1、第十五章第十五章 核酸的研究方法核酸的研究方法一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定五、五、DNADNA聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）六、六、DNADNA的化学合成的化学合成楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国一、核酸的分离、纯化和定量测定一、核酸的分离、纯化和定量测定尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈
2、搅拌。抑制核酸酶。抑制核酸酶。（一）（一）DNADNA分离分离真核真核DNADNA以核蛋白（以核蛋白（DNPDNP）形式存在，）形式存在，DNPDNP溶于水或溶于水或高盐溶液（高盐溶液（1mol/L NaCl1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将沉淀，可将DNPDNP与与RNARNA核蛋白分开，提取出核蛋白分开，提取出DNPDNP。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国DNPDNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可
3、用氯仿可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。异戊醇去除蛋白质。水相中的水相中的DNADNA可被可被0.3M NaAC-70%0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。乙醇沉淀。（二）（二）RNARNA的分离的分离RNaseRNase 的灭活：的灭活：玻璃器皿：玻璃器皿：140-200140-200，8h8h塑料器皿：塑料器皿：0.1%DEPC0.1%DEPC，3737，过夜，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加反应体系中加RNasinRNasin等特异的等特异的RNaseRNase抑制剂抑制剂楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学
4、系 范树国范树国用用0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl使使DNPDNP沉淀，上清中即为沉淀，上清中即为RNARNA核核蛋白（蛋白（RNPRNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚苯酚/氯仿法氯仿法异硫氰酸胍异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法蛋白质：蛋白质：1.33g/ml1.33g/mlDNADNA：1.71g/ml1.71g/ml左右左右RNARNA：1.89g/ml1.89g/mlmRNAmRNA的制备：的制备：oligo(dToligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法楚雄
5、师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国（三）核酸含量的测定方法（三）核酸含量的测定方法核酸纯度的鉴定可通过测定样品在核酸纯度的鉴定可通过测定样品在260 nm260 nm和和280nm280nm的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。磷的测定磷的测定 RNARNA中含磷量为中含磷量为9.09.0，DNADNA中含磷量为中含磷量为9.29.2，因此每测得，因此每测得1g1g磷就相当于含有磷就相当于含有11g11g核酸。含核酸。含磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变磷
6、量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可在成正比，可在660nm660nm比色测定。从磷的标准曲线可比色测定。从磷的标准曲线可知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国核糖和脱氧核糖的测定核糖和脱氧核糖的测定 RNARNA中核糖的测定用苔黑酚（中核糖的测定用苔黑酚（3 3，5-5-二羟甲苯）法，利二羟甲苯）
7、法，利用用RNARNA与浓盐酸和与浓盐酸和3 3，5-5-二羟甲苯作用生成绿色物质，二羟甲苯作用生成绿色物质，在在670 nm670 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的应的RNARNA的含量。的含量。DNADNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用DNADNA在酸性条在酸性条件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色化合物，在化合物，在595 nm595 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的中查得对应的DNADNA的含量。的含量
8、。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国紫外吸收的测定紫外吸收的测定 实验室中最常用的是首先测定样实验室中最常用的是首先测定样品在品在260 nm260 nm和和280 nm280 nm的光吸收值（的光吸收值（A A值），从值），从A A260260A A280280的比值可判断样品的纯度。纯的比值可判断样品的纯度。纯DNADNA的的A A260260/A/A280280应为应为1.81.8，纯，纯RNARNA应为应为2.02.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A A260260/A/A280280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸比
9、值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出260mm260mm的的A A值即可算出含量。通常以值即可算出含量。通常以1A1A值相当于值相当于50g/mL50g/mL双螺旋双螺旋DNADNA或或40g/mL40g/mL单链单链DNADNA（或（或RNARNA）或）或20g/mL20g/mL寡核苷寡核苷酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样品。品。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心不同构象的核酸（线形、环
10、形、超螺旋），密度和不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用沉降速率不同，用CsClCsCl密度梯度离心可以将不同构密度梯度离心可以将不同构象象DNADNA、RNARNA与蛋白质区分开来与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒这一方法常用于质粒DNADNA的纯化。的纯化。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国（一）核酸密度的测定（一）核酸密度的测定8M CsCl8M CsCl，45000rpm45000rpm，16h16h密度梯度：密度梯度：1.80g/ml1.80g/ml（底部）（底部）1.55g/ml1.55g/ml（顶部）（顶部）平衡时：浮力
11、密度平衡时：浮力密度=CsCl=CsCl密度密度=离心力离心力=0 0+4.2+4.22 2（r r2 2-r-r0 02 2）10 10-10-10 ：浮力密度：浮力密度 ：角速度（弧度：角速度（弧度/秒）秒）r r：样品到转轴的距离：样品到转轴的距离楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国（二）测定（二）测定DNADNA的的G-CG-C含量含量G-CG-C含量与含量与DNADNA的浮力密度之间呈正比关系的浮力密度之间呈正比关系=0.100 x=0.100 xG-CG-C+1.658+1.658x xG G-C-C=（-1.658-1.658）10 10但含但含
12、5-5-甲基胞嘧啶多的甲基胞嘧啶多的DNADNA，其实际浮力密度会降低，其实际浮力密度会降低，低于理论值。低于理论值。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国（三）溶液中核酸构象的研究（三）溶液中核酸构象的研究浮力密度：浮力密度：RNARNADNADNA变性变性DNADNA双链双链DNA DNA 蛋白质，蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大变性程度越大，浮力密度越大超螺旋超螺旋DNADNA或或三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖电泳（一）琼脂糖电泳影响迁移率的因素：影响迁移率的因素：核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比核酸分子的大小，迁移率与分子量
13、的对数成反比 凝胶浓度凝胶浓度 DNA DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢 电流，不大于电流，不大于5V/cm5V/cm染色：染色：0.5g/ml EB0.5g/ml EB（溴化乙锭）（溴化乙锭）RNARNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛用于大片段用于大片段DNADNA的分离，精度低，但分离范围广。的分离，精度低，但分离范围广。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国琼脂糖电泳可以用于琼脂糖电泳可以用于DNADNA分子量的测定分子量的测定琼脂糖电泳还可以用于琼脂糖电泳还可
14、以用于DNADNA的制备与纯化的制备与纯化（二）（二）PAGEPAGE电泳电泳用于小片段用于小片段DNADNA的分析，的分析，精度非常高精度非常高楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定（一）双脱氧终止法（一）双脱氧终止法英国英国 SangerSanger1955 1955 确定牛胰岛素结构，确定牛胰岛素结构，1958 1958 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1975 1975 设计出设计出DNADNA测序法，测序法，1980 1980 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖合成一段与待测合成一段与待测DNADNA序列互补的序列
15、互补的DNADNA片段群。片段群。楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国双脱氧核苷酸测序法（双脱氧核苷酸测序法（MOVMOV）楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国DNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP（二）化学裂解法（二）化学裂解法 MaxamMaxam-Gilbert-Gilbert，19771977原理：原理：利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和核
16、苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。放射自显影得到测序图谱。3232P-GCTACGTAP-GCTACGTA：在在A A处：处：3232P-GCTP-GCT和和3232P-GCTACGTP-GCTACGT在在G G处：处：3232p p，3232p-GCTACp-GCTAC在在C C处：处：3232P-GP-G和和 3232P-GCTAP-GCTA在在T T处：处：3232P-GCP-GC和和3232P-GCTACGP-GCTACG楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国G G反应：硫酸二甲酯反应：硫酸二甲酯G+AG+A反应：甲酸反应
17、：甲酸/哌啶哌啶C C反应：肼反应：肼/NaCl/NaCl/哌啶哌啶C+TC+T：肼：肼/哌啶哌啶哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二酯键断裂酯键断裂楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（G G）：）：*ACTTCGACTTCG*ACTTCGACAGACTTCGACAG甲酸（甲酸（G+AG+A）：）：*A A*ACTTCG ACTTCG*ACTTCGA ACTTCGA*ACTTCGACAACTTCGACA*ACTTCGACAGACTTCGACAG肼肼/Nacl/Nacl（C C）：）：*
18、AC AC*ACTTCACTTC*ACTTCGA CACTTCGA C*ACTTCGACAGACTTCGACAG 肼（肼（C+TC+T）：）：*AC AC *ACT ACT *ACTT ACTT*ACTTCACTTC*ACTTCGACACTTCGAC*ACTTCGACAGACTTCGACAG从下往上读：从下往上读：CTACGTACTACGTA，末端，末端G G不能读出。不能读出。3232P P*ACTTCGACAGACTTCGACAG（三）（三）RNARNA的测序的测序（1 1）酶裂解法）酶裂解法 胰胰RNaseRNase A A：嘧啶结尾：嘧啶结尾米曲霉米曲霉RNaseRNase T1 T1
19、：鸟苷酸结尾：鸟苷酸结尾黑粉菌黑粉菌RNaseRNase U2 U2：腺苷酸结尾：腺苷酸结尾多头黏菌多头黏菌RNase PhyRNase Phy I I：A A、G G、U U结尾结尾（2 2）化学裂解法）化学裂解法（3 3）逆转录成）逆转录成cDNAcDNA法法楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国五、五、DNADNA聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）模板模板DNADNA（单链）（单链）引物引物DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）dNTPdNTPMgMg2+2+PCRPCR（MOVMOV）六、六、DNADNA的化学合成的化学合成固相合成法（亚磷酸三酯法）固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA合成方向：合成方向：3535端端5-OH5-OH用二对甲氧三苯甲基（用二对甲氧三苯甲基（DMTDMT）保护。）保护。3-OH3-OH用氨基亚磷酸化合物活化用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护碱基上氨基用苯甲酸保护 楚雄师范学院化学与生命科学系楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国范树国
