本低分析成本低；对样品预
4、对样品预处理要求低处理要求低；薄层板一次性使用，对样品要求不高；薄层板一次性使用，对样品要求不高；对固定相、展开剂的选择自由度大。对固定相、展开剂的选择自由度大。传统的传统的TLC法缺点：法缺点：展开时间长、展开剂体积需求大和分离结果差等。其展开时间长、展开剂体积需求大和分离结果差等。其色谱结果易受铺板质量、点样技术、展开剂配制、层色谱结果易受铺板质量、点样技术、展开剂配制、层析环境中展开剂的饱和度、环境温、湿度等因素的影析环境中展开剂的饱和度、环境温、湿度等因素的影响，有时难于重复；显色易受均匀性、灵敏度、稳定响，有时难于重复；显色易受均匀性、灵敏度、稳定性等影响，这均使测定结果偏差较大。性
5、等影响，这均使测定结果偏差较大。5 是近年来迅速发展的一种高效、快速、操作是近年来迅速发展的一种高效、快速、操作简便、结果准确、灵敏度高和重现性好的薄层色简便、结果准确、灵敏度高和重现性好的薄层色谱新技术，它采用更细、更均匀的改性硅胶和纤谱新技术，它采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素等为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，维素等为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性，已广泛用于各个领域。的选择性，已广泛用于各个领域。高效薄层色谱法高效薄层色谱法high performance thin-layer ch
6、romatography (HPTLC)与传统与传统TLC相比，高效薄层色谱法在薄层制备、展相比，高效薄层色谱法在薄层制备、展开方式、分析鉴定手段以及相配套的仪器设备等方面进开方式、分析鉴定手段以及相配套的仪器设备等方面进行了行了 许多改革，其中最根本的是许多改革，其中最根本的是固定相的改进。固定相的改进。67 而在而在TLC、HPTLC和和UPTLC三种规三种规格的预制硅胶薄层板中，又以格的预制硅胶薄层板中，又以HPTLC最最能体现出薄层色谱分析效率高且经济实能体现出薄层色谱分析效率高且经济实用的特点。其应用在目前的科研和日常用的特点。其应用在目前的科研和日常分析中越来越得到普及。无定形分析
7、中越来越得到普及。无定形HPTLC硅胶的平均粒径和粒径分布范围相对硅胶的平均粒径和粒径分布范围相对TLC有较大改善，以较短的展开距离和有较大改善，以较短的展开距离和时间就可以获得较高的理论塔板数和分时间就可以获得较高的理论塔板数和分离度。离度。由于成分斑点更为集中，因此所由于成分斑点更为集中，因此所需的有效涂层厚度也大为减少，检测灵需的有效涂层厚度也大为减少，检测灵敏度也因而较敏度也因而较TLC有一个数量级的提高。有一个数量级的提高。8C18：弱极性Diol:二醇醚改性CN：丙基腈改性NH2：丙氨基改性9101112两个基本要求：两个基本要求：第一，点样位置需精确；第一，点样位置需精确；第二，
8、尤其对于定量分析，点样体积需要精确和准确。第二，尤其对于定量分析，点样体积需要精确和准确。点样点样 为了提高分离效率，原点在展开方向应该尽可能小，为了提高分离效率，原点在展开方向应该尽可能小，对于对于HPTLC，应小于，应小于1.5mm，点状点样：体积受到严格限制。在点状点样：体积受到严格限制。在HPTLC板上点状点样体板上点状点样体积通常为积通常为0.1-1L。溶剂在板上扩散会。溶剂在板上扩散会“环形色谱环形色谱”。非接触喷雾式条带状点样：均匀，可提高解析度和检测限。非接触喷雾式条带状点样：均匀，可提高解析度和检测限。由于由于HPTLC扩散小，扩散小，10*10cm板可点板可点16个样品个样
9、品1314薄层色谱有别于其他色谱技术，除了都有固定相和流动相外，还存在气相。气相会对分离结果产生显著影响。展开室预先用展开剂饱和展开距离由于TLC中流动相的速度不是固定的，而是随展开时间和展开距离增加而降低，所以展开距离有一定限制。通常在HPTLC板上5cm展距分辨率较高 展开展开151、显色剂显色法：喷雾显色，借助喷雾器喷、显色剂显色法：喷雾显色，借助喷雾器喷细雾至板面湿润。细雾至板面湿润。2、紫外线照射法：如、紫外线照射法：如AFTB1在在WL365nm观察；观察；3、对本身是有色的斑点则不需显色。、对本身是有色的斑点则不需显色。显色显色161、定性：斑点显色后量出高度，求得、定性：斑点显
10、色后量出高度，求得Rf值值2、定量方法、定量方法 目视直接比较法目视直接比较法 洗脱测定法洗脱测定法 薄层扫描法薄层扫描法定性定量定性定量17薄层扫描法一般由薄层扫描仪完成。该仪器一薄层扫描法一般由薄层扫描仪完成。该仪器一般由下列部分组成计算机、光源、单色光器、般由下列部分组成计算机、光源、单色光器、监测器、打印机、记录仪。按测定方法分可分监测器、打印机、记录仪。按测定方法分可分为透射法、反射法。按其扫描方式可分为线性为透射法、反射法。按其扫描方式可分为线性扫描法、锯齿扫描法、飞点扫描法或称之为微扫描法、锯齿扫描法、飞点扫描法或称之为微光点快速扫描法。瑞士和日本岛津类型仪器所光点快速扫描法。瑞
11、士和日本岛津类型仪器所采用的是锯齿扫描或飞点扫描法。目前是以锯采用的是锯齿扫描或飞点扫描法。目前是以锯齿扫描和飞点扫描法为佳。齿扫描和飞点扫描法为佳。18192021 瑞士卡玛瑞士卡玛CAMAG公司的仪器公司的仪器全自动、半自动、手动点样仪 条带状喷雾式样品点样22CAMAG全自动展开仪（全自动展开仪（ADC2）薄层板切割器:23西洋参在UV366下的色谱图（指纹图谱）Visualizer数码成像系统 24 薄层色谱扫描仪薄层色谱扫描仪、工作站、工作站可进行可进行薄层色谱光密度分析薄层色谱光密度分析一整套仪器要一整套仪器要30多万人民币多万人民币25例子：例子：高效薄层色谱法测定高效薄层色谱法
12、测定人血清中盐酸胺碘酮人血清中盐酸胺碘酮 盐酸胺碘酮为临床上常用的抗心律失盐酸胺碘酮为临床上常用的抗心律失常药物，其治疗指数低安全范围窄，且常药物，其治疗指数低安全范围窄，且个体差异大，为了解治疗效果与血药浓度个体差异大，为了解治疗效果与血药浓度的关系，我们建立高效薄层色谱法的关系，我们建立高效薄层色谱法(HPTLC)。本法操作简便易行，不失为临。本法操作简便易行，不失为临床盐酸胺碘酮监测的有效方法。床盐酸胺碘酮监测的有效方法。26供试品溶液的制备 精密量取血清精密量取血清1.0 mL置磨口试管中，置磨口试管中，加入加入 l.0 mL pH3盐酸溶液，再加人盐酸溶液，再加人3.0 mL的氯仿，
13、振荡，移出氯仿层。提取两次。的氯仿，振荡，移出氯仿层。提取两次。将两次氯仿液合并，于将两次氯仿液合并，于55水浴上蒸干，水浴上蒸干，点样前用约点样前用约0.1 mL 氯仿溶解。氯仿溶解。27 薄层色谱条件薄层色谱条件 样品与标准品分别点于同样品与标准品分别点于同一含羧甲基纤维素钠一含羧甲基纤维素钠(为粘合为粘合剂剂)的硅胶的硅胶60 GF254薄层板薄层板上，以无水乙醇一氨水上，以无水乙醇一氨水(50：1)为展开剂水平展开，取出为展开剂水平展开，取出晾干，置紫外灯晾干，置紫外灯(254nm)下下确定斑点位置。斑点颜色为确定斑点位置。斑点颜色为黑褐色黑褐色28 采用双波长反射采用双波长反射法锯齿
14、扫描：测定波法锯齿扫描：测定波长长242nm，参比波长，参比波长370rim；背景补偿；背景补偿；线性参数线性参数Sx：3；扫；扫描步距描步距Y=004；狭；狭缝宽度缝宽度0.4mm0.4mm。薄层扫描图见图薄层扫描图见图2。薄层扫描条件薄层扫描条件 29血清标准曲线的制备血清标准曲线的制备 分别精密吸取对照品分别精密吸取对照品溶液溶液(浓度为浓度为1.0gmL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0L加人加人磨口试管中，再加人血磨口试管中，再加人血清清l.0mL，按供试品溶液，按供试品溶液的制备方法操作的制备方法操作30 取同一对照品溶液，分别点于5块含羧甲基纤维素(为粘台剂)的硅胶60GF 薄层板上(4种不同点样量)依法展开后扫描测定。吸收数据见表3。板间误差测定：板间误差测定：稳定性试验、板内误差测定、仪器精密度测定、回收率试验 都很好31样品预处理：样品预处理：TLC法直接取离心后血清法直接取离心后血清测定测定TLC法：用微量注射器分别取乐果标准溶液和血清样品各法：用微量注射器分别取乐果标准溶液和血清样品各2L，点在薄层板上，展开剂，点在薄层板上，展开剂 1：1(vv)正己烷：丙酮正己烷：丙酮1-5，10、50、100、200、500 g/ml乐果标准溶液乐果标准溶液
