1、一、蛋白质工程崛起的缘由 基因工程在原则上只能生产自然界已经存在的蛋基因工程在原则上只能生产自然界已经存在的蛋白质。白质。这些蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，结这些蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。全符合人类生产和生活的需要。例：干扰素例：干扰素 蛋白质，治疗病毒感染的癌症蛋白质，治疗病毒感染的癌症 体外保存困难体外保存困难半胱氨酸半胱氨酸丝氨酸丝氨酸-70的条件下，保存半年的条件下，保存半年二、蛋白质工程的基本原理 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计
2、。蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过基因修其与生物功能的关系为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或创造一种新的蛋白质，以满足人类的生或创造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。产和生活的需求。蛋白质工程流程图蛋白质工程流程图基因基因DNADNAmRNAmRNA氨基酸序列氨基酸序列多肽链多肽链蛋白质蛋白质三维结构三维结构生物功能生物功能转录转录翻译翻译折叠折叠预期功能预期功能分子设计分子设计DNADNA合成合成三、蛋白质改造工程举例三、蛋白质改造工程举例1水蛭素改造水
3、蛭素改造 水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由它有多种变异体，由65或或66个氨基酸残基组成。水个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，的设计方案，将将47位的位的Asn（天冬酰胺）变成（天冬酰胺）变成Lys（赖氨酸），（赖氨酸），使其与分子内第使其与分子内第4或第或第5位位Thr（苏氨酸）间形成氢（苏
4、氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高血效率，试管试验活性提高4倍，在动物模型上检验倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高抗血栓形成的效果，提高20倍。倍。2胰岛素改造胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基
5、，则可降利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。效胰岛素已通过临床实验。P28 思考与探究1 1.蛋白质工程是应怎样的需求而崛起的？蛋白质工程是应怎样的需求而崛起的？提示：蛋白质工程的崛起主要是工业生产和基础理提示：蛋白质工程的崛起主要是工业生产和基础理论研究的需要。论研究的需要。工业生产中常会有酸、碱存在，反应温度较高，大工业生产中常会有酸、碱存在，反应温度较高，大多数酶会很快变性失活。一般来说，提高蛋白质的多数酶会很快变性失活。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性
6、，稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。引起的活性丧失等。在基础理论研究方面，蛋白质工程是研究多种蛋白在基础理论研究方面，蛋白质工程是研究多种蛋白质的结构和功能、蛋白质折叠、蛋白质分子设计等质的结构和功能、蛋白质折叠、蛋白质分子设计等一系列分子生物学基本问题的一种新型的、强有力一系列分子生物学基本问题的一种新型的、强有力的手段。的手段。提高重组提高重组-干扰素专一活性和稳定性的例子。干扰素专一活性和稳定性的例子。干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的干扰素是一种抗病毒、抗
7、肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为活性为106 U/mg，只相当于天然产品的十分之一，虽，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，状况？研究发现，-干扰素蛋白质中有干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸个半胱氨酸（第（第17位、位、31位和位和141位），推测可能是有一个或几个位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正
8、确的二硫键。研究人员将第半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的肠杆菌中生产的-干扰素的抗病性活性提高到干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然，并且比天然-干扰素的贮存稳定性高很多。干扰素的贮存稳定性高很多。P28 思考与探究2 蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？什么不同？基因工程是遵循中心法则，从基因工程是遵循中心法则，从DNAmRNA蛋白质蛋白质折叠产生功能，基本上是生产出自然折叠产生功能，基本上是
9、生产出自然界已有的蛋白质。界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能质的功能蛋白质应有的高级结构蛋白质应有的高级结构蛋白质应蛋白质应具备的折叠状态具备的折叠状态应有的氨基酸序列应有的氨基酸序列应有的应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。P28 思考与探究3 绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？工程有什么区别？提示：酶工程就是指将酶所具有的生物催提示：酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、化作用，借助工程学
10、的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。工业中。-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；固定化酶蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；固定化酶还可以治疗
11、先天性缺酶病或是器官缺损引起的某些还可以治疗先天性缺酶病或是器官缺损引起的某些功能的衰竭等。至于我们日常生活中所见到的加酶功能的衰竭等。至于我们日常生活中所见到的加酶洗衣粉、嫩肉粉等，就更是酶工程最直接的体现了。洗衣粉、嫩肉粉等，就更是酶工程最直接的体现了。通常所说的通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而
12、蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。P27 讨论 某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸 讨论：怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？遗传密码子表氨基酸序列的编码序列 有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，因此其碱基排列组合起来就比较复杂，至少可以排列出16种，。确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类
13、的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。P27 异想天开 提示：理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来而自然不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构和在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭新而又具有生命功能作用的蛋白质，而且一个崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的。P26旁栏思考题 提示：人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大的科学命题。2019年，国际人类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出启动了两项
14、重大国际合作行动：一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织器官的蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔的重大国际科研协作计划，总部设在北京，目前有16个国家和地区的80多个实验室报名参加。它的科学目标是揭示并确认肝脏的蛋白质，为重大肝病预防、诊断、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础。人类蛋白质组计划的深入研究将是对蛋白质工程的有力推动和理论支持。P26旁栏思考题 2.对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操
15、作，还是通过对基因的操作来实现？答：毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。蛋白质工程的主要步骤通常包括（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。
