1、血栓与止血检验实验诊断 随着血栓与止血检验在临床科室的广泛应用，凝血项目的检测已成为出血性疾病和血栓性疾病的常规检验项目；也成为手术患者术前筛查有无凝血系统疾病的常规检验项目；也是判断抗凝和溶栓治疗监测的关键指标。内容导读内容导读l一、血栓及止血基本理论l二、凝血项目测定的原理及临床意义l三、全自动凝血分析仪的检测方法及原理l四、凝血标本采集的注意事项l五、凝血检测相关问题一、血栓及止血基本理论一、血栓及止血基本理论1 1、血液凝固血液凝固2 2、凝血因子及其命名、凝血因子及其命名3、凝血过程凝血过程4 4、瀑布学说瀑布学说5 5、抗凝及溶栓治疗监测抗凝及溶栓治疗监测的指标的指标1 1、血液凝
2、固血液凝固 血液凝固是血液由液体状态转为凝胶状血液凝固是血液由液体状态转为凝胶状态的过程，简称为凝血。态的过程，简称为凝血。机体的凝血系统是非常精妙的平衡系统，由凝血与抗凝两方面组成，正常生理状态下两者维持着动态平衡，血液在血管中维持着流动状态，而血管损伤时便快速形成凝块，当止血功能障碍时便发生血栓栓塞或出血现象。电电 镜镜 下下 的的 血血 凝凝 块块 Cover7.gifCover7.gif电 镜 下 的 血 凝 块 血液凝固血液凝固（瀑布学说）（瀑布学说）该学说认为血液凝固过程基本上是一系列凝血因子有限水解的过程，凝血过程一旦开始，各个凝血因子便一个激活另一个，形成一个“瀑布”样的反应链
3、直至血液凝固。每个凝血因子都被其因子或其他有关因素激活，最后生成纤维蛋白。因子I纤维蛋白原因子VIII 抗血友病因子甲因子II凝血酶原因子IX抗血友病因子乙因子III组织因子因子X前期加速素、Stuart因子因子IV钙离子因子XI血浆凝血活酶前质因子V易变因子因子XII接触因子因子VII稳定因子因子XIII 纤维蛋白稳定因子2 2、凝血因子及其命名、凝血因子及其命名 概念：把在概念：把在血液和组织中直接产凝血的物质统称为凝血因子为凝血因子 因子II、VII、IX、X都是在肝脏合成的，合成时需维生素K参与，因此也称为维生素K依赖因子。3、凝血过程凝血过程 包含：三条途径或两个系统 内源性凝血途径
4、内源性凝血途径：指由因子XII被激活到IXa-VIIIa-Ca2+-PF3复合物形成的过程。外源性凝血途径外源性凝血途径：指从组织因子(TF)释放入血到TF-VIIa-Ca2+复合物形成的过程。共同途径共同途径：指从因子X的激活到纤维蛋白形成的过程，它 是内、外源凝血系统的共同凝血阶段。凝血过程凝血过程4 4、凝血过程凝血过程（瀑布学说）（瀑布学说）l1 1、口服抗凝药监测、口服抗凝药监测:PT，（华法（华法林林，香豆素类等），香豆素类等）：l2 2、肝素治疗监测、肝素治疗监测:APTT，TT，AT-III（抗凝血酶III）l3 3、溶栓治疗监测、溶栓治疗监测：（链激酶，尿激酶，蛇毒等）（链激
5、酶，尿激酶，蛇毒等）一级监测：PT，TT，FIB 二级监测：D-Dimer（D-二聚体），FDP（纤维蛋白降解产物）PLG（纤溶酶原）,a2-AP（a2-抗纤溶酶）。5 5、抗凝及溶栓治疗监测抗凝及溶栓治疗监测的指标的指标二、凝血项目测定的原理及二、凝血项目测定的原理及临床意义临床意义1 1、凝血酶原时间测定、凝血酶原时间测定2 2、活化部分凝血活酶时间测定、活化部分凝血活酶时间测定3 3、凝血酶时间测定、凝血酶时间测定4 4、纤维蛋白原测定纤维蛋白原测定5 5、D-D-二聚体测定二聚体测定 【原理原理】在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶（人脑、兔脑、胎盘及肺组织等的浸出液）和钙离子，使凝血酶
6、原变为凝血酶，后者使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。观察血浆凝固所需时间即凝血酶原时间。【步骤】【步骤】血浆组织因子钙离子 观察凝固时间【参考值参考值】PT（凝血酶原时间）:10-14s PTA（活动度）：80%-120%PTR（比值）：0.8-1.2 INR（国际标准化比值）：0.8-1.5 1 1、凝血酶原时间测定凝血酶原时间测定 【结果报告结果报告形式形式】凝血酶原时间（PT）：大于正常3秒以上为异常。凝血酶原活动度（PTA）=PTR100%PT比值（PTR）=患者PT/正常对照PT 国际标准化比值（INR）=PTRISI 1 1、凝血酶原时间测定凝血酶原时间测定 =ISIPTINRPT测定值
7、正常人均值INR:国际标准化比值ISI:国际敏感指数 1 1、凝血酶原时间测定凝血酶原时间测定 样品量样品量血浆血浆50l50l试剂量试剂量PTPT试剂试剂100l100l50l血浆100l PT试剂温育温育3 3分钟分钟-检测检测【临床应用】【临床应用】1、是反映外源性凝血系统最常用的筛查试验。2、是监测口服抗凝剂的首选指标。3、是维生素K缺乏的监测指标。【异常意义】【异常意义】1、PT延长见于：先天性凝血因子、缺乏。后天性缺乏，见于DIC、严重肝病、维生素K缺乏等。2、PT缩短见于：DIC早期高凝状态、血栓性疾病、心肌梗 死等。3、口服抗凝剂的监测。1 1、凝血酶原时间测定凝血酶原时间测定
8、 世界卫生组织（WHOWHO）推荐 应用口服抗凝剂时 【INRINR的允许范围的允许范围】：非髋部外科手术前 1.5-2.5;髋部外科手术前 2.0-3.0;深静脉血栓形成 2.0-3.0;治疗肺梗塞 2.0-4.0;预防动脉血栓形成 3.0-4.0;人工瓣膜手术 3.0-4.0 1 1、凝血酶原时间测定凝血酶原时间测定 【原理原理】在抗凝血浆中，加入足量的活化接触因子激活剂和部分凝血活酶（代替血小板的磷脂），再加入适量的钙离子即可满足内源性抗凝血的全部条件。从加入钙离子到血浆凝固所需的时间即称为活化部分凝血活酶时间。【步骤步骤】血浆FXII激活剂部分凝血活酶钙离子 观察凝固时间.【参考值参考
9、值】正常对照为2035s,超过正常对照10s10s以上为异常。2 2、活化部分凝血活酶时间测定、活化部分凝血活酶时间测定 （Activated partial thromboplastin time，APTT）50l血浆 2 2、活化部分凝血活酶时间测定、活化部分凝血活酶时间测定 （Activated partial thromboplastin time，APTT）50lAPPT试剂50l的氯化钙溶液1分钟加热 3分钟加热-检测 2 2、活化部分凝血活酶时间测定、活化部分凝血活酶时间测定 （Activated partial thromboplastin time，APTT）【临床应用】【临
10、床应用】1 1、是检查内源性凝血系统是否正常的筛查试验。2、用于证实先天性或获得性凝血因子、是否缺陷。3、是普通肝素治疗监测的首选指标。2 2、活化部分凝血活酶时间测定、活化部分凝血活酶时间测定 （Activated partial thromboplastin time，APTT)【异常意义】【异常意义】1 1、延长延长:(1)见于因子 和水平减低，如甲型血友病、乙型血友病等。(2)严重的凝血酶原、因子、和纤维蛋白原缺乏。如肝脏疾病、阻塞性黄疸、应用肝素以及低(无)纤维蛋白原血症。(3)纤容活力增强，如继发性、原发性纤溶以及血循环中含有纤维蛋白(原)降解物(FDP)。2 2、缩短缩短 （1）
11、高凝状态，如DIC的高凝血期，促凝物质进入血流以及凝血因子的活性增高等。（2）血栓性疾病，如心肌梗塞、不稳定性心绞痛、脑血管病变、糖尿病伴血管病变、肺梗死、深静脉血栓形成、妊高征和肾病综合征等。【原理原理】在受检血浆中加入标准化的凝血酶溶液后，在凝血酶的作用下纤维蛋白原转变成纤维蛋白，记录血浆凝固所需的时间为凝血酶时间。【步骤步骤】血浆凝血酶 观察凝固时间 【参考值参考值】正常对照为1421s，大于正常对照3s以上为异常。3 3、凝血酶时间测定、凝血酶时间测定（Thrombin time，TT）3 3、凝血酶时间测定、凝血酶时间测定（Thrombin time，TT）样品量血浆50l试剂量凝血
12、酶试剂100l50l血浆100l凝血酶试剂温育温育3 3分钟分钟-检测 3 3、凝血酶时间测定、凝血酶时间测定（Thrombin time，TT）【临床应用】【临床应用】1、用于判定血栓前状态或血栓性疾病的筛查项目。2、用于纤维蛋白形成障碍或怀疑重度纤维蛋白原缺乏的筛查。3、肝素诱导凝血酶时间延长和纤维蛋白形成障碍的鉴别诊断。3 3、凝血酶时间测定、凝血酶时间测定（Thrombin time，TT）【异常意义】【异常意义】1、延长、延长：见于肝素增多或类肝素抗凝物质增多。如SLE、肝病、肾病等，低（无）纤维蛋白血症。纤维蛋白原降解产物（FDP）增多、如DIC、原发性纤溶等。肝素抗凝治疗、体外循
13、环、血液透析等。2、缩短、缩短：见于血标本有微小凝块或钙离子存在时。4 4、纤维蛋白原纤维蛋白原（Fibrinogen FIB 或或Fbg）测定测定：【测定原理测定原理】Clauss法，也叫凝血酶法。为WHO推荐的测定Fbg的参考方法。即在被检血浆中加入过量的凝血酶，血浆即凝固，其凝固时间与纤维蛋白原浓度呈负相关，从国际标准品Fbg参比血浆测定的标准曲线中可获得Fbg浓度。【参考范围参考范围】：2.00-4.00 g/L 4 4、纤维蛋白原纤维蛋白原（Fibrinogen FIB 或或Fbg）测定测定：样品量血浆10l试剂量凝血酶试剂50lOwrens Veronal 缓冲液90l10l血浆
14、90ul Owrens Veronal 缓冲液50l凝血酶试剂3分钟加热-检测 4 4、纤维蛋白原（纤维蛋白原（Fibrinogen FIB 或或Fbg）测定测定：【异常意义【异常意义】1 1、减低：减低：(1.5g/L)见于肝脏疾病、DIC中晚期、原发性纤溶亢进、低（无）纤维蛋白原血症、溶栓治疗等。2 2、增高增高：纤维蛋白原是一种急性时相蛋白,其增加往往是机体的一种非特异反应。常见于下列疾病：急性感染，恶性肿瘤、心机梗塞、外科术后、血栓前状态或血栓性疾病。【临床应用】【临床应用】1、在溶栓时、抗凝治疗时、手术前监测凝血功能。2、是预防血栓形成的独立因素。3、肿瘤病人化疗后监测Fbg，防止F
15、bg降低时出现大出血。5 5、D-D-二聚体测定（仪器二聚体测定（仪器分析分析法）法）【原理原理】免疫比浊法 将待测物质相对应的单克隆抗体包被在聚苯乙烯胶乳颗粒上，当标本中含有D-二聚体时，单克隆抗体即与交联纤维蛋白降解产物（D-二聚体）的交联区域结合。单克隆抗体能触发凝集反应，引起浊度的增加。仪器在800nm处通过对浊度改变的监测，将吸光度转换成浓度值，由此获得样本中D-二聚体的含量。【参考值参考值】0-1 mg/L5 5、D-D-二聚体测定（仪器二聚体测定（仪器分析分析法）法）【临床应用临床应用】l1、用于弥漫性血管内凝血（DIC）的早期诊断。l2、用于血栓疾病的诊断和溶栓疗效的观察。l3
16、、用于肝炎病情的观察。l4、在血液病方面的临床应用。l5、慢性支气管炎急性发作期合并肺部感染。l6、在深静脉血栓、急性心梗、肺栓塞、脑梗死诊断中 的应用。5 5、D-D-二聚体测定（仪器分析法）二聚体测定（仪器分析法）【临床临床意义】意义】1、D-二聚体被视为DIC早期诊断的首选标志物。2、D-二聚体可做为溶栓疗效观察的一个特异性指标。3、D-二聚体含量的升高幅度与肝炎病情的严重程度密切相关。4、D-二聚体是唯一反映凝血和纤溶的理想指标。5、D-二聚体是目前鉴别原发性和继发性纤溶的理想指标。6、D-二聚体被视为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物。7、D-二聚体升高不能诊断血栓的形成部位却能够提
17、示体 内是否有血栓的形成。血凝四项手工法操作步骤（试管法）血凝四项手工法操作步骤（试管法）项目项目PTPTAPTTAPTTTTTT血浆血浆100ul100ul100ul100ul100ul100ulAPTTAPTT100ul100ul混匀后将试剂和标本置于混匀后将试剂和标本置于3737水浴箱水浴箱PTPT200ul200ulCaClCaCl2 2100ul100ulTTTT200ul200ul 观察凝固时间观察凝固时间三、三、全自动凝血分析仪的检测全自动凝血分析仪的检测方法及原理方法及原理1 1、仪器检测功能、仪器检测功能2 2、仪器检测方法及原理、仪器检测方法及原理1 1、仪器检测功能：、仪
18、器检测功能：Sysmex CA-7000及CS-5100全自动凝血分析仪检测项目有十几种，常规的检验项目有PT、APTT、TT、Fbg、D-二聚体、FDP等。两台仪器检测原理相同，具有全自动浓度稀释分析功能、自动再检、自动连锁筛选等功能，全自动进样架进样、全能随机分析、急诊随时插入分析。采用高频振荡混匀技术，能够保证样本和试剂充分混匀，四组检测波长能够满足不同厂家试剂的需求。2 2、仪器检测方法：、仪器检测方法：全自动血凝分析系统CA-7000用于凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统因子的检测，系统采用以下三种检测方法：1）、凝固法 2）、发色底物法 3）、免疫分析法注：凝固法采用了散射光加百分比凝固
19、测定原理，能有效地避免溶血、脂血和及黄疸标本对凝固分析测定干扰（一）凝固法（一）凝固法（检测原理）：对固定数量的血浆进行了一定时间的预热之后，把试剂加进去。被加进了试剂的样品再暴露到光底下，然后在凝固的过程中（即纤维蛋白原向纤维蛋白的转变），随着散射光强度的变化，就可以检测到血浆浑浊度的变化。通过散射光强度的变化，就可以得到一个凝固曲线，通过百分比检测方法就可以知道血浆凝固的时间。1.1.光学检测方法（散射光检测方法）光学检测方法（散射光检测方法）CA-7000使用的是光学检测方法，而且在凝固的过程中，随着散射光强度的变化，可以检测到血浆的浑浊度的变化。从一个光源发出的光（660nm的波长）到
20、达这个样品。样品由于浑浊而使光变得离散起来。散射光被光电二极管接收，光电二极管再把接收到的光信号转变为电子信号。这些电子信号通过一个微型计算机的存储和计算，就可以得到凝固的时间。2.2.凝固点检测方法（百分比检测方法）凝固点检测方法（百分比检测方法）在样品中加入凝固试剂之后，在凝固开始之前，将散射光的强度定义为0%；而在凝固完成的那一刻，将散射光的强度定义为100%。这样从凝固曲线中，就可以找到散射光的强度从刚开始到预先设定的检测百分比的时间。这就是的凝固时间。（在下图中，凝固检测点被设置为50%。）有了这个方法，即使散射光的强度发生一点点的变化，凝固的时间也可以被检测到。散射光的强度血浆凝固
21、的时间（二）免疫分析法（二）免疫分析法（检测原理）将待测物质相对应的抗体包被在大小均一，直径为15-60nm的胶乳颗粒上。包被后的抗体与抗原结合后形成的复合物体积增大,引起透射光的变化，由吸光度变化推算出所检测物质含量。仪器采用发色底物单元的透射光检测系统。（三）发色底物法（三）发色底物法（检测原理）首先人工合成含某种活性酶裂解位点的化合物，且化合物连接上产色物质，在检测过程中产色物质可被解离下来，使被检样品中产生颜色变化，根据酶活性同吸光度的变化、酶活性同所需检测物质含量间存在一定的数量关系，由吸光度变化推算出所检测物质含量。产色物质一般选用连接对硝基苯胺（PNA）。仪器采用透射光检测系统进
22、行检测。光源发出的光经过三种滤光片可以分隔成405nm、575nm、800nm的光选用405nm波长的光照射样本，光电二级管接收到透射光并转换成电信号，通过微计记录每分钟吸光度变化。利用吸光度变化和浓度的关系来检测相对应的待测物浓度百分比活性）。四、凝血标本采集的注意事项四、凝血标本采集的注意事项标本采集注意事项标本采集注意事项抗凝剂与血液的比例要准确，比例1：9。采血时防止组织损伤,避免外源因子进入。避免从输液管取血,以防标本稀释或用药影响。抽血时的压力、时间长短会影响局部血液的浓缩，可影响血小板释放和某些凝血因子的活性。标本尽快送检、最好在2h内检测完毕。分离血浆时，离心速度和时间要充足，
23、务必除去 血小板，特别是用于肝素治疗监测时，因残留血 小板中的PF4可影响肝素的效果。不合格标本不合格标本DICDIC的实验诊断的实验诊断l筛查试验：PLT、PT、APTT、FIB。l确诊试验：TT、FDP、D-D、3P、PLG、2-AP、AT-III。l分子标志物：F1+2、FPA、TAT、PAP五、凝血测定的相关问题1 1、实验室监测指标实验室监测指标1 1）APTTAPTT：通常在应用肝素6小时后检测APTT，一般以比对 照延长1.5倍为宜，不宜超过正常对照的2-2.5倍。2 2）FIBFIB：应维持FIB定量在1.2-1.5g/L，较为适宜，极限 不应低于1.0g/L。否则易发生出血。
24、3 3）TTTT：溶栓治疗效果判断一般认为应维持在正常对照的 1.5-2.5倍为宜。极限不应超过正常对照的3-4倍。4 4）FDPFDP：正常值血清含量10mg/L。溶栓治疗维持FDP值 在300-400mg/L。1）PLT 100 109L2)Fg1.5g/L，进行性下降3）PT时间延长3s以上4）3P试验阳性 5)D-dimer,TT延长6）优球蛋白溶解时间缩短2 2、DICDIC的诊断试验的诊断试验4 4、严重肝病所致的凝血异常、严重肝病所致的凝血异常 肝在凝血因子的合成及代谢中起重要作用，除组织因子和因子(Ca2+)外其它凝血因子几均在肝内合成。已知的有纤维蛋白原、凝血酶原，因子、X、
25、V及部分因子等；因子、，合成部位尚未肯定。在严重肝病时大多数凝血因子在血浆水平有所下降。同时肝还可以合成纤溶酶原及纤溶酶原激活物的抑制物。产生抗凝血因子(抗凝血酶、蛋白C、蛋白S)。肝尚清除纤溶酶、活化的凝血因子及纤维蛋白(原)降解产物。当肝脏疾病时这些凝血物质尤其是维生素K依赖性凝血因子及纤维蛋白原合成减少，清除功能障碍，抗凝血酶及纤溶酶原合成减少，严重肝病及肝功能衰竭时可发生DIC和原发性纤溶亢进；门脉高压、充血性脾大时，血小板减少等均可导致凝血异常。5 5、静脉血栓形成、静脉血栓形成l高凝状态引起的静脉凝块形成高凝状态引起的静脉凝块形成l有一定的发病率和死亡率有一定的发病率和死亡率l静脉
26、血栓形成包括静脉血栓形成包括:深静脉血栓形成深静脉血栓形成 (DVT)(DVT)肺栓塞肺栓塞 (PE)(PE)肺栓塞肺栓塞6 6、肺栓塞、肺栓塞l血凝块进入血循环血凝块进入血循环l死亡率死亡率10%10%l每年约有每年约有200,000200,000人死于肺栓塞人死于肺栓塞 l80%80%的病例在出现症状后的病例在出现症状后 2 2小时内死亡小时内死亡3 3、卫生部、卫生部(2000)214(2000)214文件文件 停止使用出血时间测定项目的Duke法，但出血时间测定这一检验项目不废除。若临床怀疑血管壁或血小板功能异常所致出血性疾病时，可使用出血时间测定器法检测出血时间。停止使用凝血时间测定的玻片法和毛细管法，用部分凝血活酶时间(APTT)或全血凝固时间(CT、试管法)测定进行替代。停止使用一般外科手术前的常规出血时间检测，用活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆凝血酶原时间(PT)和血小板计数(PLT)联合检测取代，如患者临床有出血史可另加出血时间测定器法进行出血时间检测。
