1、第第1章章植物组织培养的基本技术植物组织培养的基本技术第一节第一节 实验室的设计实验室的设计一、植物组织培养实验室设计二、设备和仪器三、玻璃器皿及用具四、培养条件主要内容主要内容 一、一、植物组织培养实验室设计准备间准备间缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室实验室设计 在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作目的和规模以及需要哪些最基本的设备和条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模实验室的大小取决于工作的目的和规模：1.以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计 避
2、免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。准备室准备室缓冲间缓冲间培养室培养室接种室接种室准备室主要工作主要工作：完成完成各种器具的洗涤、干燥、各种药品 贮备、称量、溶解、配制、培养基分装、培养基的灭菌等。主要设备：水池、工作台、高压灭菌锅、烘箱、药品柜、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器.缓冲室具体要求和工作具体要求和工作：面积5m2为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，以照射灭菌。无菌室(也叫接
3、种室，操作室)主要工作主要工作：用于植物材料的消毒、接种、培 养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。主要设备主要设备：紫外光源、超净工作台、显微镜、解剖镜、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。具体要求具体要求：接种室宜小不宜大，一般78平方米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装12盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。培养室主要工作：将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小
4、可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。具体要求具体要求：周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养室温度一般保持在2027左右，安装空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h。主要设备：培养架、空调机、除湿机、摇床、培养箱、紫外光源等。二、设备、仪器二、设备、仪器(一)大型设备和仪器 大多由铝合金制成，一般设5-7层，最低一层离地高约2Ocm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高2左右。培
5、养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，长1.3m，宽度一般为60cm。培养架培养架 用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所调指标。生化培养箱还配有光照装置。恒温培养箱恒温培养箱 超净工作台 用于培养物的无菌操作（由鼓风机、滤板、操作台、紫外灯和照明灯组成）。超净台分水平式和垂直式二种型号 用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重.用于干燥需保持80-100；进行干热灭菌需保持150，达1-3h；若测定干物重，则温度应控制在80烘干至完全干燥为止。烘 箱 高压灭菌锅类型：手提式高压灭菌锅立式高压灭菌锅作用：培养基、水和各种器皿的消毒v种类较多，用于分
6、离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。作用：作用：用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等药品精确度00001g。电子天平作用：测定培养基及酶制剂的值酸度计作用：低温保存材料，存放药品、培养基母液、激素、酶制剂。冰箱空空 调调 机机一般要保持在2327左右，具备产热装置，并安装吊式或立式空调机。1镊子类镊子类(forceps)常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型 2剪刀类剪刀类(scissors)可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。3.解剖刀解剖刀:切割较小
7、材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。4.解剖针解剖针:解剖针可深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶，可以自制。5.接种盘接种盘:组培瓶（玻璃）组培瓶（玻璃）-要求透光度好，能耐高压高温,以试管、三角瓶、培 养皿等使用较多。三角锥瓶三角锥瓶-适用于各种培养（如固体培养、液体培养、大规模培养或一般培养）。培养皿培养皿-适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。试管试管-适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用。在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化
8、学实验用的玻璃器。包括各种型号的烧杯、量筒、移液管、试剂瓶、容量瓶、试管以及移液管架、玻璃棒、滴瓶等。吸耳球、刷子、记号笔、定时钟、手套、封口膜、脱脂棉、拖鞋、口罩、白大褂、滤纸。湿度的影响包括培养容器内湿度的保持和环境的湿度条件。(三三)、湿度、湿度第二节 器具洗涤一、一、洗涤液洗涤液 洗涤液的种类很多，配制方法也不一样，可根据要求选择经济有效的洗涤液。常用的洗涤剂主要有肥皂、洗衣粉、洗洁精和铬酸洗涤液等。洗衣粉、洗洁精和肥皂均是很好的去污剂，对于带油脂太多的玻璃器皿，可先用其他洗涤液除污垢再用洗衣粉水等洗涤。二、各种器具的洗涤二、各种器具的洗涤 新器皿；新购置的玻璃器皿一般都有游离的碱性物
9、质，使用前要在1%的盐酸溶液中浸泡24h再清洗，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水洗23次彻底清洁后，烘干备用。用过器皿；用过后玻璃器皿如烧杯、试管和培养瓶等要先除去其残渣，清水冲洗后将器皿放入洗衣粉溶液中浸泡一段时间，然后涮去器皿内污物，如洗涤效果不好，可增加洗衣粉水浓度或适当加热，器皿内外都要刷到，再用水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一遍，干燥后备用。第三节 培养基及其配制主要内容主要内容 一、培养基成分 二、培养基的pH 三、培养基的种类、配方及其特点 在建立培养系统时，首先找到一合适的培养基。在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求的不断认识，对已有培养基的
10、改进，或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速发展，取得越来越多的成功。一、培养基成分 培养基成分培养基成分1、水和、水和琼脂琼脂2、大量元素大量元素3、微量元素微量元素4、铁盐铁盐5、有机质有机质 6、其它辅助性物质、其它辅助性物质7、植物、植物生长生长调节物质调节物质一、培养基成分 1、水、水 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。琼
11、脂琼脂(agar)(agar)作用作用：最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。特性特性：溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。浓度浓度：琼脂的用量在6-10gL之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。2、大量元素 大量元素就是人们平常所说在培养基中的浓度大于100mg/L的元素。在植物生命中具有非常重要的作用。如氮（N）、硫（S）、磷（P）是蛋白质、氨基酸、核酸和许多生物催化剂即酶的主要或重要组分。它们与蛋白质、氨基酸、核酸和
12、酶的结构、功能、活性等有直接的不可缺少的关系。氮占蛋白质含量的16%-18%，在植物生命活动中占有首要的地位，故又称为生命元素。磷在糖代谢、氮代谢、脂肪转变等过程中不可缺少。钾 对于参与活体内各种重要反应的酶起着活化剂的作用，钾供应充分时糖类合成加强，纤维素和木质素含量提高，茎秆坚韧，植株健壮。硫 氨基酸中都含有硫，这些氨基酸几乎是所有蛋白质的构成分子。钙钙:是细胞壁的组分之一，果胶酸钙是植物细胞胞间层的主要成分，缺钙时细胞分裂受到影响，细胞壁形成受阻，严重时幼芽、幼根会溃烂坏死。镁 是叶绿素分子结构的一部分，缺少镁，叶绿素就不能形成，叶子就会失绿，就不能进行光合作用。镁也是染色体的组成成分，
13、在细胞分裂过程中起作用。3、微量元素 B B，MnMn，ZnZn，CuCu，MoMo，CoCo等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。微量元素微量元素 指小于100mg/L的元素。MnMn 对糖酵解中的某些酶有活化作用。B B 影响植物的有性生殖如花器官的发育和受精作用。还具有抑制有毒的酚类化合物的形成的作用，改善某些植物组织的培养状况，缺硼时细胞分裂停滞，愈伤表现出老化现象。ZnZn 是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等的活化剂。CuCu 是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影响氧化还原过程。MoMo 是硝酸还原酶和钼铁蛋白的
14、金属成分。4、铁盐 铁铁 是一些酶（氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等）的重要组成成分，又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。但由于Fe的特殊性质，即很不稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常常把Fe盐单独配制，且以螯合物的形式存在。5、有机质有机质-糖糖 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。种类：种类：VB1(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)、VB3(烟酸
15、烟酸)、Vc(抗坏血酸抗坏血酸)，有时还使用生物素、叶酸、核黄素等。，有时还使用生物素、叶酸、核黄素等。浓度：浓度：0.11.0mg/L作用：作用：VB1促愈伤组织产生，提高活力促愈伤组织产生，提高活力 VB6 促根生长促根生长 VB3与代谢和胚发育有关与代谢和胚发育有关 Vc防组织褐变防组织褐变维生素维生素(vitamin)(vitamin)肌醇（环己六醇）肌醇（环己六醇）促进愈伤组织生长促进愈伤组织生长以及以及胚状体和芽的形成胚状体和芽的形成对组织细胞繁殖、分化的促进作用对组织细胞繁殖、分化的促进作用浓度浓度100 mg/L氨基酸氨基酸(aminoacide)是很好的有机氮源，可直接被细胞
16、吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。为了特殊的培养目的，在一部分培养基中还添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西红柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁等天然复合物以及活性炭，渗透调节剂等。6、其它辅助性物质、其它辅助性物质 1)椰乳椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10-20 在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。2)香蕉香蕉 浓度：150-200ml/l。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有
17、促进作用。3)马铃薯马铃薯(potato)去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150-200gL。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。4)水解酪蛋白或水解乳蛋白水解酪蛋白或水解乳蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸（含有约20种氨基酸的混合物）使用浓度为100-200mgL。受酸和酶的作用易分解。5)其他其他 酵母提取液(YE)(0.01-0.05)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(001-05)苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。6)6)其它辅助性物质其它辅助性物质A.抗生物质B.抗氧化物C.活性炭A A、抗生物质、抗生物质(an
18、tibiotic)(antibiotic)种类种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等用量：5-20mgL。作用：防止菌类污染，减少培养中材料的损失。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5-10的抗菌素。注意：抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，使用要慎重。B、抗氧化物(antioxide)酚污染植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。在木本，尤其是热带木本及少数草本
19、植物中较为严重。抗酚类氧化常用的药剂有抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及半胱氨酸及VcVc用量：50-200mgL的浓度方法：洗涤刚切割的外植体表面或过滤灭菌后加入 固体培养基的表层。其他抗氧化剂：二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯C、活性炭 主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，例如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。但活性炭对物质吸附无选择性、既吸有害物质，也吸附有利物质，因此使用时应慎重考虑，不能过量，一般用量为1%-5%。7 7、植物生长调节物质、植物生长调节物质植物激素是植物激素是指自然状态下植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量（1
20、毫克/升以下）有机物；植物生长调节剂植物生长调节剂是指一些具有植物激素活性的人工合成的物质。植植物物激激素素植植物物生生长长调调节节剂剂在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培养基中还添加赤霉素GA3等植物生植物生长长调节物调节物质质 种类IAANAAIBA2,4D 作用诱导愈伤组织形成和根分化，促进细胞分裂和伸长生长。根对生长素最敏感，在极低浓度下(10.5-10.8mgL)就可促进生长，其次是茎和芽。浓度0.055mg/L，(1)、生长素类、生长素类(auxin)植物生长调节物质植物生长调节物质生长素生长素天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破
21、坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。生长素配制可先用少量95酒精助溶。2，4-D可用01molL的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。植物生长调节物质植物生长调节物质生长素生长素植物生长调节物质植物生长调节物质生长素生长素IAA(IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA(NAA(萘乙酸萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易
22、被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。植物生长调节物质植物生长调节物质生长素生长素IBA(IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2 2，4-D(24-D(2，4-4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。(2)、GA(赤霉素赤霉素)种类：种类：有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。培养基中添加的是培养基中添加的是GAGA3 3。作用：作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；
23、特性：特性：赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70-100失效，应当采用过滤灭菌法加入。植物生长调节物质植物生长调节物质赤霉素赤霉素植物生长调节物质植物生长调节物质细胞分裂素细胞分裂素(3)(3)、细胞分裂素类细胞分裂素类(cytokinin)(cytokinin)这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA、Kt、玉米素ZT等。其中ZT活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。细胞分裂素使用浓度：0.05-10mgL。培养基的成分培养基的成分细胞分裂素细胞分裂素在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内
24、细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂与扩大。细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，抑制根的分化。避免在生根培养时使用。二、培养基的PH值 不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同，5.8能适应大多数植物培养的需要。PH值因材料而异，也因培养基的组成而不同。它的大小可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl来调整。但要注意两点：第1、经高温高压灭菌后，培养基的PH值会下降0.2-0.8。第2、PH值的大小会影响琼脂的凝固能力，当PH值大于6时，培养基将会变硬，低于5时，琼脂不能很好的凝固。不同的植物不同的植物不同培养部位不同培养部位 不同的培养目的不
25、同的培养目的 三、培养基的种类、配方及其特点 培养基多数以发明人的名字来命名培养基多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。改良培养基。需选用不同需选用不同的培养基的培养基（一）培养基种类据其态相分：固体培养基、液体培养基据其作用分：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基据营养水平分：基本培养基、完全培养基据培养物的培养过程分：初代培养基、继代培养基 培养基的种类培养基的种类培养基种类培养基种类固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基通气性较好，便于操作，通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长但营
26、养分布不均，生长发育不整齐。发育不整齐。营养分布均匀，生长营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性整齐一致，但通气性差。差。基本基本培养基种类培养基种类MS培养基培养基1962B5培养基培养基1968White培养基培养基1937N6培养基培养基 1975KM-8P培养基培养基1974Miller培养基培养基1965Nitsch培养基培养基1963WPM培养基培养基19331962年由年由Murashige和和Skoog为培养烟草细胞而设为培养烟草细胞而设计的。计的。v无机盐离子无机盐离子 浓度高，硝酸盐含量较高浓度高，硝酸盐含量较高v 用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养用于植物的器官、花药
27、、细胞和原生质体培养MSMS培养基及特点培养基及特点:1968年由年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设等为培养大豆根细胞而设计的。计的。v含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。制作用。v双子叶植物双子叶植物 尤其木本植物组培可选择尤其木本植物组培可选择B5B5培养基及特点培养基及特点：WhiteWhite培养基特点培养基特点：19371937年由年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计的，为培养番茄根尖而设计的，19431943年随其专著的出版而问世。年随其专著的出版而问世。19631963年又作了改年又作了改良，称作良，称作Whi
28、teWhite改良培养基，提高了改良培养基，提高了MgSOMgSO4 4的浓度的浓度和增加了硼素。和增加了硼素。v 无机盐数量较低无机盐数量较低v 适于生根培养。适于生根培养。N6N6培养基特点培养基特点：1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。花药培养而设计的。v 成分较简单，成分较简单，KNO3 和和(NH4)2SO4含量高含量高v 适合花药培养适合花药培养 KM-8PKM-8P培养基特点：培养基特点：1974年为原生质体培养而设计的。年为原生质体培养而设计的。v有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素
29、，v广泛用于原生质体培养，包括融合的培养。广泛用于原生质体培养，包括融合的培养。合适培养基的选择：基本培养基；各种激素的浓度与配比 MS MS 培养基适合于大多数双子叶植物；B5B5和和N6 N6 培养基适合于许多单子叶植物；White White 培养基适合于根的培养；首先试用这些培养基进行初步实验，在基本培养基确定之后，进行不同种类激素浓度和激素间相互比例的配合试验。合适培养基的选择合适培养基的选择培养基的制备培养基的制备母液的配制和保存 经常使用的培养基，可先将各种药品配成浓缩一定倍数的母液，放入冰箱内保存，用时再按比例稀释。母液要根据药剂的化学性质分别配制。一般配成大量元素、微量元素、
30、铁盐、维生素、氨基酸等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。大量元素的母液可以配制成10倍、20倍。微量元素可配成50或100倍浓度的混合母液。KI可以单独配成母液。培养基的制备培养基的制备母液的配制和保存 铁盐也容易发生沉淀，需要单独配制。一般硫酸亚铁（FeSO47H2O）和乙二胺四乙酸钠（Na2EDTA）配成100倍浓度的铁盐螯合剂比较稳定，不易沉淀。氨基酸可以和维生素一起配成100或200倍液，也可将它们中的几种有机成分分别配制。植物生长调节物质也可以分别配制成母液，储存于冰箱。一般浓度为0.11mgml。IAA、NAA、IBA、2,4-D之类生长素，可先用少量0.lm
31、ol/L的HCl 或95的酒精溶解，KT、BA等细胞分裂素则可用少量0.lmol/l的NaOH加热溶解，然后加水定容。以MS培养基为例-大量元素母液配制 母液 化合物名称 培 养 基用量（mg/L）扩大倍数 称取量(mg)母液体积(mL)1L培养基吸 取 母 液量（mL）大量元素 KNO3NH4NO3MgSO47H2OKH2PO4CaCl22H2O1,9001,6503701704401019,00016,5003,7001,7004,4001000100 以MS培养基为例微量元素母液配制 母液 化合物名称 培养基用量mg/L）扩大倍数 称 取量mg)母 液体 积(mL)1L培养基吸取母液量（
32、mL）微量元素 MnSO44H2OZnSO47H2OH3BO3KINa2MoO42H2OCuSO45H2OCoCl26H2O22.38.66.20.830.250.0250.0251002,23086062083252.52.5100010 以MS培养基为例铁盐与有机物母液配制 母液 化合物名称 培养基用量（mg/L）扩大倍数 称取量(mg)母液体积(mL)1L培养基吸取 母 液 量（mL）铁盐 Na2-EDTAFeSO47H2O 37.3 27.8100 3730 27801000 10有机物甘氨酸VB1VB6烟酸肌醇2.00.10.50.5100 10 201551,000100 10 培
33、养基的制做方法培养基的制做方法 将配制好的母液按顺序排列，先取适量的蒸馏水放入容器，然后依次用专用的移液管按需要量吸取各种母液，并混合在一起。再将琼脂（事先加热溶解）和糖加入其中，最后加蒸馏水定容至所需体积。随即用0.lmol/l的NaOH和HCl将pH调至所需的数值，然后分装到培养瓶中。培养基的pH大多数植物都要求在pH5.65.8 计算：制做计算：制做3L3L MS+6-BA2mg/l+NAA0.1mg/l+MS+6-BA2mg/l+NAA0.1mg/l+蔗糖蔗糖3%+3%+琼脂琼脂0.6%0.6%需要母液各多少？需要母液各多少？大量元素母液（10倍）？微量元素母液（100倍）？铁盐母液
34、（100倍）？有机物质母液（100倍）？6-BA母液 (1mg/ml)？NAA母液 (0.1mg/ml)？蔗糖？琼脂？培养基的灭菌 培养基一般采用湿热灭菌法，温度为121-123，维持20min，即可达到灭菌的目的。若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。但时间过短，不能保证灭菌的效果，易引起培养基污染。培养基储藏在410的条件下。培养基蒸气灭菌所需的最少时间培养基蒸气灭菌所需的最少时间 容积/容器（ml）在121下所需要灭菌时间 205015min7520min25050025min100030min150035min200040min123456 第四节第四节 外植体的选择与培养外
35、植体的选择与培养 一、外植体的选择 二、外植体的灭菌 三、外植体的接种和培养 四、外植体的成苗途径 主要内容主要内容 植物体的各个部位，如根、茎（鳞茎、茎段）、叶（子叶、叶片）、花瓣、花药、胚珠、幼胚、块茎、茎尖、维管组织、髓部等都可以做为外植体。植物种类不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理状态，对外界诱导反应的能力及分化再生能力是不同的。选择适宜的外植体需要从植物基因型、外植体来源、植物基因型、外植体来源、外植体大小、取材季节及外植体发育年龄外植体大小、取材季节及外植体发育年龄等方面加以考虑。一、一、外植体的选择外植体的选择 植物基因型不同，组织培养的难易程度不同。草本植物比木本植物易于
36、通过组织培养获得成功，双子叶植物比单子叶植物易于组织培养。木本植物中，猕猴桃较易再生植株；松树、柏树等就比较困难。植物基因型不同，组培再生途径也不同。如十字花科及伞形科中的胡萝卜、芥菜、等易于诱导胚状体。茄科中的烟草、番茄、曼陀罗，易于诱导愈伤组织。植物基因型植物基因型一、一、外植体的选择外植体的选择 生长健壮无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作为外植体，离体培养易于成功。因为，这部分器官或组织代谢旺盛，再生能力强。同一植物不同部位之间的再生能力差别较大，如同一种百合鳞茎的外层鳞片比内层鳞片再生能力强，下段比中段、上段再生能力强。因此，最好对所要培养的植物各部位的诱导及分化能力进行比较，
37、从中筛选合适的、最易再生的部位作为最佳外植体。外值体来源外值体来源一、一、外植体的选择外植体的选择 对大多数植物来说，茎尖是较好的外植体，由于茎形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重要途径，如月季、兰花、大丽花、非洲菊无病毒苗的生产等。但茎尖往往受到材料来源的限制，为此可以采用茎段、叶片等作为培养材料，如菊花、各种观赏秋海棠、黄花夹竹桃等。另外，还可根据需要选择鳞茎。（如麝香百合），花茎或花梗（如蝴蝶兰），花瓣、花蕾（如君子兰），根尖（如雀巢兰属），胚（垂笑君子兰），无菌实生苗（吊兰）等部位作为外植体进行离体培养。一、一、外植体的选择外植体的选择 外植体的大小，应根据培养
38、目的而定。如果是胚胎培养或脱毒，则外植体宜小；如果是进行快速繁殖，外植体宜大。但外植体过大，杀菌不彻底，易于污染；过小离体培养难于成活。一般外植体大小在0.51.cm为宜。具体说叶片、花瓣等约为0.5cm2，茎段则长约 0.5cm，茎尖分生组织带一两个叶原基 0.20.3 mm大小等。一、一、外植体的选择外植体的选择外值体大小外值体大小 离体培养的外植体最好在植物生长的最适时期取材，即在其生长开始的季节里取样，若在生长末期或已经进入休眠期取样，则外植体会对诱导反应迟钝或无反应。如苹果芽在春季取材成活率为 60，夏季取材下降到 10，冬季取材在 10以下。百合鳞片外植体，春、秋季取材易形成小鳞茎
39、，夏、冬季取材培养，则难形成小鳞茎。一、一、外植体的选择外植体的选择取材季节取材季节 外植体的生理状态和发育年龄直接影响离体培养过程中的形态发生。一般认为，沿植物的主轴，越向上的部分所形成的器官其生长的时间越短，生理年龄也越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官；反之越向基部，其生理年龄越小。如在烟草的培养中，植株下部组织产生营养芽的比例高，而上部组织产生花器官的比例高。一般情况下，越嫩，年限越短的组一般情况下，越嫩，年限越短的组织具有越高的形态发生能力，组织培养越易成功。织具有越高的形态发生能力，组织培养越易成功。外值体的发育年龄外值体的发育年龄一、一、外植体的选择外植体的选择 外植体灭菌的
40、一般步骤 1预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌。2将植物组织块置于一个玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗三次。二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌外外植植体体消消毒毒 3.将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须把玻璃瓶摇动23次。4消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒
41、掉，重复34次。二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌植体灭菌的一般步骤植体灭菌的一般步骤 二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌 消 毒 剂使用浓度%去除难易消毒时间（min）效果次酸钙910易530很好次氯酸钠2.0易530很好过氧化氢1012最易515好氯化汞氯化汞0.11.0较难210最好最好溴水12易210很好硝酸银1.0较难530好抗生素450mg/L中3060较好常用灭菌剂的使用及其效果常用灭菌剂的使用及其效果 各种外植体的灭菌方法各种外植体的灭菌方法 （1）茎尖、茎段及叶片等的消毒 植物的茎、叶部分多暴露于空气中，有的具有茸毛、油脂、蜡质和刺等，在栽培上又受到泥、肥中的杂菌污染，所以消毒前
42、要经自来水较长时间的冲洗。消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗23次，然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度，分别采用2%10%的次氯酸钠溶液浸泡1025min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入几滴吐温-80，消毒后用无菌水冲洗3次后方可接种。二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌 （2）果实及种子的消毒 根据清洁度，用自来水冲洗1020分钟，甚至更长时间。再用纯酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠溶液浸 10min后，用无菌水冲洗23次，就可取出果实内的种子或组织进行培养。种子则要先用10%次氯酸钠浸泡 2030min甚至几小时。对难以消毒的还可用0.l%升汞或1%2%溴水消毒5min。进行胚或胚
43、乳培养，对种皮太硬的种子，可先去掉种皮，再用4%10%的次氯酸钠溶液浸泡810min，经无菌水冲洗后，即可取出接种。二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌 （3）花药的消毒 用于培养的花药，实际上多未成熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒就可以了。一般用70%酒精浸泡数秒，然后用无菌水冲洗23次，再在漂白粉清液中浸泡10分钟，经无菌水冲洗23次即可接种。二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌 （4）根及地下部器官的消毒 根和地下部器官生长于土中消毒较为困难。除预先用自来水洗涤外，还应用软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。可采
44、用0.1%0.2%升汞浸510min或2%次氯酸钠溶液浸1015min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接种。二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌总的来说有以下几点：（1）对植体进行修剪去掉不需要的部分。（2）在流水下进行对外植体表面灰尘冲洗。（3）用70%酒精浸1030秒不等杀死外植体表面的细菌。（4）用无菌水冲洗表面残余的酒精3-5遍.（5）用0.1%的氯化汞浸泡10分钟。（6）倒出氯化汞，用无菌水冲洗外植体3-5遍。（7）用滤纸进行吸干外植体之后进行切割。三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养 （一）无菌操作(接种工作)（二）外植体的培养 植物组
45、织培养的接种是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作过程，是一种无菌技术。整个操作的过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌。在操作过程中引起的污染，主要是由材料本身带菌和工作人员本身引起的。（一）无菌操作（一）无菌操作 三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养 植物组织培养技术实际上是一种无菌操作和无菌培养技术，做好接种室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子，因此，每次接种前半小时应进行地面的清洁卫生工作，并用70酒精喷雾使空气的灰尘沉降。用紫外线灯照射20分钟。接种前工作台面要用新洁尔灭或酒精
46、擦洗。（1 1）接种室的消毒）接种室的消毒三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养 （2 2）工作人员要求）工作人员要求 入无菌室前，要洗手。入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养换上工作服擦工作台酒精擦拭手 （3 3）材料的切取）材料的切取 切取和接种较大的材料肉眼观察即可操作分离，较小的材料需在双筒解剖镜下操作。分离工具一定要放好，切割动作要快，防止挤压使材料损伤而失败。接种时要防止交叉污染的发生，
47、通常在无菌滤纸上切取材料。将用过而已污染的滤纸继续使用，或已用过的工具未及时消毒而再继续使用，极易产生一连串的交叉污染现象。因此，刀和镊子等接种工具使用一次应放入95%的酒精中浸泡，然后灼烧放凉备用。三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养酒酒精精灯灯灼灼烧烧酒精擦拭培养皿酒精擦拭培养皿器械消毒器械消毒旋旋转转灼灼烧烧酒精擦拭酒精擦拭三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养 左手拿培养瓶在酒精灯前与水平面成45角，右手用镊子夹住外植体放在培养基上。外植体夹的不要过紧更不要过松。整个过整个过程要做到：准确、程要做到：准确、规范、规范、迅速迅速。茎尖、茎段等基部插入固体培养基中、叶片通常将
48、叶背接触培养基(极性)。镊子灼烧后放回支架，这时将封口膜在火焰上旋转的烧数秒钟，盖好瓶口，所有的材料接种完毕，包扎好包纸，作好标记，注明材料接种名称、接种日期。三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养 （二）外植体培养（二）外植体培养 温度：常保持在252 光照时数：大多数情况下为12-16h。（暗培养不需要光照，例如起始培养的前几天不需要光照）光照强度：10003000lx，白色荧光灯，光的作用是满足形态建成的需要（诱导）。相对湿度：培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当调整培养间湿度 三、外植体的接种和培养三、外植体的接种和培养 定期检查和细胞学观察定期检查和细胞学观察 进行培养的材
49、料，应定期检查，特别是接种后的37天内，要每天检查，主要是检查其污染情况，发现污染材料，应及时处理掉。没有污染的就是得到的无菌材料。如果它们能生长，增殖，并通过继代培养，就建立了无菌培养系。细胞学观察一般每隔35天观察一次，可用肉眼观察其形态变化，也可用显微镜进行观察，如平板培养可进行定点观察，液体培养可用倒置显微镜观察，观察到的结果及时记录。三、外植体的接种和培养 （1）在愈伤组织上同时长出芽和根，以后连成统一的轴状结构（较少），育成植株；（2）在愈伤组织中先形成茎，后诱导成根，再发育成植株；（3）在愈伤组织中先形成根，再诱导出芽，得到完整植株。但在培养中一般先形成根的，往往抑制芽的形成；而
50、相反，一般先产生芽的，则以后较易产生根。1 1外植体先形成愈伤组织，再分化成完整的植株。外植体先形成愈伤组织，再分化成完整的植株。四、外植体的成苗途径四、外植体的成苗途径 2 2胚状体发生胚状体发生 组织培养中再生植株可通过与合子胚相似的胚胎发生过程，即形成胚状体，再发育成完整植株。胚状体可以从以下几种培养物产生：直接从器官上发生；愈伤组织发生；从游离单细胞发生；从小孢子发生。四、外植体的成苗途径四、外植体的成苗途径 3 3外植体经诱导后直接形成根外植体经诱导后直接形成根与芽，发育成完整的植株与芽，发育成完整的植株 如茎尖、花芽、叶片、花托、鳞片等组织直接产生小苗，形成小苗（芽）之前也形成少量
