1、第 四 节 DNA限制酶切反应和 限制酶谱绘制 一DNA的限制酶反应 1.酶单位定义:使1g某种DNA在最适反应条件下和1小时内完全酶切所需的限制酶活性。2.酶切反应类型 1)完全酶切 SV40(5243bp)pBR322(4363bp)2)部分酶切 3.酶切反应最适条件 1)DNA分子的组成 i.碱基组成与排列方式 ii.识别位点两侧的碱基组成与排列方式，同一 DNA分子中不同识别位点的酶切速度可相差10倍（如中的EcoRI位点）2)反应条件 i.DNA溶液的纯度和浓度（反应浓度）依实验目的而定 HpaI(C CGG)1 26 ThaI(CG CG)0 23 ii.限制酶的纯度和稳定性 i)
2、纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件 ii)稳定性：保存和反应 iii.反应缓冲液：常用三种核心缓冲液，即高（H），中（M），低（L）盐缓冲液，不同温度下的pH值 iv.反应温度：大多数为37 v.双酶切和多酶切反应 同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应，便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者-分别酶切。i)第一种酶切 电泳检查 酚/氯仿纯化 第二种酶切。可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多。ii)采用低浓度盐缓冲液的限制酶切 电泳检查 采用高浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，但要分先后。假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首
3、先考虑的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时，其结果大不相同。如SmaI-BamH(c),BamHI-SmaI(p)二、限制酶图谱的绘制二、限制酶图谱的绘制 1.完全酶切作图法 1）单酶切作图法 一长度为5Kb的线状DNA分子用两种限制酶完全酶切的凝胶电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述辅助方法之一。i.单酶部分酶切：部分酶切时，各种可能性均存在，但只有相邻的两个DNA片段才有可能出现在凝胶上。ii.末端标记完全酶切末端标记完全酶切 DNA片段 末端标记 完全酶切 凝胶电泳 EtBr 染 色观察 放射自显影 2)双酶切作图法 单酶切结果只能确定一种酶的位点，要将两种
4、单酶切结果画在一张图上时则不行 分别作图时，同一种酶的两种作图法都是对的，但当作在一张图上时，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必须进行双酶切反应，其结果见图 根据上述的原理和步骤，前述的5 Kb片段酶I与酶II的定位结果可用两种方法之一：i)单酶切 分离DNA片段 第二种酶切 凝胶电泳 ii)单酶切 第二种酶切 凝胶电泳 *如果要同时将两种限制酶定位在一条DNA上时，单酶完全酶切作图就没必要了。2.末端标记-部分酶切作图法（Smith-Brinstiel 法）DNA片段 末端标记 酶1切 分离带标记 DNA片段 酶2部分酶切 电泳 EtBr 染色照相 放射自显影 结果 单端标记方法:人工合
5、成单端标记法 限制酶切单端标记法 单端标记方法单端标记方法1 人工合成单端标记法 单端标记方法单端标记方法2 限制酶切单端标记法 3.末端标记双相作图法 方法2仍存在两个不足之处：酶1的选择不能靠近DNA中央；需先分离DNA片段，该法可克服上述缺点。现假设有一片段长10 Kb，其中RE1有三个切点，RE2有一个切点，其图谱可能是:4.Bal31顺序酶解作图法 DNA片段 Bal31处理不同时间取样终止反应 限制酶切 凝胶电泳 染色观察结果 5.切口移位作图法(可检测出100bp片段)双链DNA 切口移位 限制酶切 电泳 放射自显影 6.大尺度限制酶作图大尺度限制酶作图 1)条件 i.电泳方法-
6、脉冲场凝胶电泳 ii.样品制备-原位DNA制备和酶解 iii.人工染色体构建-pYAC载体构建 iv.脊椎动物基因组中的CpG和植物基因组中的CpXpG 序列存在 2)一般作图程序 原位DNA样品制备 原位DNA限制酶切 脉冲场凝胶电泳 染色 观察 3)大尺度作图用酶 i.稀有识别序列内切酶-I型内含子内切酶(真菌细胞核和线粒体基因组,T4噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体)；酵母HO内切酶；大肠杆菌recA 虽然这些内切酶识别的序列都很长：10-19 bp，但高等动植物基因组中含有这类位点却极少，因而很少使用 ii.II型限制酶型限制酶 人基因组有45,000个CpG岛,一个长度约为1.5 kb富含
7、GC的DNA片段,其中只有25%的CpG岛未被甲基化,这些CpG岛常位于基因的5-端,未被甲基化的CpG岛平均长约270 kb 可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别8或6 bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列 i)AscI-GGCGCG CC和NotI-GCGGCCGC ii)FseI-GGC CGGCC和SrFI-GCC CGGGC iii)SfiI-GGC CNNNNNGGCC iv)CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCG v)BssHI-GCGCG C,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCG G vi)NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGG
8、C,SmaI-CCCGGG vii)MluI-ACGCG T,NruI-TCGCG A,PvuI-CGATCG,SplI-CGTACG CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 三.限制酶图谱的用途 1.基因工程中的应用 1)克隆载体图谱,便于DNA重组;2)克隆片段图谱可用于次克隆,体外突变,基因定位,核酸定序.2.突变体检测 遗传学图谱必须依赖各种突变体存在,因此必然发生了基因型和表型的变化.限制酶图谱不必依赖表型变化,酶谱的变化一定是基因型发生了变化,但不一定发生了表型变化,即表型的变化不一定会导致酶谱变化.1)缺失突变体的检测:某DNA片段消失,代之以一较小DNA片段.2)插入突
9、变体的检测:某DNA片段消失,代之以一较大DNA片段.缺失和插入突变体的检测（缺失和插入突变体的检测（I）I II 点突变的检测（点突变的检测（II）3）点突变的检测:某DNA片段消失,代之以两较小的DNA片段.前者的长度等于后两者长度之和(位点增加)；某两DNA片段消失,代之以一较大DNA片段，前者的长度之和等于后者长度(位点消失).3.重组频率的测定 同一染色体座位上的等位基因可能具有不同的表型,从而构成遗传多型性.等位基因的限制酶谱也可能具有多型性,这就是限制酶片段长度多型性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)不同个体 总DNA
10、限制酶完全酶切 Southern印迹 杂交 结果分析 当不同个体交配时,除自由组合外,也可发生重组,如不同果蝇交配时,其后代的表型和限制酶谱可为:表型 红:白=1:1,限制酶谱 30%个体已发生了重组.4.遗传疾病的诊断 分析正常人与遗传病患者的某些DNA片段的限制酶谱,便可发现其差异,并总结出各种遗传疾病的限制酶长度多态性图。临床诊断时，将遗传病可疑患者的限制酶谱与之比较,便可判断其是否患有此病.第五节第五节 DNA 的 连 接 一.DNA的连接方法 两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构.1.直接连结法-该法适用于:1)同种限制酶作用
11、不同DNA片段产生的相同粘性末端 重组DNA可用同种酶再切开,但识别简并序列的限制酶除外(如AraI)2)不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端 i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglII ii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能性较小,如MboI/BamHI 3)PCR产物与特定载体的连接 4)限制酶和其他方式产生的平整末端.2.人工接头连接法人工接头连接法 1)人工接头（linker）的结构 i.中轴对称互补,可自行退火形成双链.如:5-CCG GAATTC CGG-3 3-GGC CTTAAG GCC-5 ii.至少有一特定的限制
12、酶识别位点 iii.某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相.如:八聚体 d(GGAATTC C)十聚体 d(CGGAATTC CG)十二聚体 d(CCG GAATTC CGG)2)用途 i.平整末端的连接(各种结构的DNA末端均可经过修饰变成平整末端)2 X 5-CCG GAATTC CGG-3 退火 ii.产生新的克隆位点 iii.合成匹配接头 3)连接方法 人工接头磷酸化 退火形成双链 与目的DNA相连 限制 酶切 两DNA分子相连 4)适用范围 人工接头连接法适合于那些只有一种DNA片段需加人工接头就可以与另一DNA分子相连的DNA分子.利用人工接头也可使任意两个平端的D
13、NA分子相连.这种直接相连的办法简便,快速,但最后连接起来的DNA可能具有不同的结构.为避免这些结构的产生,可先使一种DNA先加上人工接头后,再与另一种DNA分子相连.3.匹配接头连接法匹配接头连接法 人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端.然而,有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末端的DNA分子:i.平端+突起末端(5-突起,3-突起)ii.粘性末端(5-突起+5-突起:EcoRI+HindIII 5-突起+3-突起:EcoRI+PstI 3-突起+3-突起:PstI+SacI)
14、1)匹配接头的结构特点 i.由两个低聚核苷酸组成 ii.部分区域可以互补 iii.退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端 2)匹配接头的种类 i.预制匹配接头(连接平端和粘性末端)人工接头+匹配接头 预制匹配接头 ii.转换匹配接头(连接5-突起和3-突起末端)二匹配接头退火 转换匹配接头 二人工接头 连接酶 双酶切 转换匹配接头 iii.单链匹配接头(连接5-突起和3-突起末端)4.同聚物加尾连接法 在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互补的同聚物,即AT或GC.5.连接方法的选择 方法选择的依据:1)两DNA分子的末端结构 2)DNA 分子的限制酶谱 3)是否需要回收DNA片段 连
15、接方式的选择连接方式的选择 载体末端 外源DNA末端 常规连接 脱磷酸化 同聚物 平端连接 补齐,人工接头 结构 结构 载体 加尾 外切酶 5-突起 相容5-突起 第二选择 第一选择 不能 不能 不能 5-突起 非相容5-突起 不能 结合使用接头 不能 不能 第一选择 3-突起 相容3-突起 唯一选择 不能 不能 不能 不能 3-突起 非相容3-突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择 或平端 3-突起 5-端突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择 (补齐后)平端 平端 不能 可能 可能 第一选择 可能 平端 3-或5-突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择 二.DNA的连接反应 1
16、.连接反应理论 当两种DNA分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关:1)连接反应系统中的总DNA浓度i 2)一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度j,该值与DNA的长度成反比,即DNA分子越大,该分子的两末端越不易相互作用(即自身环化)3)两种不同DNA分子的克分子浓度之比值.2.连接反应条件 1)评估连接反应结果的方法 i.琼脂糖凝胶电泳 ii.大肠杆菌转化 2)反应条件 i.温度 ii.ATP浓度 iii.时间 iv.连接酶浓度 v.克分子比率 第六节第六节 PCR 技 术 一DNA 体外扩增技术 1.PCR 反应体系 1)基本原理(PCRPolymerase Ch
17、ain Reaction 聚合酶链式反应)一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n个分子DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 2)基本操作 待扩增的DNA片段+dNTP+Tris HCl缓冲液+两引物 90变性30 50退火30 加入Taq DNA聚合酶 75 1 进入第二次循环 25-30次循环 90变性解链与引物退火，50引物及延伸，75n次扩增第一次循环第二次循环353535535335533533533555355390变性解链与引物退火，505335533553355335引物及延伸，753353355533533
18、555PCR原理示意图 2.PCR产物的鉴定产物的鉴定 1)PCR产物的大小和限制酶谱分析 bp bp500100600500100RE2)寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（OR分析，Oligomer Restriction analysis）OR分析对于PCR产物的限制酶位点上发生了点突变的检测极其有用 GACTCCTG GCTGAGGAC CAT33GACTCCTG GCTGAGGAC CTA533555beta A beta S GACTCCTG GATCTGAGGAC C3355*GACTCCTG GAACTGAGGAC C3355*CTGAGGAC CT3355*GACTCCTG GA
19、GACTCCTG GAACTGAGGAC C3355*GGAC CACTCCTG GAA3355*GCTGAGGAC CT3355*GACTCCTG GAHinfIDdeI变性/与标记寡核苷酸探针复性8 n.t3 n.tPCR产物的OR鉴定 3)分子杂交分子杂交 适合于检测PCR产物的非限制酶位点上碱基突变。它是利用两条引物链间的特异性DNA片段作探针(常为人工合成的一段低聚核苷酸，约20 n.t.).当这种探针的核苷酸序列与待测的DNA核苷酸序列完全互补时才能杂交。如果利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针（allele-specific Oligonucleotide,ASO）与PCR产物进行
20、杂交，可检测出PCR产物的碱基突变。可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析 110bp -珠蛋白PC03 19A 19S 19C PC0419A 19S 19C AAASSSSCCCACXXAAASSSSCCCACXXPC03:ACACAACTGTGTTCACTAGCPC04:CAACTTCATCCACGTTCACC19CA:CTCCT AGGAGAAGTCTGC19ST:CTCCTG GGAGAAGTCTGC19A:CTCCTGAGGAGAAGTCTGC 4)核苷酸序列分析核苷酸序列分析 DNA扩增产物 变性 与末端标记的扩增引物或定序引物退火 双脱氧核苷酸链终止反应，测定DNA序列 5533
21、5353535变性与引物退火dNTP,ddNTP,Klenow frag.A C G TPCR扩增产物二Taq DNA聚合酶的特点 Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。该酶的分子量为63-68 kD 1.无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内切酶活性，但具有依赖于聚合酶活性的5 3外切酶活性 2.最适反应温度为80 3.最适pH8.0和最佳反缓冲液TrisHCl 4.最佳二价阳离子Mg2+（10 mM）5.具良好的热稳定性：在90下连续反应30分钟仍有70%的酶活 50 100 150 温度掺入的H-dNTTP微克分子数3相对酶活的分率20 40 6
22、0 80 100 0 10 20 30 40 50 60 95 90 70 反应时间（分）掺入的H-dNTTP微克分子数320 40 60 80 25 50 75 Mg二价阳离子浓度（mM)Mn+掺入的H-dNTTP微克分子数3100 200 6 7 8 9 10 pH1 2 3 1.25 mM磷酸缓冲液2.25 mMTris-HCl缓冲液3.25 mM甘氨酸缓冲液Taq DNA 聚合酶的特性聚合酶的特性 当采用Taq DNA聚合酶进行DNA体外扩增时，必须考虑到以下五个参数：1）热稳定性：在PCR循环中DNA的变性时间常为30-60，若循环30次，其累计加热变性时间为15-30。Taq DN
23、A聚合酶在90下保温30仍具有70%酶活性，可大大减少操作步骤，易于实现自动化*2）模板与引物的特异性：当退火温度和DNA链延伸时温度偏低时，引物与模板配对的特异性大大降低，从而导致一些不需要的DNA片段被扩增。显然，其产物的专一性大大降低，使结果无法分析。由于Taq DNA聚合酶最适反应温度为80，退火温度可提高到55以上，由此大大减少了引物与模板的非专一性结合，使产物均一性大大增加*3）合成产率：反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2105，当
24、采用Taq DNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可大4106*4）延伸长度：有时为了获取较长DNA片段的扩增，这就要求DNA聚合酶具有较强的延伸能力。当扩增片段大于250 bp时，Klenow片段和T4聚合酶扩增产率大大降低。利用T7 DNA聚合酶，可使扩增片段达2 Kb。当利用Taq DNA聚合酶时，最长延伸长度为4.4 Kb.经改造的Taq DNA聚合酶可扩增出40 kb的DNA 片段.5）扩增产物的可靠性：评估DNA聚合酶的一个重要指标是它复制DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于PCR技术的可靠性是至关重要的。Klenow片段的错误掺入率为10-4，Taq DNA聚合
25、酶的错误掺入率为510-3，而T4聚合酶的错误掺入率为10-7。*注：1）退火温度常与引物的长度和碱基组成有直接相关关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些。退火温度越高，引物与模板（即扩增的DNA）结合的特异性越高，这可大大减少非特异性DNA片段的扩增。引物的长度常为20-28聚体，其中有50%以上的GC含量，无自身互补序列，特别是3末端不应有内部二级结构，引物加量为每100l l20pmol.*2)出现平台期的原因可能有：后期循环酶浓度或聚合时间不足；引物耗尽；dNTP耗尽；产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。*3）链延伸长度与延伸时间有关，
26、对于Taq DNA聚合酶，每分钟可形成2000 n.t.或更多。如果要扩增3-4 Kb的DNA，在72下需将酶延伸时间增至3-4分钟。三PCR方法 1.强化PCR（Boosted PCR）将PCR分为两个阶段：1）引物与模板之比为107，扩增20个周期 2）引物与模板之比为1012 1013，再扩增10个周期 该法适合于待扩增DNA浓度较低时。2.混合寡核苷酸引物 PCR（mixed oligonucleotide primed amplification of cDNA,MOPAC）根据各氨基酸最常用的密码子合成一系列引物，对某一特定cDNA进行扩增。3.锚定PCR(Anchored PCR
27、，A-PCR)5 3 3 PCRTdTdGTP5 3 55 3 G.G 3 55 C.C 3 G.G 3 55 C.C 3 G.G 3 54.连结连结PCR(ligation mediated PCR)该法可用于核苷酸序列测定,DNA足迹分析技术和测定甲基化作用 DNaseI 变性、引物 链延伸 加接头（引物）外侧引物内侧引物 连接引物 标记引物5.不对称PCR(Asymmetrical PCR)采用不同引物浓度比率，如50：1，100：1，可得大量拷贝的ssDNA用于测序 6.GC串PCR(GC clamp PCR)应用变性剂梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel el
28、ectrophoresis,DGGE)可检测出DNA片段中一对碱基的变化，在DNA分子一端加上一GC串（约40 n.t.）利用它的高解链温度特性，在梯度变性胶上可检测出原DNA链中最高解链区内的点突变 5 GC 20nt 1 2 3 4 1.野生型 2-4.突变型 7.竞争引物PCR(competitive oligonucieotide primer PCR,COP-PCR)有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。准确配对引物 错配引物 共同引物 PCR oror模板 模板 or
29、模板 PCR 等位基因(无突变)模板 等位基因(有突变)无PCR产物8.等位基因专一PCR(Allele specific PCR,ASPCR)该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。9.反转PCR(inverserar inverted PCR)该法可用于扩增已知 序列两侧的未知序列 R2 X LigaseY R1 Y X Z R2 R1 P1 Z R2P210.反向反向PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)主要用于mRNA的PCR扩增 mRNA引物15RT53AAA.A3TTT.T53AAA.ARNaseH53TTT.T53AAA.A53TTT.T
30、53AAA.A53TTT.T535353RT53TTT.TTdT+dGTPGG.GCC.C 限制酶识别序列 限制酶识别序列 11.加端PCR(Add-on PCR)在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列，如某种限制酶的识别序列，某一基因的调控或其它必需序列 12.错配PCR（mismatched PCR)利用该法可在一已知DNA序列中引起点突变，缺失突变和插入突变。P1 P3 P2 靶顺序 P4 分别扩增 5 3 3 5 5 3 3 5除去引物变性/复性P1 P4 产生点突变DNAPCR延伸355313.重组重组PCR(Recombinant PCR)利用该法可将不同基因的DNA片段连接在一
31、起。与基因2启动子同源基因1编码区PCR53变性/复性启动子与基因1编码区同源PCR533553355335链延伸基因2355314.基因克隆PCR 利用该法可获一完整的cDNA克隆。SP6T7PCRIPCRIIPCRIII四.定量PCR技术 1.基本原理 N=N0(1+eff)n N-最终拷贝数；N0-起始拷贝数；eff-扩增效率；n-扩增次数 2.测定方法 竞争PCR法(加入已知量的标准物)；RT-PCR-转录法 五PCR技术的应用 1.遗传疾病的诊断 人类镰刀型贫血症是因第六个密码子的第二个字母发生了AT的改变，从而导致该位点的谷氨酸为缬氨酸所取代。AT突变还导致限制酶OxaNI位点的消
32、失。利用PCR技术和限制酶谱分析诊断此分子疾病大致过程如下：DNA扩增 PAGE 染色 观察 比较不同个体的结果 限制酶切 PAGE 染色 观察 此法可在3-4 h获得结果，比常规的Southern 杂交法简便、快速。PrimerOxaNIOxaNIOxaNIASOxaNI294191103扩增产物AA ASSS2.传染病的诊断 如果已知某种病原菌(体)中的特异性DNA片段的核苷酸序列，这个片段就可以用于DNA扩增，并利用DNA杂交或凝胶电泳的方法诊断病原体的存在与否。例如AIDS的诊断，常规方法是利用血清背景和病毒培养，往往需要3-4个星期，采用PCR技术则只需一天左右，且准确率高 3.基因
33、的快速克隆 根据已知基因序列设计PCR引物,可直接在不同的样品中进行PCR扩增,而不必分离纯化生物样品 4.基因突变 1）缺失突变 2）插入突变 3）点突变-单点和多点突变 六.等温3SR(self-substained sequence replication)反应系统 七.等温链取代扩增反应系统(SDA,strand displacement amplification)T7 RNA pol引物1+RT535335RNaseH引物25335T7 RNA pol引物2+RT反义RNA35引物153355335RNaseHRT53553353553RTT7 promoterT7 promote
34、rmRNA引物15RT引物253AAA.A3TTT.T53AAA.ARNaseH53TTT.T53AAA.A53TTT.T53AAA.A53TTT.T535353RT等等温温3SR反反应应系系统统(self-substained sequence replication)GTTGAC533 5 polIK+3GTTGAC35CA A CTGSSHincII5 5 3GTT GAC35CA A CTGSS链取代HincII5GAC 33GTTG ACS35CA A CTGSS5 5 335CA A CTGSS链取代5G AC S33GTTG ACS35CA A CTGSS5 GTTG ACS等温链取代扩增反应系统 (SDA,strand displacement amplification)3535 T2T1P1P2T1T2PO1IK+dNTP+dNTTP SHincII链取代T2T1变性/与引物复性
