1、灭 菌工艺及灭菌设备验证黑龙江省所姜连阁 2013年1月p一般指没有活体微生物存在的药品。在药品制剂类别中，无菌药品也可称为无菌制剂p无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料p-药品生产质量管理规范（2010年修订）附录1.无菌药品 无菌药品基 本 概 念106 100（1）10-6（10-3）p无菌保证水平（Sterility Assurance Level）-SAL基 本 概 念p采用湿热灭菌法的采用湿热灭菌法的SAL不得大于不得大于10-6，即灭菌即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一后微生物存活的概率不得大于百万分之一p采用无菌生产的采用无菌生产的SAL不得大于不得大
2、于10-3p无菌生产工艺仅限于临床必需注射给药而确实无法耐无菌生产工艺仅限于临床必需注射给药而确实无法耐受终端灭菌的产品受终端灭菌的产品,适用于粉针剂或部分小容量注射剂适用于粉针剂或部分小容量注射剂pSAL定义定义-产品经灭菌产品经灭菌/除菌后微生物残存的除菌后微生物残存的概率。概率。p评价灭菌（无菌）工艺的效果，该值越小，评价灭菌（无菌）工艺的效果，该值越小，表明产品中微生物存在的概率越小。表明产品中微生物存在的概率越小。p无菌制剂主要有：1.注射剂2.植入剂、冲洗剂、眼内注射溶液、眼内插入剂3.供手术、伤口、角膜穿通伤用的眼用制剂，4.用于手术、创伤、烧伤或溃痒等的软膏剂、乳膏剂、气雾剂、
3、喷雾剂5.局部用散剂、耳用制剂、鼻用制剂、凝胶剂基 本 概 念p注射剂p药途径p特 点 基 本 概 念p直接进入组织或血液p吸收快p作用迅速可靠p注射液p注射用无菌粉末p注射用浓溶液p肌肉注射p静脉注射p注射剂与其他剂型相比 p无菌制剂,p质量要求高p生产过程控制严格p注射剂p-将药物制成无菌溶液、混悬液或临用前制成液体的无菌粉末供注入人体的制剂.p 是临床上使用广泛的制剂。p无菌p无热原p无不溶性微粒p高纯度 无菌药品特点基 本 概 念p微生物微粒p药物降解（氧化、水解）基 本 概 念过滤、消毒、灭菌工艺控制（PH、温度、时间、空气）注射剂生产的基本要求注射剂生产的基本要求p 合理的厂房、设
4、备、措施设计合理的厂房、设备、措施设计p 合格的人员合格的人员p 合理的生产方法、步骤和控制方法合理的生产方法、步骤和控制方法p 工艺验证和方法工艺验证和方法p 灭菌工艺验证灭菌工艺验证 生产场所生产场所 设施设施 设备设备 重要的支持系统重要的支持系统 原材料原材料 包装材料包装材料 产品设计产品设计 分析化验规程分析化验规程 仪器校准仪器校准 操作人员操作人员 验证过的工艺验证过的工艺 p硬 件p软 件p人 员真核微生物真核微生物原核微生物原核微生物病毒病毒有细胞结构有细胞结构微生物微生物无细胞结构无细胞结构p微生物-是指一类体积微小、结构简单，大多是单细 胞的，必须用光学显微镜观察形态的
5、微小生物的通称。三型三型 八大类八大类 特点特点 无细胞结构 病毒（亚病毒和朊粒）无细胞结构，结构最简单，体积最微小，能通过细菌滤器；由单一核酸（DNA或RNA）和蛋白质外壳组成；必须寄生在活的易感细胞内生长繁 殖。原核细胞细菌放线菌螺旋体支原体衣原体立克次体 仅有原始核，无核膜、无核仁，染色体仅为单个缺乏完整的细胞器。真核细胞 真菌 细胞核分化程度较高，有典型的核结构（有核膜、核仁、多个染色体，由DNA和组蛋白组成）；通过有丝分裂进行繁殖；胞浆内有多种完整的细胞器。p个体小，作用大。个体小，作用大。p分布广，种类多。分布广，种类多。p生长繁殖快，代谢强。生长繁殖快，代谢强。p易变异。易变异。
6、微生物基础知识微生物基础知识微生物生物学特征微生物生物学特征20min植物叶子表面附生微生物-皮肤上含细菌-洗过后几小时之内-人的肠道内微生物-粪便中细菌-一般人每个喷嚏的飞沫-感冒患者一个喷嚏-微生物基础知识简介微生物基础知识简介约100万个/克。约10万个/cm2恢复到原来的数量约100万亿大约占粪便干重的1/3含4500-150000个含8500万个（有传染性）微生物无处不在常见微生物微生物基础知识简介种类种类基本特点基本特点生长条件细菌0.5 5 m，生长态时不耐热，部分能形成耐热芽孢.30-35 oC,1-2天天真菌5 m 50 m，形成芽孢随空气扩散，不耐热,但难用消毒剂消毒但难用
7、消毒剂消毒20-25oC,3-5天天病毒小于0.1 m，一般不耐热，0.22m过滤不了微 生 物 分 布 特 点G+G-p气源性微生物革兰氏阳性菌较多气源性微生物革兰氏阳性菌较多p可形成芽孢，难以杀灭可形成芽孢，难以杀灭p药品生产需要药品生产需要HVACp水源性则革兰氏阳性菌居多p不会生成孢子，会形成细菌内毒素p耐热性差p微生物的芽孢，并不是繁殖的手段，而是休眠体。p生物指示剂均为革兰氏阳性菌，灭菌用BI为非致病菌。细菌芽胞的形成及其特性成熟芽孢孢子壁母细胞孢子壁的形成生长态细胞摘自摘自 http:/www.microbe.org/microbes/spores.asp内生孢子内生孢子产生于产
8、生于 Gram+细菌细菌:芽孢杆菌属芽孢杆菌属Bacillus 梭菌属梭菌属Clostridium 仅含核酸及少量萌发必需物，皮层含仅含核酸及少量萌发必需物，皮层含DPA和和Ca2+复合物，能抵御各种复合物，能抵御各种恶劣环境，可休眠上百万年。真菌孢子因不具上述特性，而不耐热。恶劣环境，可休眠上百万年。真菌孢子因不具上述特性，而不耐热。（DPA：吡啶二羧酸：吡啶二羧酸）p常用的灭菌方法二种：物理灭菌法和化学灭菌法常用的灭菌方法二种：物理灭菌法和化学灭菌法p物理灭菌技术物理灭菌技术是利用蛋白质与核酸具有遇热、射线不稳定的特性，采用加热、射线和过滤方法，杀灭或除去微生物的技术称为物理灭菌法，亦称物
9、理灭菌技术。该技术包括该技术包括干热灭菌、湿热灭菌干热灭菌、湿热灭菌、除菌过滤法和辐射灭菌除菌过滤法和辐射灭菌等。p化学灭菌法系化学灭菌法系指用化学药品直接作用于微生物而将其杀灭的方法，可分为气体灭菌剂和液体灭菌剂，如环氧乙烷属于气体灭菌剂的一类。p一旦温度超过上限，微生物细胞中主要的蛋白质、酶及核一旦温度超过上限，微生物细胞中主要的蛋白质、酶及核酸便会被永久性破坏，细胞膜被融解，从而导致细胞发生酸便会被永久性破坏，细胞膜被融解，从而导致细胞发生不可逆转的死亡。不可逆转的死亡。p热力学灭菌是使用最普遍并且研究最为彻底的灭菌方式。热力学灭菌是使用最普遍并且研究最为彻底的灭菌方式。灭 菌 基 本
10、原 理灭 菌 基 本 原 理p微生物的耐热性可按下列顺序排列微生物的耐热性可按下列顺序排列(耐热性从高到低耐热性从高到低):p绝大多数细菌绝大多数细菌45不能生长，不能生长，80100可被迅速可被迅速杀灭。杀灭。p需氧菌中的芽胞杆菌属需氧菌中的芽胞杆菌属 厌氧菌中的梭状芽胞杆菌属厌氧菌中的梭状芽胞杆菌属具有较强的耐热性具有较强的耐热性p物理物理/化学条件化学条件 p在较高温度下生长在较高温度下生长p有二价阳离子有二价阳离子p温度和相对湿度温度和相对湿度p在在90 125之间，相对湿度在之间，相对湿度在20%50%时，时，细菌芽胞表现出最大的耐热性细菌芽胞表现出最大的耐热性p当相对湿度超出这一范
11、围时，芽胞的耐热性将会当相对湿度超出这一范围时，芽胞的耐热性将会迅速下降。迅速下降。n湿度对芽胞破坏性过程起促进作用，所以湿湿度对芽胞破坏性过程起促进作用，所以湿热灭菌较干热灭菌较低温度热灭菌较干热灭菌较低温度。影响热力灭菌的因素p湿热灭菌法湿热灭菌法系指物质在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手系指物质在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段杀灭细菌。（一定压力下的蒸气进行灭菌，也采用过热水喷淋或段杀灭细菌。（一定压力下的蒸气进行灭菌，也采用过热水喷淋或浸没）。浸没）。p湿热灭菌法系导致细胞内的关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固。湿热灭菌法系导致细胞内的关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固。p
12、具有穿透力强，传导快，灭菌能力甚强。具有穿透力强，传导快，灭菌能力甚强。【水由液态变成气态时，水由液态变成气态时，会吸收大量的热能会吸收大量的热能(540cal/g)，气态冷凝成液态时，会释放相等的能，气态冷凝成液态时，会释放相等的能量量(即汽化热即汽化热)】。因此。因此应尽可能使用饱和蒸汽进行灭菌应尽可能使用饱和蒸汽进行灭菌。p湿热灭菌是一种十分经济有效的方法。湿热灭菌是一种十分经济有效的方法。用于药品、药品的溶液、玻用于药品、药品的溶液、玻璃器械、培养基、无菌衣、敷料以及其他遇高温与湿热不发生变化璃器械、培养基、无菌衣、敷料以及其他遇高温与湿热不发生变化或损坏的物质，均可选用。或损坏的物质
13、，均可选用。p常见湿热灭菌器包括脉动真空灭菌器（或称预真空灭菌器）、蒸汽常见湿热灭菌器包括脉动真空灭菌器（或称预真空灭菌器）、蒸汽-空气混合物灭菌器和过热湿热灭菌水灭菌器等。空气混合物灭菌器和过热湿热灭菌水灭菌器等。湿 热 灭 菌p干热灭菌干热灭菌是指在非饱和湿度下进行的热力学灭菌。是指在非饱和湿度下进行的热力学灭菌。灭菌介质通常为被灭菌品所处湿度下的热空气干热灭菌是使微生物氧化而不是蛋白质变干热灭菌是使微生物氧化而不是蛋白质变性，这就是干热灭菌之所以要求相对较高温度的原因。性，这就是干热灭菌之所以要求相对较高温度的原因。p利用干热灭菌工艺灭菌温度高、时间长的这一特点如如170-250，甚，甚
14、至更高，至更高，可使干热灭菌同时具备除热原的功用。干热是去热原最为有干热是去热原最为有效的方法之一。干热去热原工艺进行验证，应证明该工艺能使标准内效的方法之一。干热去热原工艺进行验证，应证明该工艺能使标准内毒素至少毒素至少下降下降3个对数单位个对数单位。p在制药工业中，干热灭菌被广泛用于在制药工业中，干热灭菌被广泛用于不耐受高压蒸气的热稳定性物品不耐受高压蒸气的热稳定性物品的灭菌。的灭菌。如玻璃、金属设备、器具，不需湿气穿透的油脂类（甘油、甘油、油类、凡士林、石蜡）油类、凡士林、石蜡），耐高温的粉末化学药品（滑石粉、磺胺类药滑石粉、磺胺类药物）物）等，但不适用于橡胶、塑料及大部分药品。p革兰阴
15、性细菌细胞壁中的脂多糖革兰阴性细菌细胞壁中的脂多糖-内毒素。低剂量内毒素会导致人内毒素。低剂量内毒素会导致人体发热反应，故而也称之为热原。体发热反应，故而也称之为热原。干 热 灭 菌p 使用范围可分为试验室器具用，生产制剂用，生产器具用干热灭菌设备。p 按使用方式分为连续式和批量式，p批量式干热灭菌设备如干热烘箱，可用于内毒素检验用玻璃、金属器具的灭菌和除热原，以及生产设备部件、生产器具的灭菌除热原；p连续干热灭菌设备，如隧道烘箱，可用于小容量注射剂的生产。p 按加热方式可分为：以辐射加热为主的热辐射式干热灭菌机和以对流加热为主的热层流加热式干热灭菌机等。干 热 灭 菌p在特定温度下，任一时间
16、点的芽胞死亡特性仅与这个时间在特定温度下，任一时间点的芽胞死亡特性仅与这个时间点的芽胞浓度相关。点的芽胞浓度相关。微生物的热致死特性微生物的热致死特性Y轴及轴及X轴均为普通座标（示意）轴均为普通座标（示意）t N102030101001000半对数座标半对数座标Y轴：微生物取对数轴：微生物取对数X轴：时间为轴：时间为10进制普通座标进制普通座标tlgN102030123p无菌的影响因素可用下式表示无菌的影响因素可用下式表示:PNSU=N0-DR PNSU指非无菌品概率指非无菌品概率N0指灭菌前产品的污染水平指灭菌前产品的污染水平DR指灭菌时的杀灭水平。指灭菌时的杀灭水平。p 最终产品的无菌质量
17、取决于两个因素最终产品的无菌质量取决于两个因素灭菌前的含菌量控制灭菌前的含菌量控制灭菌工艺的杀灭效果。灭菌工艺的杀灭效果。p 微生物的热致死特性：微生物的热致死特性：受热死亡速度符合一级动力学方程受热死亡速度符合一级动力学方程dN/dtK(N0Nt)N0为为t0时，存活的微生物数；时，存活的微生物数；Nt为为t时被杀灭的微生物数；时被杀灭的微生物数；N为为t时存活的微生物数时存活的微生物数 K为常数。为常数。将上式积分得到：将上式积分得到：lgNt lgN0(K2.303)t专 业 名 词D值 在一定温度下将微生物数量杀灭90%或下降一个对数单位所需要的时间z值灭菌温度系数 即指使微生物D值改
18、变(增加或减少)一个对数单位时，温度应变化(降低或升高)的度数。是耐热曲线或热致死时间曲线斜率的负倒数FTT灭菌时间 指灭菌程序赋予被灭菌品在T下的等效灭菌时间F0标准灭菌时间 将121作为标准灭菌温度，当z设定为10时，灭菌程序赋予被灭菌品121下的等效灭菌时间p它是分析灭菌工艺效果的重它是分析灭菌工艺效果的重要生物学参数。并且其数值要生物学参数。并且其数值可通过残存曲线法或阴性分可通过残存曲线法或阴性分数法加以确定。数法加以确定。plgN0lgNtlg（N0Nt）pt(K2.303)lgl01,p所以所以D=t=2.303K.p即：即：D是直线斜率的负倒数是直线斜率的负倒数pD 值越大，该
19、温度下微生物值越大，该温度下微生物的耐热性就越强，在灭菌中的耐热性就越强，在灭菌中就越难杀灭。就越难杀灭。lgNlgNt t1 12 23 34 4t t1 1t t2 2D Dp对某一种微生物而言，对某一种微生物而言，在其他条件保持不变在其他条件保持不变的情况下，的情况下，D 值随灭值随灭菌温度的变化而变化。菌温度的变化而变化。p灭菌温度升高时，直灭菌温度升高时，直线方程的斜率变大，线方程的斜率变大，即使微生物杀灭即使微生物杀灭90所需的时间就短所需的时间就短p灭菌温度低时，达到灭菌温度低时，达到同一灭菌效果的时间同一灭菌效果的时间就长就长115121125lgNtlgN=1D125D121
20、D115微生物名称微生物名称温度温度介介 质质D值值min嗜热嗜热脂肪脂肪杆菌杆菌105葡萄糖葡萄糖87.811032.011511.71212.4微生物名称微生物名称温度温度介介 质质D值值min梭状芽梭状芽孢杆菌孢杆菌105葡萄糖葡萄糖1.3注射用水注射用水2.1微生物名称微生物名称温度温度介介 质质D值值min嗜热嗜热脂肪脂肪杆菌杆菌121葡萄糖乳酸林格液葡萄糖乳酸林格液2.1葡萄糖葡萄糖2.4注射用水注射用水3.0微生物名称微生物名称温度温度介介 质质D值值min梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌105葡萄糖葡萄糖1.3嗜热脂肪杆菌嗜热脂肪杆菌注射用水注射用水2.1p在湿热灭菌条件下，实验测得在
21、湿热灭菌条件下，实验测得细菌芽胞的细菌芽胞的z值在值在8-12之间之间p湿热灭菌计算时湿热灭菌计算时z通常取通常取10；干热灭菌计算时干热灭菌计算时Z通常取通常取20，去热原时去热原时Z通常取通常取54。p Z=直线斜率的负倒数直线斜率的负倒数,其中其中:D1指温度为指温度为T1时的时的D值，值，D2指温度为指温度为T2时的时的D值。值。tT（）D1D2121117TD Z=-T/D=(Tl-T2)/log10(D2/D1)，nF0D l21LgNnFTDTLgNn达到同样灭菌效果时，达到同样灭菌效果时，LgN 等值等值lgNtLgNoLgNt121117LgNFTFo指在某一温度指在某一温度
22、T()下灭菌下灭菌1min 所获得的标准灭菌时间所获得的标准灭菌时间所以所以 F0FTD121DTpL=D121/Di=10(Ti-121)/ZpTi指各个灭菌时段的温度指各个灭菌时段的温度p标准参照温度（标准参照温度（121）pZ10。n100灭菌时灭菌时1分钟，相当分钟，相当于于121 灭菌灭菌0.008分钟，分钟，即即Fo值为值为0.008分钟。分钟。n105灭菌灭菌40分钟时，分钟时，Fo约为约为 1分钟，能使分钟，能使D值为值为1分钟的芽孢数量下降分钟的芽孢数量下降1个个对数单位对数单位n116下灭菌下灭菌lmin 对芽孢对芽孢杀灭效果只有标准灭菌状杀灭效果只有标准灭菌状态下的态下的
23、32n121下灭菌下灭菌lmin 相当于相当于116下灭菌下灭菌3.16min灭菌温度灭菌温度 灭菌率灭菌率L1000.0081050.0251120.1261150.2511160.3161180.5011200.7941211.0001221.251231.59n可用灭菌率计算可用灭菌率计算FT值值=F0L=8/0.316=25.3nF0=10(Ti-T121)/Z dt=10(116-121)/10*25.3=8n根据梯形规则，将整个灭菌过程根据梯形规则，将整个灭菌过程(包括升温、保温和冷却包括升温、保温和冷却阶段阶段)的灭菌率累加，从而估算出某灭菌程序在标准温度的灭菌率累加，从而估算出
24、某灭菌程序在标准温度下的等效灭菌时间：下的等效灭菌时间：nF0=t（L1/2+L2+L3+Ln-1+Ln/2）,t指测量温度的时指测量温度的时间间隔。每两次测量温度的时间间隔必须相同。在初始间间隔。每两次测量温度的时间间隔必须相同。在初始及结束时间段的灭菌率非常小及结束时间段的灭菌率非常小,可将公式简化为可将公式简化为:FT=tL。L1 L2 L3 LN-1 LN100n由由 FT(LgN0LgNT)DT，FTDT LgN0LgNT，则则lgNTlgN0FTDT。根据灭菌设备内温度监控系统。根据灭菌设备内温度监控系统所测得的物理参数，估测某灭菌程序对微生物的杀灭所测得的物理参数，估测某灭菌程序
25、对微生物的杀灭效果。效果。nDT表示某实际微生物（待灭菌物品中的污染菌表示某实际微生物（待灭菌物品中的污染菌)或假设或假设的微生物的微生物(生物指示剂生物指示剂)在在T下的下的D值。值。n例如，假设例如，假设F0为为8分钟，分钟，DT=0.5分钟，数量为分钟，数量为106，由，由公式可以得出在灭菌结束时，芽胞的残存数量为公式可以得出在灭菌结束时，芽胞的残存数量为10-10，SAL=lgNT=6-8/0.5=-10。n在整个灭菌过程中，芽胞数量的对数下降值在整个灭菌过程中，芽胞数量的对数下降值:SLR=LgN0-LgNT=FTDT=6-(-10)=8/0.5=16。n生物指示剂，简称为生物指示剂
26、，简称为BI，是对特定灭菌者，是对特定灭菌者 工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭 菌效力的微生物制剂，菌效力的微生物制剂，n生物指示剂多为芽胞类细菌，具有更强的耐受性。生物指示剂多为芽胞类细菌，具有更强的耐受性。n生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。n采用生物指示剂做对照试验，是评判一个灭菌程序采用生物指示剂做对照试验，是评判一个灭菌程序有效性的直接方法而且也是最佳方法。有效性的直接方法而且也是最佳方法。n常用于灭菌工
27、艺验证的生物指示剂主要有三种形式常用于灭菌工艺验证的生物指示剂主要有三种形式芽胞条芽胞条芽胞悬浮液芽胞悬浮液自含型生物指示剂自含型生物指示剂 p芽胞条芽胞条 p将芽胞接种于滤纸片、玻璃、塑料等薄片或条状物，并用将芽胞接种于滤纸片、玻璃、塑料等薄片或条状物，并用特定的材料包起来以保持其完整性和生物活性。直接接种特定的材料包起来以保持其完整性和生物活性。直接接种到产品中到产品中.p适用于验证和监控非溶液类物品的灭菌工艺适用于验证和监控非溶液类物品的灭菌工艺.p芽胞悬浮液芽胞悬浮液 p芽胞悬浮液可被接种待灭菌产品溶液或模拟产品溶液中。芽胞悬浮液可被接种待灭菌产品溶液或模拟产品溶液中。直接接种于产品内
28、或产品外表面，这样能更加直观地考察直接接种于产品内或产品外表面，这样能更加直观地考察产品的实际灭菌效果。产品的实际灭菌效果。p芽胞接种到液体产品时，其耐热性会增强或降低。如果不芽胞接种到液体产品时，其耐热性会增强或降低。如果不宜被直接接种于产品或耐热芽胞与产品不相适应，则可用宜被直接接种于产品或耐热芽胞与产品不相适应，则可用模拟产品（生理盐水或其他溶液）替代。模拟产品（生理盐水或其他溶液）替代。p但必须保证所用的替代品与产品具有相似的物理和化学性但必须保证所用的替代品与产品具有相似的物理和化学性质质(如粘度和如粘度和pH)，并且耐热芽胞在替代品中的，并且耐热芽胞在替代品中的D值（耐热性）值（耐
29、热性）不得小于在产品中的不得小于在产品中的D值。否则将影响到灭菌工艺验证或日值。否则将影响到灭菌工艺验证或日常监控的可靠性。常监控的可靠性。p 自含型生物指示剂自含型生物指示剂 p是将芽胞条是将芽胞条(或片或片)加入到含有指示剂的培养基包装内加入到含有指示剂的培养基包装内(如小瓶内如小瓶内)，培养基单独包装并与芽胞载体分离，经灭菌处理后，挤碎培养培养基单独包装并与芽胞载体分离，经灭菌处理后，挤碎培养基小瓶使芽胞条基小瓶使芽胞条(或片或片浸没在培养基内，在适当温度和时间内浸没在培养基内，在适当温度和时间内培养，通过观察培养基内的酸碱指示剂的颜色变化判断其生长培养，通过观察培养基内的酸碱指示剂的颜
30、色变化判断其生长状况状况;或将芽胞直接接种在含有指示剂的培养基内。或将芽胞直接接种在含有指示剂的培养基内。p自含型生物指示剂的耐热性与其载体、包装的材质、结构有很自含型生物指示剂的耐热性与其载体、包装的材质、结构有很大的相关性；生物指示剂的包装要易于杀菌剂透过。大的相关性；生物指示剂的包装要易于杀菌剂透过。p测定测定D值时务必要考虑包装可能会引起杀菌效来的滞后，不能值时务必要考虑包装可能会引起杀菌效来的滞后，不能仅测定芽胞条仅测定芽胞条(或片或片)的的D值。值。n灭菌溶液时，多选用自含型安瓶瓶生物指示剂灭菌溶液时，多选用自含型安瓶瓶生物指示剂n灭菌织物时，多选用芽胞条灭菌织物时，多选用芽胞条n
31、灭菌管路时，选用特殊生物指剂灭菌管路时，选用特殊生物指剂(如用接有芽胞的如用接有芽胞的钢丝、线等钢丝、线等)以测试死角处以测试死角处(最冷点最冷点)的灭菌状况的灭菌状况灭菌方式灭菌方式 微生物（孢子）微生物（孢子）D值范围（分）值范围（分）湿湿 热热121嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌 Bacillus stearothermophilus 1.5-3.0 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 0.3-0.7凝结芽孢杆菌凝结芽孢杆菌 Bacillus coagulans 0.4-0.8梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌 Clostridium sporogenes 0.4-0.
32、8干热干热 150 枯草芽孢杆菌黑色变种枯草芽孢杆菌黑色变种 Bacillus subtilis var.niger 1.0 注射剂注射剂无菌生产无菌生产过滤除菌过滤除菌无菌分装无菌分装（冻干）粉针剂（冻干）粉针剂溶液状态下稳定等注射液注射液否否是是最终灭菌最终灭菌无菌生产无菌生产否否是是热压灭热压灭菌菌残存概率法残存概率法不能耐受过度杀菌法不能耐受过度杀菌法过度杀菌法过度杀菌法注射剂注射剂灭菌工艺灭菌工艺 的选择的选择EMEA 灭菌工艺决策树风险增加一般是湿热灭菌方式 F08，首选过度杀灭法F012，如不能耐受过度杀灭，选用残存概率法8F012。最终灭菌非最终灭菌生产工艺是在控制微生物污染量
33、的基础上，在完成内包装工艺生产过程最终采取一个可靠的灭菌措施。是在无菌系统环境下，通过除菌过滤法或无菌操作法，在完成内包装工艺生产全过程始终未采取单独的灭菌措施。基 本 概 念无菌性的过程或内容不同无菌保证值与Fo、D值及带菌量的关系lgN2345-2-3-41-5-6-101234576891012分分11过度杀灭示意过度杀灭示意生产中生产中Fo=8示意示意SALF0/D lgN0 假定D121为1方法F0N0SAL过度杀灭法12 1066残存概率法81026p确立灭菌终点确立灭菌终点-使微生物的残存概率下降到使微生物的残存概率下降到100，在此基础上再下降在此基础上再下降6个对数单位个对数
34、单位(即微生物的残存概即微生物的残存概率不超过率不超过1/百万，或百万，或PNSU10-6)p灭菌过程中所产生的各项物理和生物学参数应能灭菌过程中所产生的各项物理和生物学参数应能保证其灭菌效果达到保证其灭菌效果达到PNSU=10-6。生物学因素生物学因素物理因素物理因素1.灭菌前微生物量:N02.灭菌前微生物的耐热性:DT3.灭菌终点的残存概率:NT(10-6)灭菌值:FT灭菌工艺开发p FT=（lgN0-lgNT）DT如果N0和DT已知，为使灭菌终点达到10-6的要求，可计算出灭菌前的带菌量。p 例如，灭菌前每个容器内含有l00个耐热芽胞，其DT=1分钟，灭菌值F0要达到8分钟，才能使产品中
35、微生物降至100后，再下降6个对数单位:F0=2-(-6)x1=8分钟。pF0=8分钟是灭菌工艺必须达到的最小目标值。也可根据灭菌设备的性能和产品的热稳定性确定F0的上限。灭菌工艺开发p 过热灭菌时，不用考虑灭菌前含菌量。这并不意味着就过热灭菌时，不用考虑灭菌前含菌量。这并不意味着就不用对灭菌前含菌量进行控制。相反，控制灭菌前产品中不用对灭菌前含菌量进行控制。相反，控制灭菌前产品中的污染菌含量也是非常重要的。的污染菌含量也是非常重要的。p过热灭菌工艺常用于热稳定性物品的灭菌，如包装材料和过热灭菌工艺常用于热稳定性物品的灭菌，如包装材料和生产设备等。生产设备等。p验证时，先通过确定完全杀灭含有验
36、证时，先通过确定完全杀灭含有106个嗜热脂肪芽胞杆个嗜热脂肪芽胞杆菌的生物指示剂（菌的生物指示剂（D121值为值为1.5分钟左右分钟左右)所需的灭菌时间，所需的灭菌时间，再将这个时间加倍即为实际生产时的过热灭菌时间。再将这个时间加倍即为实际生产时的过热灭菌时间。过热灭菌p建立在含菌量控制基础上的灭菌工艺，其灭菌终点建立在含菌量控制基础上的灭菌工艺，其灭菌终点是由灭菌前半成品的含菌量及所含微生物的耐热性是由灭菌前半成品的含菌量及所含微生物的耐热性来决定的。来决定的。p生产时应避免产品被耐热性微生物污染，而不能依生产时应避免产品被耐热性微生物污染，而不能依赖于最终灭菌。赖于最终灭菌。p有些产品在灭
37、菌前进行无菌生产和灌装。有些产品在灭菌前进行无菌生产和灌装。p控制灭菌前产品中的含菌量，可以降低灭菌条件，控制灭菌前产品中的含菌量，可以降低灭菌条件，降低灭菌时对产品及其容器降低灭菌时对产品及其容器/密封件的潜在破坏性。密封件的潜在破坏性。p对热敏性产品对热敏性产品(如蛋白质如蛋白质)非常重要非常重要残存概率法p如果在灭菌前产品中没有耐热菌，如果在灭菌前产品中没有耐热菌，p可假设有一定数量的芽胞存在于其中可假设有一定数量的芽胞存在于其中(常规生产时可常规生产时可能会碰到的最差状况能会碰到的最差状况)。如设每只容器内含有。如设每只容器内含有 D121=0.5分钟的耐热芽胞分钟的耐热芽胞100个。
38、个。p根据与假设菌的数量及耐热性相当的实际生物指示根据与假设菌的数量及耐热性相当的实际生物指示剂剂(BI)来确定一个灭菌工艺的灭菌效果。来确定一个灭菌工艺的灭菌效果。p根据置于灭菌产品内的测温探头的测量数据计算出根据置于灭菌产品内的测温探头的测量数据计算出理论理论F0值，并对多次运行的值，并对多次运行的F0值进行平均，将平均值进行平均，将平均F0值与从接有生物指示剂值与从接有生物指示剂(已知胞子数量和已知胞子数量和D值值)的类的类似容器中得到的平均似容器中得到的平均SLR(spore log reduction)值进行值进行比较。比较。残存概率法n根据生物指示剂的致死效果，估算出实际污染根据生
39、物指示剂的致死效果，估算出实际污染菌的下降水平菌的下降水平:SLR A=SLRB DB/DA nSLR A灭菌前产品中污染菌的对数下降值灭菌前产品中污染菌的对数下降值nSLR B生物指示剂的对数下降值生物指示剂的对数下降值nDA灭菌前微生物的灭菌前微生物的(已知或假定的已知或假定的)D值值n DB生物指示剂生物指示剂D值。值。如果如果DA=0.5分钟，分钟，DB=2.0分钟，分钟，121 F0=8分钟，分钟，SLRB=4，则则:SLR A=16,SLRA=4(2.0/0.5)=16 lgNT=1gN0-SLR =2-16=-14,SAL=14。残存概率法n在灭菌结束时仍有一部分生物指示剂未被杀
40、灭，但这并不在灭菌结束时仍有一部分生物指示剂未被杀灭，但这并不意味着此灭菌程序无效。通过它们，证实了测温探头指示意味着此灭菌程序无效。通过它们，证实了测温探头指示的的F0值（值（8分钟分钟)所赋予容器内物品的实际灭菌效果。所赋予容器内物品的实际灭菌效果。残存概率法只要对灭菌前的含菌量进行控制、监测并掌握其只要对灭菌前的含菌量进行控制、监测并掌握其耐热性，耐热性，一般是不会含有耐热芽胞的一般是不会含有耐热芽胞的n控制手段控制手段n对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好的对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好的半成品取样检测。半成品取样检测。样品须作需氧菌总计数样品须作需氧菌总计数将检品液置于
41、将检品液置于100下加热下加热10分钟，检查是否有耐热芽孢分钟，检查是否有耐热芽孢存活存活须对微生物学检测结果进行趋势分析须对微生物学检测结果进行趋势分析以确保半成品的微生以确保半成品的微生物处于稳定的受控状态物处于稳定的受控状态残存概率法p一般情况下，暴热后的样品中是检测不到微生物的，一旦一般情况下，暴热后的样品中是检测不到微生物的，一旦发现，则需对其鉴别并测定其发现，则需对其鉴别并测定其D值。值。p若分离菌的若分离菌的D值大于灭菌工艺验证所用生物指示剂的值大于灭菌工艺验证所用生物指示剂的D值，值，则说明灭菌程序不充分，应采取措施以消除产品中的耐热则说明灭菌程序不充分，应采取措施以消除产品中
42、的耐热菌。菌。p如果这些措施不可行，则应采用具有更强耐热性的生物指如果这些措施不可行，则应采用具有更强耐热性的生物指示剂，或是从产品中分离出的耐热性微生物，对灭菌程序示剂，或是从产品中分离出的耐热性微生物，对灭菌程序进行再验证。进行再验证。n生物学验证就是要用与产品灭菌工艺相适应的最苛刻条件生物学验证就是要用与产品灭菌工艺相适应的最苛刻条件来挑战该产品灭菌工艺的有效性、可靠性和稳定性。来挑战该产品灭菌工艺的有效性、可靠性和稳定性。n过度杀灭法过度杀灭法：一般选择嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌。n 残存概率法：残存概率法：一般选择梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌p液体产品在液体产品在121灭菌灭菌15
43、分钟分钟(药典推荐的常用灭菌工药典推荐的常用灭菌工艺艺)即被认为过热灭菌工艺。即被认为过热灭菌工艺。p对管路、胶塞、织物以及过滤器等热穿透性较差的物对管路、胶塞、织物以及过滤器等热穿透性较差的物品则需要更长的灭菌时间或更高的灭菌温度，方能达品则需要更长的灭菌时间或更高的灭菌温度，方能达到过热灭菌要求（到过热灭菌要求（121灭菌灭菌30分钟）。分钟）。p每个指示剂的芽胞含量通常在每个指示剂的芽胞含量通常在105-107之间之间p生物指示剂有效性生物指示剂有效性p当当F0值值(DlgN0-2)时，生物指示剂均应呈阳性结果时，生物指示剂均应呈阳性结果p当当F0值值(DlgN0+4)时，生物指示剂均应
44、呈阴性结果时，生物指示剂均应呈阴性结果p要掌握灭菌前产品中污染菌状况，要掌握灭菌前产品中污染菌状况，p污染菌的数量及其耐热性污染菌的数量及其耐热性;p测定生物剂在待验证产品及验证用标准溶液中的耐热性测定生物剂在待验证产品及验证用标准溶液中的耐热性(D值和值和Z值值);p根据产品的最低灭菌工艺条件、灭菌前产品中的污染菌根据产品的最低灭菌工艺条件、灭菌前产品中的污染菌控制要求及最终产品的无菌保证要求，用相关公式计算控制要求及最终产品的无菌保证要求，用相关公式计算出验证时每个生物指示剂所需要的胞子数量。出验证时每个生物指示剂所需要的胞子数量。F0（分钟（分钟）76543210-1-2-3-4-5-6
45、孢子存活数量的对数值孢子存活数量的对数值t58原料药/赋形剂量微生物检查微生物能否在原料或赋形剂中生长或存活？原料/赋形剂合成/工艺相关步骤本身是否会减少微生物？所监控的微生物量/指示菌量是否都低于规定限度？原料或赋形剂是否无菌？是否有科学证明减少步骤会造成原料/辅料中微生物量认可限度（未检出觉指示菌）？按照协调后药典各论制订微生物限度认可标准提供支持数据，不必作微生物限度检查和制订认可标准不需进一步作微生物限度检查或制订认可标准提供支持数据，不必作微生物限度检查和制订认可标准逐批检查微生物限度和指示菌抽批检验微生物限度和指示菌按照协调后药典各论制订微生物限度认可标准是是否否否否否否是是是是是
46、是 否否是是否否p灭菌前含菌量限度以及污染菌的耐热性限度均是以原材灭菌前含菌量限度以及污染菌的耐热性限度均是以原材料的微生物含量和常规监控资料为基础而建立的料的微生物含量和常规监控资料为基础而建立的;p灭菌条件及灭菌条件及F0值控制是根据产品稳定性研究资料而建立值控制是根据产品稳定性研究资料而建立的的;p验证用芽胞在每种产品中的实际耐热性资料由微生物实验证用芽胞在每种产品中的实际耐热性资料由微生物实验室测得。验室测得。logN0 =F0/D121+logNtnNt =2.303 log(n/q)log(n/q)nn:n:每次挑战试验用生物指示剂数量每次挑战试验用生物指示剂数量nq:q:挑战试验
47、后呈阴性的挑战试验后呈阴性的BIBI数量数量n如果全都是阴性如果全都是阴性,则假定则假定 q=n-1q=n-1用于计算用于计算 N Nt产品灭菌前含菌量控制限度CFU/瓶耐热性DC DBI温度时间F0控制范围）验证用孢子在其中的耐热性D121A100 116259-130.8 分分B100DC DBI116258-120.9 分分C100 DC DBI118209 130.7 分分n可选择产品B代表上述三产品进行验证产品的规格相同、且在同一灭菌设备内灭菌并且灭菌产品的规格相同、且在同一灭菌设备内灭菌并且灭菌工艺条件相似、以及生物指示剂芽胞在其中的耐热性工艺条件相似、以及生物指示剂芽胞在其中的耐
48、热性也较为相近，只要验证其中的一个产品也较为相近，只要验证其中的一个产品B即可，即可，生物指示剂在其中的耐热性最高，而灭菌程序的F0值的下限低于其它二产品但验证时要以100CFU/瓶作为污染菌含量通过试验证明灭菌程序能使生物指示剂至少下降 8个对数单位,所需F0为为 D121 log=7.2分分最低最低F0满足要求满足要求n确定验证用芽孢在每瓶产品B中的接种数量n验证标准溶液为氯化钠一磷酸盐缓冲液验证标准溶液为氯化钠一磷酸盐缓冲液(PBS)，验证试验，验证试验瓶数量为瓶数量为20袋袋/次。，产芽胞梭状菌芽胞在氯化钠一磷酸次。，产芽胞梭状菌芽胞在氯化钠一磷酸盐缓冲液盐缓冲液(PBS,pH7.0)
49、中的耐热性为中的耐热性为1.4分钟，高于其在分钟，高于其在产品中的耐热性，产品中的耐热性，n接种量接种量:F0=D121(1gA-1gB)n 根据阴性分数法，根据阴性分数法，B=2.303 log(n/q)n假如所有的假如所有的20只试验瓶无菌检查结果均呈阴性，在计算时只试验瓶无菌检查结果均呈阴性，在计算时可假定只有可假定只有19瓶呈阴性，那么，瓶呈阴性，那么，nB=2.303lg(20/19)=0.0513,lgB=-1.29,nlgA=F0/D121+lgB=8/1.4-1.29=4.4,A=104.4个菌个菌.n每个挑战瓶内的芽胞接种量可控制在每个挑战瓶内的芽胞接种量可控制在104105
50、之间。之间。n验证时，腔室内的物品应按实际生产时的要求进行装验证时，腔室内的物品应按实际生产时的要求进行装载载n生物指示剂的使用数量应足以反映整个物品内、外部生物指示剂的使用数量应足以反映整个物品内、外部的灭菌状况，生物指示剂既要遍布整个腔室，又要尽的灭菌状况，生物指示剂既要遍布整个腔室，又要尽可能地放在热效应最差的部位，如物品中央、管路拐可能地放在热效应最差的部位，如物品中央、管路拐角以及腔室的排水口角以及腔室的排水口(干热灭菌的排风口干热灭菌的排风口)等等n应将生物指示剂与物理测试用温度探头放于同一位置应将生物指示剂与物理测试用温度探头放于同一位置，以准确获取物理参数与微生物致死性之间的相
