1、环境生物学实验授课教师：高雪峰种子发芽毒性实验种子发芽毒性实验四季小白菜（小麦）种子在不四季小白菜（小麦）种子在不同浓度铜、铬溶液中萌发率的变化同浓度铜、铬溶液中萌发率的变化一、实验目的一、实验目的 通过本实验掌握测定环境污染对植物有效性的方法，通过本实验掌握测定环境污染对植物有效性的方法，了解测定污染物对种子发芽产生毒性的基本原理，掌握了解测定污染物对种子发芽产生毒性的基本原理，掌握实验操作程序和步骤，能够独立进行实验数据计算和处实验操作程序和步骤，能够独立进行实验数据计算和处理，并对结果进行分析。理，并对结果进行分析。二、实验原理二、实验原理 植物种子在适宜的条件（水分，温度和氧气等）下，
2、植物种子在适宜的条件（水分，温度和氧气等）下，吸水膨胀萌发，在各种酶的催化作用下，发生一系列的吸水膨胀萌发，在各种酶的催化作用下，发生一系列的生理、生化反应。但是当有污染物存在时，污染物会抑生理、生化反应。但是当有污染物存在时，污染物会抑制一些酶的活性，从而使种子萌发受到影响，破坏发芽制一些酶的活性，从而使种子萌发受到影响，破坏发芽过程，因此，通过测定种子发芽情况，可以预测和评价过程，因此，通过测定种子发芽情况，可以预测和评价环境污染物对植物的潜在毒性和生物有效性。环境污染物对植物的潜在毒性和生物有效性。三、实验材料及药品三、实验材料及药品：培养皿；发芽床；滤纸培养皿；发芽床；滤纸 ；小白菜；
3、小白菜种子（小麦）；温度计、种子（小麦）；温度计、标签纸标签纸 ；分析纯氯化铜；分析纯重铬酸钾；蒸分析纯氯化铜；分析纯重铬酸钾；蒸馏水。馏水。四、实验步骤（四、实验步骤（8989人人/组）组）1.1.取取5 5只培养皿，铺上只培养皿，铺上2 2层滤纸，分别编号层滤纸，分别编号1 1、2 2、3 3、4 4、5 5。2.2.用蒸馏水将氯化铜原液用蒸馏水将氯化铜原液（500mg/l500mg/l）逐级稀释逐级稀释100mg/l100mg/l、200mg/l200mg/l、300mg/l300mg/l和和500mg/l500mg/l，将重铬酸钾原液，将重铬酸钾原液（1200mg/l1200mg/l）
4、逐级稀释逐级稀释200mg/l200mg/l、500mg/l500mg/l、800mg/l800mg/l和和1200mg/l1200mg/l。分别获得。分别获得4 4种不同浓度的污染液。种不同浓度的污染液。3.3.向向1 1、2 2、3 3、4 4号培养皿分别加入号培养皿分别加入10ml10ml（15ml15ml）的不同）的不同浓度的氯化铜（或重铬酸钾）染液（浸湿滤纸即可），浓度的氯化铜（或重铬酸钾）染液（浸湿滤纸即可），5 5号培养皿加入等体积的蒸馏水作为对照。号培养皿加入等体积的蒸馏水作为对照。4.4.挑选籽粒饱满、大小一致的小白菜种子，在每只培挑选籽粒饱满、大小一致的小白菜种子，在每只培
5、养皿的滤纸上，均匀放置养皿的滤纸上，均匀放置5050粒小白菜种子。粒小白菜种子。5.5.将将5 5只培养皿置于只培养皿置于2525、相对湿度、相对湿度75%75%、光照条件下、光照条件下的恒温培养箱中培养；每天各实验组、对照组补充的恒温培养箱中培养；每天各实验组、对照组补充5ml5ml蒸馏水，以保持滤纸的湿润。蒸馏水，以保持滤纸的湿润。6.6.发芽势与发芽率的计算，在第发芽势与发芽率的计算，在第3 3天（对照组发芽良好天（对照组发芽良好时）测定记录小白菜种子发芽情况。时）测定记录小白菜种子发芽情况。发芽势（发芽势（%）=规定天数内已发芽的种子粒数规定天数内已发芽的种子粒数/供作发芽的种子总供作
6、发芽的种子总粒数粒数100100发芽率发芽率(%)(%)=全部发芽的种子粒数全部发芽的种子粒数/供作发芽的种子总粒数供作发芽的种子总粒数100%100%发芽势与发芽率的区别发芽势与发芽率的区别v种子的发芽率是指在足够的时间内，正常发芽的种子占全部供试种子的百分数。v发芽势则是在规定的时间内，发芽种子占供试种子的百分数。发芽势能表示种子发芽能力的强弱和种子发芽的整齐度。所以，发芽势是鉴定种子生活力的重要指标。五、注意事项：五、注意事项：1.1.种子发芽后应具备的特征：幼芽长度不短种子发芽后应具备的特征：幼芽长度不短于种子长度的于种子长度的1/21/2，为具有发芽能力的种子，为具有发芽能力的种子，
7、以此标准进行观察，计数。以此标准进行观察，计数。2.2.发芽势与发芽率的计算，于第发芽势与发芽率的计算，于第3 3天测定记录天测定记录小白菜种子发芽的情况，将感染霉菌的种小白菜种子发芽的情况，将感染霉菌的种子要及时除去。子要及时除去。六、实验报告要求六、实验报告要求1.1.根据实验要求，在实验时间内到实验室记根据实验要求，在实验时间内到实验室记录实验数据。报告要求准确、美观。录实验数据。报告要求准确、美观。2.2.实验报告：种子名称，每种浓度处理的种实验报告：种子名称，每种浓度处理的种子数，培养条件污染物的每种浓度处理制子数，培养条件污染物的每种浓度处理制组和对照组的发芽率和发芽势的平均值。组
8、和对照组的发芽率和发芽势的平均值。3.3.对试验结果进行分析讨论。对试验结果进行分析讨论。温度胁迫对生物（植物）的影响温度胁迫对生物（植物）的影响 一、实验目的和意义一、实验目的和意义 不良环境（如高温或低温）对生物的正不良环境（如高温或低温）对生物的正常生存会产生不良的影响。植物在遭遇高温、常生存会产生不良的影响。植物在遭遇高温、低温时，原生质膜的半透性消失，对物质的低温时，原生质膜的半透性消失，对物质的透性发生改变，有机质或盐类从细胞中渗出，透性发生改变，有机质或盐类从细胞中渗出，进入周围环境中。通过进入周围环境中。通过电导度的测量和糖的电导度的测量和糖的显色反应，显色反应，可以测知物质的
9、外渗程度，以了可以测知物质的外渗程度，以了解植物受害的情况，并可对不同植物对高、解植物受害的情况，并可对不同植物对高、低温的耐性程度做出判断。低温的耐性程度做出判断。二、仪器以及材料二、仪器以及材料 电导仪，分光光度仪，冰箱，恒温培电导仪，分光光度仪，冰箱，恒温培养箱，移液管，试管，烧杯，电热板，叶养箱，移液管，试管，烧杯，电热板，叶片，蒽酮试剂，葡萄糖片，蒽酮试剂，葡萄糖三、实验方法及步骤三、实验方法及步骤1 1、样品的制备、样品的制备 将植物叶片清洗干净，再用蒸馏水漂洗将植物叶片清洗干净，再用蒸馏水漂洗干净后，用打孔器打取叶片。然后以干净后，用打孔器打取叶片。然后以1010片为片为一组，共
10、三组，分别放在盛有一组，共三组，分别放在盛有20ml20ml蒸馏水的蒸馏水的烧杯中，将叶片浸入蒸馏水中，分别放在烧杯中，将叶片浸入蒸馏水中，分别放在 4545温箱和温箱和00的冰箱中培养的冰箱中培养.2 2、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制 取标准葡萄糖溶液稀释成浓度为取标准葡萄糖溶液稀释成浓度为0 0、5 5、1010、2020、4040、6060、8080、100ug/ml100ug/ml。在波长。在波长625nm625nm处处测其吸光度。得出测其吸光度。得出吸光度吸光度 糖浓度糖浓度曲线。曲线。3 3、样品的测定、样品的测定 培养培养2h2h后取出，达到室温后后取出，达到室温后（可用常温水
11、浴）。（可用常温水浴）。（1 1）电导度的测定）电导度的测定：用电导仪分别测量每一用电导仪分别测量每一小杯中溶液的电导度，记录。小杯中溶液的电导度，记录。（2 2）蒽酮反应：）蒽酮反应：另吸取溶液另吸取溶液1mL1mL于干净的试管于干净的试管中，再加蒽酮试剂中，再加蒽酮试剂5mL5mL，摇匀，于沸水中煮，摇匀，于沸水中煮15min15min，将试管取出冷却，将试管中溶液用分，将试管取出冷却，将试管中溶液用分光光度仪在波长光光度仪在波长625nm625nm处测定，并从标准曲线处测定，并从标准曲线上查得滤液中的糖含量。同时以蒸馏水作同样上查得滤液中的糖含量。同时以蒸馏水作同样测定进行比较。测定进行
12、比较。处理处理电导度电导度蒽酮反应蒽酮反应45450 20 2室温室温 1.学习水中细菌总数测定的方法；2.了解水源水的平板菌落计数的原则。平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经培养，由每个单细胞生长繁殖形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落代表样品中一个单细胞。据形成的菌落数计数，换算出水中细菌总数（近似值）。优点：传统计数方法，对设备要求不高。是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。1 1、水样的采取、水样的采取（1 1）自来水：将水
13、龙头洗净，并开放水龙头）自来水：将水龙头洗净，并开放水龙头使水流使水流2min2min后，以灭菌的三角瓶接取水样，后，以灭菌的三角瓶接取水样，以待分析。以待分析。（2 2）待测水样（池水、河水或湖水）：应取）待测水样（池水、河水或湖水）：应取距水面距水面10-15cm10-15cm的深层水样的深层水样.2 2、细菌总数的培养、细菌总数的培养（1 1）自来水）自来水：用灭菌吸管吸取用灭菌吸管吸取lmllml水样，注入灭菌培养皿中水样，注入灭菌培养皿中(共做两皿共做两皿)分别倾注约分别倾注约15mL15mL己溶化并冷却到己溶化并冷却到4545左右的牛肉膏蛋白左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌
14、上摇匀，使水样与培养基充胨琼脂培养基，并立即在桌上摇匀，使水样与培养基充分混匀。分混匀。待培养基凝固后，倒置于待培养基凝固后，倒置于37 37 温箱中，培养温箱中，培养24h24h，进行，进行菌落计数。菌落计数。两个平板的平均菌落数即为两个平板的平均菌落数即为lmllml自来水水样的细菌总数。自来水水样的细菌总数。(2)(2)池水、河水或湖水等池水、河水或湖水等 稀释水样稀释水样:取取3 3支灭菌的空试管（支灭菌的空试管（1 1号、号、2 2号、号、3 3号）号）分别加入分别加入9ml9ml灭菌水。取灭菌水。取1ml1ml水样注入水样注入1 1号管内，摇号管内，摇匀，再自匀，再自1 1号管取号
15、管取1ml1ml移至移至2 2号管灭菌水内，以此类号管灭菌水内，以此类推，则稀释度分别为推，则稀释度分别为1010-1-1 、1010-2-2 、1010-3-3，每个稀释，每个稀释度做度做2 2皿。皿。稀释倍数要看水样污浊程度而定以培养后平皿稀释倍数要看水样污浊程度而定以培养后平皿的菌落数在的菌落数在3030300300个之间的稀释度最为合适，若个之间的稀释度最为合适，若3 3个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。则需继续稀释或减小稀释倍数。自最后3个稀释度的试管中各用灭菌吸管吸取lml稀释水，注入灭菌培养皿中。每
16、一稀释度做两个平皿。分别倾注约15mL己溶化并冷却到45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上摇匀。培养基凝固后，倒置于37温箱中，培养24h，进行菌落计数。3、计数：培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度2个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中总活菌数=同一稀释度2次重复的菌落平均数稀释倍数注意事项:1.样品充分混匀，稀释时一个稀释度要换一支无菌移液管（放菌液时，吸管尖不要碰到液面）2.由于细菌易吸附玻璃器皿表面，菌液加入后应尽快倒培养基，立即摇匀；3.倾注平板时的培养基温度冷却至45左右。4.计数时，30300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。菌落平均数稀释倍数
17、即为细菌总数。5.同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊6.国家生活饮用水卫生标准GB5749-85：细菌数（个/ml）100 总大肠菌群（个L）3 鱼类急性毒理实验鱼类急性毒理实验一、实验目的一、实验目的 通过本实验，熟悉和掌握鱼类急性毒性通过本实验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设计、条件、操作步骤，以及试验结试验的设计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析和报告等全过程果的计算、分析和报告等全过程。二、实验原理二、实验原理 鱼类对水环境的变化十分灵敏，运用毒鱼类对水环境的变化十分灵敏，运用毒理实验方法，观察理实验方法，观察鱼类在含有化学污染物的鱼类在含有化学污染物的水环境中的反应，水
18、环境中的反应，可以比较不同化学物质的可以比较不同化学物质的毒性高低。鱼类毒性实验方法可分为静态方毒性高低。鱼类毒性实验方法可分为静态方法和动态方法两大类。静态实验方法操作简法和动态方法两大类。静态实验方法操作简单，不需要特殊设备，适宜于受试化学物在单，不需要特殊设备，适宜于受试化学物在水中相对稳定，在实验过程中耗氧量较低的水中相对稳定，在实验过程中耗氧量较低的短期实验。本实验介绍静态实验方法短期实验。本实验介绍静态实验方法。三、实验器材三、实验器材 20002000或或10001000毫升烧杯、重金属盐毫升烧杯、重金属盐（重铬酸钾（重铬酸钾K K2 2CrCr2 2O O7 7）、小金鱼）、小
19、金鱼(观赏鱼观赏鱼红裙红裙)、小渔网。、小渔网。四、实验步骤四、实验步骤 1 1、实验液的配置：、实验液的配置：用质量浓度为4000mg/L的K2Cr2O7原液，配置成2680、180、280、400、600mg/L（200、245、300、367、450mg/L）5个不同浓度梯度的药液900ml、分别装入1000ml的烧杯中。（所选择的浓度应包括有使实验鱼在24h内死亡的浓度，以及96h内不发生中毒的浓度）2 2、实验鱼的放入、实验鱼的放入：先把药液与水在烧杯内均匀混合后，再放入实验鱼（禁止先放入实验鱼后往实验缸中加受试药液，以免实验鱼接触到不均匀的高浓度的药液而提前死亡).实验鱼必须健康，
20、实验前应在实验条件下驯养，驯养期间每天投饵一次、换水12次。实验前一天停止投饵，但96h以上的实验鱼每天应给予少量不影响水质的饵料。实验前4天要求驯养缸中鱼最好不出现死亡，即使有死亡，也不得超过10%，否则不能用于正式实验。3 3、结果的观察、结果的观察 实验开始后3h进行连续观察并做好记录，3h后可做6h、12h、24h、48h的详细观察记录（实验至少进行24h，一般96h）。实验过程中发现有特殊变化应随时记录（包括鱼的死亡率和由于中毒而引起的鱼的生化、生理以及形态学、组织学的变化，如：不爱动、食欲不好、呼吸微弱以及身体不平衡等症状）鱼死亡的判断方法：鱼死亡的判断方法：当鱼中毒停止呼吸以后，
21、用小镊子夹鱼尾柄部，5min内不出现反应可判定为死亡。死亡鱼必须移出实验缸，以免影响水质。实验过程应记录不同时间段各组鱼的死亡数。注意事项注意事项：实验水的温度、pH值、溶解氧、硬度和水量的合理与否，对实验结果影响较大，必须严格控制，一般淡水鱼的水质要求如下：.水温：实验中应保持鱼类原来适应的环境，温水鱼2028，冷水鱼1218，在同一实验中，温度的波动范围不要超过2。.pH：6.78.5 .溶解氧：4.0mg/L.水量：每克鱼体重供水0.5 L以上。通常在软水中进行。可采用自然界的江、河、湖水，如果用自来水，则必须进行人工曝气或放置3天以上脱氯。化学物质急性毒性分级化学物质急性毒性分级 依据
22、LC50值的大小，可以将化学物质的急性毒性分为剧毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5级。鱼类急性毒性实验毒性分级标准鱼类急性毒性实验毒性分级标准 鱼起始鱼起始LC50LC50（mg/Lmg/L）1 11 1100100100100100010001000100010000100001000010000毒性分级毒性分级剧毒剧毒高毒高毒中等毒中等毒低毒低毒微毒（无微毒（无毒毒半致死浓度的计算半致死浓度的计算 在水生生物急性毒性试验中，半数致死浓度（LC50）常用来表示化学物质或工业废水对水生生物的急性毒性。计算方法有多种，这里介绍常用的直线内插法。所谓直线内插法，即是根据两个或多个试验浓度组的动物死亡百
23、分数作一浓度死亡反应线，内插所要求的一个数值。因此，用直线内插法求半数致死浓度时，在试验设置的浓度组中必须至少存在这样两个浓度：一个要能引起50%以上的试验动物死亡，另一个出现的死亡率则要低于50%v用用直线内插法直线内插法求求LC50LC50时，在时，在半对数坐标纸半对数坐标纸上，以上，以对数轴表示试验溶液的浓度，算术坐标表示试验对数轴表示试验溶液的浓度，算术坐标表示试验动物的死亡百分数，绘出与试验所得数据相应的动物的死亡百分数，绘出与试验所得数据相应的各点。将死亡率各点。将死亡率50%50%上下的两点做一直线，再自所上下的两点做一直线，再自所作直线与作直线与50%50%死亡线的交点作一垂直
24、于纵轴的垂线，死亡线的交点作一垂直于纵轴的垂线，该垂线与纵轴的交点即为所求的半致死浓度。如该垂线与纵轴的交点即为所求的半致死浓度。如无半对数纸，也可用方格纸代替，但应先将浓度无半对数纸，也可用方格纸代替，但应先将浓度作对数转换，然后以纵轴表示之。垂线与纵轴的作对数转换，然后以纵轴表示之。垂线与纵轴的交点为交点为LC50LC50的对数，故需查反对数表才得半致死的对数，故需查反对数表才得半致死浓度。浓度。vCrCr质量浓度为质量浓度为450mg450mgL L时，时，6h6h后金鱼沿盆壁集中后金鱼沿盆壁集中分布，约分布，约10h10h后少量鱼侧卧不动，当受到刺激时，后少量鱼侧卧不动，当受到刺激时，
25、向前狂游一阵，然后又侧卧静止下来，向前狂游一阵，然后又侧卧静止下来，13 h13 h后开后开始出现死亡，始出现死亡，24 h24 h后死亡率达后死亡率达100100；质量浓度为；质量浓度为367 mg367 mgL L时，时，15h15h后出现死亡，后出现死亡，24h24h后死亡率为后死亡率为6060，72h72h后达后达100100；当质量浓度为；当质量浓度为200mg200mgL L时，时，48h48h内未出现不良反应，内未出现不良反应，72h72h后死亡率为后死亡率为1010，96h96h后达后达5050。v配置配置 5000mg5000mgL L重铬酸钾原液重铬酸钾原液1 1升升 编写
26、报告 在实验报告中应包括：试验名称、目的、试验原理、试验的准确起止日期，还有如下几项：（1）试验鱼的种名、来源、体重、体长、健康和驯化 状况。（2）受试物质名称、来源物化性质和保存方法。（3）实验用水的来源、物化性质和实验前的处理等。（4）实验溶液的浓度与配置方法、实验温度。（5）实验条件，如容器形式、实验液的体积与深度、受试生物数目及负荷率。（6）实验开始后24h、48h、72h、96h时的LC50值，及 其毒性分级。实验五实验五 空气中空气中SOSO2 2对植物的影响对植物的影响 实验目的实验目的 通过通过SOSO2 2对植物叶片叶绿素对植物叶片叶绿素a,ba,b 含量比例含量比例的影响，
27、认识环境污染对植物的影响。的影响，认识环境污染对植物的影响。实验原理实验原理vSO2是大气中主要的污染物，植物对SO2是很敏感的，SO2随空气进入叶内，当空气中SO2超过一定值时，叶子就会表现出一定的伤害症状，其中之一是叶绿素a、b含量比例发生变化，因此，测定植物叶绿素a、b含量比例关系的变化即可检测大气污染程度。v叶绿素a、b对不同波长辐射的最大吸收峰分别位于663nm和645nm，同时在该波长的叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，我们可根据Lamber-Beer定律，列出浓度C与光密度D之间的关系：D663=82.04Ca+9.27CbD663=82.04Ca+9.27Cb(1)(1)D64
28、5=16.75Ca+45.6Cb D645=16.75Ca+45.6Cb(2)(2)(1)(2)(1)(2)式中的式中的D663D663、D645D645为叶绿素溶液在为叶绿素溶液在波长为波长为663nm663nm和和645nm645nm的光密度，的光密度，CaCa、CbCb为叶绿为叶绿素的浓度，单位为每升毫克数。素的浓度，单位为每升毫克数。82.0482.04、9.279.27为为叶绿素叶绿素a a、b b在波长在波长663nm663nm时的比吸收系数，时的比吸收系数，16.7516.75、45.645.6为为叶绿素为为叶绿素a a、b b在波长在波长645nm645nm时的时的比吸收系数比
29、吸收系数.解方程解方程(1)(2)(1)(2)：Ca=12.7 D663 Ca=12.7 D663 2.69D645 2.69D645（3 3）CbCb=22.9 D645 =22.9 D645 4.68D663 4.68D663（4 4）v 因此，用丙酮（新鲜材料用无水丙酮）因此，用丙酮（新鲜材料用无水丙酮）提取叶绿素后分别在提取叶绿素后分别在663nm663nm和和645nm645nm处测定提处测定提取液的光密度后可求得叶绿素的浓度取液的光密度后可求得叶绿素的浓度CaCa、CbCb，便可计算其比例。便可计算其比例。实验仪器及材料实验仪器及材料 植物叶片（受植物叶片（受SOSO2 2污染和未
30、污染的）、污染和未污染的）、浓硫酸，亚硫酸钠、丙酮、分光光度仪、浓硫酸，亚硫酸钠、丙酮、分光光度仪、研钵、研钵、烧杯、漏斗、移液管等烧杯、漏斗、移液管等实验步骤及方法实验步骤及方法1.1.分别剪取两种处理植物的新鲜叶样分别剪取两种处理植物的新鲜叶样0.50.5克，克，剪碎后放入研钵中，加入剪碎后放入研钵中，加入10ml10ml丙酮研磨成匀丙酮研磨成匀 浆，再加入浆，再加入15ml15ml丙酮继续研磨，过滤提取液，丙酮继续研磨，过滤提取液，用少量丙酮冲洗研钵及滤渣，将滤液定容至用少量丙酮冲洗研钵及滤渣，将滤液定容至50ml50ml。2.2.吸取滤液吸取滤液2ml2ml，加，加80%80%丙酮丙酮2ml2ml稀释，再用风稀释，再用风光光度仪于光光度仪于663nm663nm和和645nm645nm处测其吸光度，按处测其吸光度，按公式公式(3)(4)(3)(4)计算叶绿素计算叶绿素a a、b b的浓度，并计算的浓度，并计算其比例其比例 讨论与分析讨论与分析 根据实验测得的数据，比较污染植物和根据实验测得的数据，比较污染植物和对照植物的叶绿素对照植物的叶绿素a a、b b的比例有何差异，并的比例有何差异，并加以讨论加以讨论 分别求出分别求出2 2种叶绿素种叶绿素a a、b b含量比例，并含量比例，并对其分析。对其分析。
