1、2022-8-4 吉林农业大学 1植物病理学基础研究方法植物病理学基础研究方法 （第第4章章细菌病害研究技术）2022-8-4 吉林农业大学 2Erwin Frink Smith(18541927)l美国植物病理学家，植物病原细菌学奠基人。美国植物病理学家，植物病原细菌学奠基人。18541854年年 1 1月月2121日生于美国纽约，日生于美国纽约，19271927年年4 4月月6 6日卒于华盛顿。日卒于华盛顿。l史密斯从史密斯从18921892年起开始从事细菌病害的研究。年起开始从事细菌病害的研究。18951895年首次发年首次发表了关于瓜类萎蔫病的研究论文。曾对果树根癌病、甘兰黑腐表了关于
2、瓜类萎蔫病的研究论文。曾对果树根癌病、甘兰黑腐病和茄科植物青枯病等进行过系统研究。病和茄科植物青枯病等进行过系统研究。l 在在1919世纪末到世纪末到2020世纪初同德国细菌学家世纪初同德国细菌学家A.A.菲舍尔在细菌是否菲舍尔在细菌是否引起植物病害的问提上，进行了长达引起植物病害的问提上，进行了长达1010年的激烈论战，并以大年的激烈论战，并以大量的事实和研究成果赢得了论战的胜利，量的事实和研究成果赢得了论战的胜利，从而进一步推动了从而进一步推动了植物细菌性病害的研究。植物细菌性病害的研究。l19031903年出版世界上第一本关于植物细菌病害的专著年出版世界上第一本关于植物细菌病害的专著细菌
3、与细菌与植物病害的关系植物病害的关系第第卷。卷。l国际细菌学分类和命名委员会以他的名字作为植物病原周毛国际细菌学分类和命名委员会以他的名字作为植物病原周毛杆菌属的命名，即欧文氏杆菌属杆菌属的命名，即欧文氏杆菌属(Erwinia(Erwinia)。Erwin Frink Smith(18541927)2022-8-4 吉林农业大学 3第一节第一节 病原细菌的分离、纯化、培养和病原细菌的分离、纯化、培养和 菌种保存菌种保存第二节第二节 细菌的接种细菌的接种第三节第三节 病原细菌的鉴定病原细菌的鉴定2022-8-4 吉林农业大学 4一一.病原细菌的分离病原细菌的分离二二.病原细菌的纯化病原细菌的纯化
4、三三.病原细菌的培养病原细菌的培养四四.病原细菌的菌种保存病原细菌的菌种保存2022-8-4 吉林农业大学 5植物病原细菌的分离方法植物病原细菌的分离方法主要有主要有划线分离法划线分离法和和稀释分离法稀释分离法二种。二种。最常用的方法是最常用的方法是划线分离法划线分离法。2022-8-4 吉林农业大学 61.1.事先准备事先准备l无菌操作室或清洁安静的房间，超净工作台等。无菌操作室或清洁安静的房间，超净工作台等。l分离材料：要选择新鲜的分离材料。分离材料：要选择新鲜的分离材料。l培养基：培养基：NANA培养基培养基等。等。l分离器皿及工具：分离器皿及工具：无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪
5、刀、无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、解剖刀、镊子、解剖刀、镊子、接种环接种环、70%70%酒精、酒精、0.1%0.1%升汞、酒精灯、升汞、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、橡皮筋套、微波炉等。火柴、玻璃铅笔、橡皮筋套、微波炉等。l无菌水：盛于三角瓶或试管中。无菌水：盛于三角瓶或试管中。2022-8-4 吉林农业大学 7l倒平板倒平板l切取病组织切取病组织l表面消毒表面消毒l无菌水洗无菌水洗3 3次次l制备菌悬液制备菌悬液l平板上平板上划线划线l2525培养培养l选择选择单菌落单菌落移入斜面移入斜面l 25 25培养培养l检查斜面上分离菌检查斜面上分离菌l保存菌种保存菌种 培养后培养后细菌长出细
6、菌长出选择单菌落选择单菌落移入斜面画蛇行线移入斜面画蛇行线保存菌种保存菌种划线划线2424小时培养后小时培养后,可见菌落可见菌落2022-8-4 吉林农业大学 8火焰上烧去接种环上火焰上烧去接种环上的细菌悬液的细菌悬液2022-8-4 吉林农业大学 9 要选择新鲜的分离材料，要选择新鲜的分离材料，如果材料上腐生菌多，应重新接种，如果材料上腐生菌多，应重新接种，发病后再用于分离。发病后再用于分离。分离细菌的表面消毒时间应少于分离真菌，分离细菌的表面消毒时间应少于分离真菌，如用如用0.10.1升汞消毒时间应为升汞消毒时间应为0.5min0.5min或或再少些再少些。也可用更温和的表面消毒剂，如也可
7、用更温和的表面消毒剂，如70%70%酒精酒精等。等。如果分离材料很新鲜，也如果分离材料很新鲜，也可不进行表面消毒可不进行表面消毒，用无菌水洗用无菌水洗3 3次即可。次即可。2022-8-4 吉林农业大学 10 分离细菌时选择性培养基经常应用。分离细菌时选择性培养基经常应用。lErwinia属属 可用可用MSMS或或CVPCVP；lXanthomonas 属可用属可用YDCYDC;lPseudomonas 属中带荧光者可用属中带荧光者可用KBKB，l 不带荧光者用不带荧光者用NBYNBY 1000mL 1000mL中加入中加入TTC(TTC(三苯基四三苯基四唑化氮唑化氮)1)1溶液溶液5mL;5
8、mL;lAgrobacterium属属 用用D1D1培养基。培养基。q G G+各属可用各属可用1/1/万万重铬酸钾（钠）重铬酸钾（钠）抑制抑制G G-，q 加一些天门冬酰胺利于加一些天门冬酰胺利于G G+生长。生长。2022-8-4 吉林农业大学 11 使用的使用的NANA培养基等灭菌后易偏酸，而细培养基等灭菌后易偏酸，而细菌喜硷性，可适当菌喜硷性，可适当调节调节pHpH。对分离菌菌落不了解时，分离时要选择对分离菌菌落不了解时，分离时要选择优势菌落优势菌落移入斜面。移入斜面。如果无优势菌落，则要重新分离或将如果无优势菌落，则要重新分离或将各种各种菌落菌落都分离出来，再进一步选择。都分离出来，
9、再进一步选择。2022-8-4 吉林农业大学 121.1.事先准备事先准备l大体同划线分离法大体同划线分离法2.2.操作步骤操作步骤（大体同真菌）（大体同真菌）切取病组织切取病组织表面消毒表面消毒无菌水洗无菌水洗3 3次次制备菌悬液制备菌悬液稀释稀释用约用约5050培养基培养基倒平板倒平板 25 25培养培养选择选择优势单菌落优势单菌落移入斜面移入斜面2525培养检查斜面上分离菌培养检查斜面上分离菌保存菌种保存菌种 2022-8-4 吉林农业大学 14样品2022-8-4 吉林农业大学 15稀释倒平板法稀释倒平板法涂布平板法涂布平板法2022-8-4 吉林农业大学 16l方法方法：利用稀释分离
10、法、划线分离法等利用稀释分离法、划线分离法等重新重新进行分离，进行分离，待待同一平板上的菌落性状达到全部一致同一平板上的菌落性状达到全部一致，再移殖其中单菌落到斜面培养基再移殖其中单菌落到斜面培养基就认为菌种得以纯化。就认为菌种得以纯化。2022-8-4 吉林农业大学 17待同一平板上的菌落待同一平板上的菌落性状达到全部一致性状达到全部一致,再移殖其中单菌落再移殖其中单菌落到斜面培养基到斜面培养基,就认为菌种得以纯化就认为菌种得以纯化.2022-8-4 吉林农业大学 18l一般在细菌获得分离后，紧接着就应对其进一般在细菌获得分离后，紧接着就应对其进行行致病性的测定致病性的测定工作。工作。如果我
11、们分离的菌株并非致病菌，则使如果我们分离的菌株并非致病菌，则使用这种菌株继续进行研究只会白白浪费时间。用这种菌株继续进行研究只会白白浪费时间。l致病性的测定方法：致病性的测定方法：将分离菌接种于其健康的寄主植物，如将分离菌接种于其健康的寄主植物，如可致病，则致病性获得确认。可致病，则致病性获得确认。2022-8-4 吉林农业大学 19l还有一种还有一种简易的致病性测定方法简易的致病性测定方法，即进行该细菌的即进行该细菌的过敏反应测定过敏反应测定。l常用方法为：配制此细菌常用方法为：配制此细菌菌悬液菌悬液（浓度：（浓度：10108-98-9 cfucfu/mL/mL ）简易判断此浓度的方法：在盛
12、有菌悬液的试管后面放一张报纸，可分辨出字块，但无简易判断此浓度的方法：在盛有菌悬液的试管后面放一张报纸，可分辨出字块，但无法辨认出字形时，大体为此浓度。法辨认出字形时，大体为此浓度。l注射注射到普通烟草叶（脉）片中，经过到普通烟草叶（脉）片中，经过24h24h（气温在（气温在20202525），），如菌悬液扩散所到处变成如菌悬液扩散所到处变成褐色褐色，即为过敏反应阳性，表明其为致，即为过敏反应阳性，表明其为致病菌。病菌。l这种方法并非这种方法并非100100可靠，但可对分离出来的多个菌株进行初筛。可靠，但可对分离出来的多个菌株进行初筛。cfucfu（colony forming unitcol
13、ony forming unit）通常称为通常称为“可形成菌落单元可形成菌落单元”，用于表示细菌的数目，用于表示细菌的数目，它和细菌的个数正相关。它和细菌的个数正相关。2022-8-4 吉林农业大学 20马铃薯环腐病菌、梨火疫病菌在烟草上马铃薯环腐病菌、梨火疫病菌在烟草上引起过敏性坏死反应引起过敏性坏死反应(HR)过敏性反应过敏性反应2022-8-4 吉林农业大学 21l在获得了细菌的分离物后，通常要进行细菌的培养，在获得了细菌的分离物后，通常要进行细菌的培养，l即将病原菌移植于即将病原菌移植于固体固体或或液体液体培养基上，使其生长，并培养基上，使其生长，并观察记载该菌在该培养基及特定培养条件
14、观察记载该菌在该培养基及特定培养条件(温度、光照、温度、光照、pHpH等等)下的培养性状。下的培养性状。l包括其包括其形态、颜色、表面特征、生长速度、色素的分泌、形态、颜色、表面特征、生长速度、色素的分泌、气味、某些特定化合物气味、某些特定化合物的生成等。的生成等。l研究培养性状有助于我们对微生物的鉴别，也可以研究研究培养性状有助于我们对微生物的鉴别，也可以研究培养基成分及培养条件对该微生物生长发育的影响。培养基成分及培养条件对该微生物生长发育的影响。2022-8-4 吉林农业大学 22 让某种细菌在平板培养基上形成单个菌落或在斜面培养让某种细菌在平板培养基上形成单个菌落或在斜面培养基上形成菌
15、苔。观察、记载以下内容：基上形成菌苔。观察、记载以下内容：菌落（苔）菌落（苔）颜色颜色、形状（形状（特别是特别是边缘边缘的形状的形状）、）、表面表面是否是否凸起凸起或或凹陷、凹陷、表面表面是否是否光亮、光亮、是否有色素分泌是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、出来而渗透到培养基中、生长速度生长速度快慢等。快慢等。q同时要记载同时要记载培养基种类培养基种类(成分及成分及pH)pH)和培养和培养温度、光照温度、光照条件。条件。q一般常用一般常用NANA培养基，在培养基，在25253030培养。培养。2022-8-4 吉林农业大学 23在固体培养基中的生长情况：在固体培养基中的生长情况：在平板上形成在
16、平板上形成菌落菌落，在斜面上形成，在斜面上形成菌苔菌苔 在斜面上在斜面上画直线画直线2022-8-4 吉林农业大学 24罗氏培罗氏培养基养基2022-8-4 吉林农业大学 25l霉菌的菌落较大，有的霉菌菌落可扩霉菌的菌落较大，有的霉菌菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性。菌落呈现或紧或松的蛛网状、局限性。菌落呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。色和边缘与中心的颜色常不一致。l细菌菌落常表现为细菌菌落常表现为湿润
17、、粘稠、光滑、湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀较透明、易挑取、质地均匀以及菌落以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落特征因种而异。细菌的菌落特征因种而异。2022-8-4 吉林农业大学 26放线菌在固体培养基上形放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，成与细菌不同的菌落特征，放线菌菌丝相互交错缠绕放线菌菌丝相互交错缠绕形成形成质地致密的小菌落，质地致密的小菌落，干燥、不透明干燥、不透明、难以挑取，、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为面时，就形成表面为粉末粉末状或颗粒状状或颗粒状的典型放线菌的典
18、型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。正反面呈现出不同的色泽。2022-8-4 吉林农业大学 27 让某种细菌在液体培养基中生长数让某种细菌在液体培养基中生长数d d后观察、后观察、记载以下内容：记载以下内容：l液体培养基液体培养基表面菌膜表面菌膜颜色、表面特征、颜色、表面特征、l是否生成是否生成沉淀沉淀、产酸产气产酸产气、l是否有是否有色素分泌色素分泌、l生长速度快慢等。生长速度快慢等。同时要记载培养基种类同时要记载培养基种类(成分及成分及pH)pH)和培养温和培养温度、光照条件。度、光照条件。2022-8-4
19、 吉林农业大学 28细菌在液体培养基中的生长情况细菌在液体培养基中的生长情况 多数呈均匀多数呈均匀混浊混浊状态状态少数链状菌少数链状菌呈呈沉淀沉淀生长生长专性需氧菌则在表面专性需氧菌则在表面生长，常形成生长，常形成菌膜菌膜菌膜菌膜2022-8-4 吉林农业大学 29产气产气生成沉淀生成沉淀表面菌膜表面菌膜2022-8-4 吉林农业大学 30在半固体培养基中的生长情况：在半固体培养基中的生长情况：常用于观察细菌动力常用于观察细菌动力 有鞭毛的细菌可沿有鞭毛的细菌可沿穿刺线穿刺线呈呈羽毛状羽毛状或或云雾状云雾状混浊生长混浊生长无鞭毛细菌则只能沿无鞭毛细菌则只能沿穿刺线穿刺线呈明显的呈明显的线状线状
20、生长生长2022-8-4 吉林农业大学 31（一）菌种保存的目标（一）菌种保存的目标 细菌菌种保存的目标、方法和真菌大同小异。细菌菌种保存的目标、方法和真菌大同小异。l菌种保存的目标是：菌种保存的目标是：不会因贮藏条件不妥而不会因贮藏条件不妥而死亡死亡，不因保存方法不当而发生不因保存方法不当而发生变异变异，不被其他生物不被其他生物污染污染。为此目标，为此目标，l通常采用通常采用抑制病原物代谢活动抑制病原物代谢活动的方式以延长其存活并的方式以延长其存活并减少变异，如放置于减少变异，如放置于低温、干燥、缺氧低温、干燥、缺氧条件下。条件下。l或将其培养基或将其培养基养分降低养分降低到原来的到原来的1
21、/21/2。2022-8-4 吉林农业大学 321.1.室温保存室温保存 许多细菌的斜面培养，只要放在温度变化不大的室温许多细菌的斜面培养，只要放在温度变化不大的室温即可。室温保存缺点是培养基易干燥，要及时移植。即可。室温保存缺点是培养基易干燥，要及时移植。2.2.低温保存低温保存 将菌种棉塞部分用油纸包好，置将菌种棉塞部分用油纸包好，置2 288的冰箱中保的冰箱中保藏。是最常用的保存菌种的方法。为防止培养基干燥，藏。是最常用的保存菌种的方法。为防止培养基干燥，每每3-43-4周即要移植一次。而黄单胞菌及周即要移植一次。而黄单胞菌及G+G+各属各属1-21-2周即应周即应移殖。黄单胞菌产酸多，
22、培养基中可加入移殖。黄单胞菌产酸多，培养基中可加入2 2碳酸钙粉以碳酸钙粉以降低降低pHpH或用或用YDCYDC培养基保存。培养基保存。如放在如放在2020或或8080冰箱中及液氮罐中，则存活期冰箱中及液氮罐中，则存活期可以更长。可以更长。2022-8-4 吉林农业大学 333.3.石蜡油保存石蜡油保存 利用灭菌的矿物油利用灭菌的矿物油(液体石蜡液体石蜡)灌在斜面菌种的表面，其高度灌在斜面菌种的表面，其高度超过斜面顶部超过斜面顶部1cm1cm，以隔绝菌种与空气接触。无芽孢的细菌也可，以隔绝菌种与空气接触。无芽孢的细菌也可保存一年左右。保存一年左右。4.4.灭菌蒸馏水悬浮保存灭菌蒸馏水悬浮保存
23、很多细菌可采用蒸馏水保存法，即把细菌悬液放在灭菌蒸馏很多细菌可采用蒸馏水保存法，即把细菌悬液放在灭菌蒸馏水小管中，加橡皮塞密封后置室温下，是较好的保存方法。水小管中，加橡皮塞密封后置室温下，是较好的保存方法。5.5.冷冻真空干燥保存法冷冻真空干燥保存法(冻干保存法冻干保存法)绝大多数的细菌均可采用冻干法长期保存。绝大多数的细菌均可采用冻干法长期保存。冷冻干燥保藏法的步骤包括两部分，即首先在极低温度下冷冻干燥保藏法的步骤包括两部分，即首先在极低温度下(7070左右左右)快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥。这样可使快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥。这样可使细胞的结构与成分保持原来的状态。细胞的结
24、构与成分保持原来的状态。2022-8-4 吉林农业大学 34l血球计数板法血球计数板法l混浊度计数法混浊度计数法分光光度计分光光度计麦法兰云度计麦法兰云度计l稀释平板法稀释平板法l制片显微计数法制片显微计数法2022-8-4 吉林农业大学 35血球计数板法血球计数板法使用方法同真菌孢子计数法一样。使用方法同真菌孢子计数法一样。适用范围：适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不太适不太适用于细菌等个体较小的细胞。用于细菌等个体较小的细胞。因为因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。）
25、在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。针对这些问题，可以采用针对这些问题，可以采用高倍镜观察，分层高倍镜观察，分层观察观察的方法。的方法。2022-8-4 吉林农业大学 36分光光度计：分光光度计：由于细菌悬液浓度越大则消光度越大，由于细菌悬液浓度越大则消光度越大，因此可制定细菌悬液浓度与消光度关系的标准曲线，用分光因此可制定细菌悬液浓度与消光度关系的标准曲线，用分光光度计测定细菌数目。光度计测定细菌数目。麦法兰云度计：麦法兰云度计：将将1 1BaclBacl2 2和和1 1H H2 2SOSO4 4按不同比例混合，按不同比例混合，形成数量不同形成数量不同的的BaSOBaSO4 4细微颗粒悬
26、浮在液体中，细微颗粒悬浮在液体中，其混浊度和细菌的不同浓度相对应。其混浊度和细菌的不同浓度相对应。q这两种方法都可以测定细菌的数量。这两种方法都可以测定细菌的数量。q但，植物组织中的色素也会影响消光度，所以测定植物组织但，植物组织中的色素也会影响消光度，所以测定植物组织中的细菌数量时要注意数据校正。中的细菌数量时要注意数据校正。2022-8-4 吉林农业大学 37稀释平板法的大体做法为：稀释平板法的大体做法为：l将将菌悬液菌悬液进行适当进行适当稀释稀释（使其在平板培养基上可以生长出（使其在平板培养基上可以生长出10-3010-30个的菌落为适），个的菌落为适），l置灭菌培养皿内和约置灭菌培养皿
27、内和约5050的的培养基均匀混合培养基均匀混合，凝成，凝成平板平板。l在在2525培养数培养数d d，待平板上，待平板上长出菌落长出菌落后，后，l根据根据目标菌菌落特征目标菌菌落特征计算出平均每个平板上的计算出平均每个平板上的菌落数菌落数，再，再乘以总的稀释倍数乘以总的稀释倍数，l即可得出菌悬液中的细菌数。即可得出菌悬液中的细菌数。2022-8-4 吉林农业大学 382022-8-4 吉林农业大学 39做法：做法：l将菌悬液在载玻片的将菌悬液在载玻片的画定的小区域画定的小区域内涂抹均匀，不让内涂抹均匀，不让细菌菌体重叠，过酒精灯火焰固定菌体，并进行染色。细菌菌体重叠，过酒精灯火焰固定菌体，并进
28、行染色。l在显微镜下观察在显微镜下观察3030个视野，查得个视野，查得每视野内细菌平均数每视野内细菌平均数。l根据画定的小区域面积和显微镜视野面积的根据画定的小区域面积和显微镜视野面积的比值比值计算，计算，得出小区域内细菌数目，即可得出菌悬液中的细菌数。得出小区域内细菌数目，即可得出菌悬液中的细菌数。2022-8-4 吉林农业大学 40l接种体的准备接种体的准备l常用接种方法常用接种方法l接种后的观察记载接种后的观察记载2022-8-4 吉林农业大学 411.1.利用保存的病组织利用保存的病组织l对于接种仅为了引起寄主植物发病，而不为了精确对于接种仅为了引起寄主植物发病，而不为了精确测定致病性
29、时可以采用此法。测定致病性时可以采用此法。l黄瓜细菌性角斑病干燥病叶保存于室内越冬后，黄瓜细菌性角斑病干燥病叶保存于室内越冬后，次年春季将病叶捣碎浸泡于次年春季将病叶捣碎浸泡于10-3010-30倍重量的水中倍重量的水中1h1h，滤出病叶残体，即可用于接种。滤出病叶残体，即可用于接种。l水稻白叶枯病叶切成小段，加入约水稻白叶枯病叶切成小段，加入约1010倍重量的水，倍重量的水，浸泡浸泡1-2h1-2h，纱布过滤后得到菌悬液，即可用于接种。，纱布过滤后得到菌悬液，即可用于接种。2022-8-4 吉林农业大学 422.2.利用人工培养基培养利用人工培养基培养l采用斜面或平板培养基采用斜面或平板培养
30、基：NANA等培养基。等培养基。l采用适当的培养时间采用适当的培养时间 通常培养时间在通常培养时间在48h48h较好。较好。时间过短，细菌菌体数量太少，时间过短，细菌菌体数量太少，时间过长则细菌致病力减退。时间过长则细菌致病力减退。2022-8-4 吉林农业大学 43 菌悬液的浓度：菌悬液的浓度：l通常菌悬液的浓度为通常菌悬液的浓度为1 110107-87-8cfu/mLcfu/mL。简易判断此浓度的方法简易判断此浓度的方法：在盛有菌悬液的试管后面放一张报纸，可见到明显字块，在盛有菌悬液的试管后面放一张报纸，可见到明显字块，可辨认出模糊字形可辨认出模糊字形时，大体上为此浓度。时，大体上为此浓度
31、。l浓度小，细菌数量太少，细菌接种不易成功。浓度小，细菌数量太少，细菌接种不易成功。l浓度过高，细菌数量太多，易产生浓度过高，细菌数量太多，易产生过敏反应过敏反应，使非寄主植，使非寄主植物也可出现物也可出现“症状症状”；或发病过重而不能代表田间实际情；或发病过重而不能代表田间实际情况。况。2022-8-4 吉林农业大学 441.1.利用菌悬液：利用菌悬液：针刺针刺法（单针、多针、连续针刺）；法（单针、多针、连续针刺）；喷雾喷雾法（常规喷雾、高压喷雾：压强可为法（常规喷雾、高压喷雾：压强可为0.10.10.2MPa0.2MPa）；）；摩擦摩擦接种（用纱布蘸菌悬液摩擦接种部位）法；接种（用纱布蘸菌
32、悬液摩擦接种部位）法；剪叶剪叶接种法；接种法；注射注射接种（常用于茎部接种）法；接种（常用于茎部接种）法；沾根沾根接种法；接种法；灌注土壤灌注土壤法；法；灌心叶灌心叶法。法。2022-8-4 吉林农业大学 452.2.直接利用直接利用种子、无性繁殖材料种子、无性繁殖材料或或土壤土壤中中自然带有的自然带有的病原体病原体，散布于田间，或直，散布于田间，或直接散布于接散布于播种床播种床等处。等处。2022-8-4 吉林农业大学 46掌握适当的接种量，掌握适当的接种量，过少不易发病，过少不易发病，过多不代表田间自然情况。过多不代表田间自然情况。2.2.为保证接种成功，需注意以下几点：为保证接种成功，需
33、注意以下几点：寄主植物要寄主植物要感病感病（品种、生育期、接种部位）。（品种、生育期、接种部位）。接种后经常需要接种后经常需要保湿保湿151524h24h或更多时间。或更多时间。创造适宜发病的创造适宜发病的条件条件：温度、湿度、光照、：温度、湿度、光照、pHpH、养分供应。、养分供应。需要大量反复接种时可采取设置需要大量反复接种时可采取设置“诱病行诱病行”办法。办法。2022-8-4 吉林农业大学 47接种后的观察记载接种后的观察记载项目项目：l植物生长及发病植物生长及发病条件条件；l发病发病过程过程；l病害的病害的潜育期潜育期、显症期、逐日显症率、累积显症率；、显症期、逐日显症率、累积显症率
34、；l病害的典型病害的典型症状症状、非典型症状；、非典型症状；l危害危害程度。程度。2022-8-4 吉林农业大学 48(一）病原细菌属的鉴定一）病原细菌属的鉴定l由于细菌的鉴定工作比较困难，在植保专业本科阶由于细菌的鉴定工作比较困难，在植保专业本科阶段主要学习常见属的鉴定。段主要学习常见属的鉴定。l鉴定主要依据鉴定主要依据革兰氏染色革兰氏染色以及在多种以及在多种选择性培养基选择性培养基上的生长情况来进行。上的生长情况来进行。l之所以不采用细菌的鞭毛染色进行分属，是因为细之所以不采用细菌的鞭毛染色进行分属，是因为细菌的鞭毛染色较困难，不易成功。菌的鞭毛染色较困难，不易成功。待测细菌待测细菌 革兰
35、氏染色革兰氏染色lG G+l 菌体短杆状菌体短杆状 CurtrbacteriumCurtrbacterium（短杆菌属）（短杆菌属）菌体短杆状、棒状，可见到菌体短杆状、棒状，可见到“v”v”或或“L”L”形，形，ClavibacterClavibacter lGG-（E E、X X、P P、A A）u 在在YDCYDC培养基上产生黄色菌落（阳性）（培养基上产生黄色菌落（阳性）（E E、X X）在在MSMS或或CVPCVP培养基上生长（阳性）培养基上生长（阳性）ErwiniaErwinia 在在MSMS或或CVPCVP培养基上生长（阴性）培养基上生长（阴性）XanthomonasXanthomo
36、nasu 在在YDCYDC培养基上产生黄色菌落（阴性培养基上产生黄色菌落（阴性）（）（E E、P P、A A）在在KBKB培养基上产生荧光色素（阳性）培养基上产生荧光色素（阳性）PseudomonasPseudomonas 在在KBKB培养基上产生荧光色素（阴性）（培养基上产生荧光色素（阴性）（E E、P P、A A）p 在在MSMS或或CVPCVP培养基上生长（阳性）培养基上生长（阳性）ErwiniaErwiniap 在在MSMS或或CVPCVP培养基上生长（阴性）培养基上生长（阴性）（P P、A A）在在D1D1培养基上生长（阳性）培养基上生长（阳性）AgrobacteriumAgroba
37、cterium 在在D1D1培养基上生长（阴性培养基上生长（阴性）PseudomonasPseudomonas 2022-8-4 吉林农业大学 50l伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细菌学手册Bergeys manual of systematic bacteriology(second edition,2004)l原书名为原书名为伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册,（Bergeys Manual of Determinative Bacteriology），），19231923年第年第1 1版，后相继版，后相继出版了第出版了第2 2至第至第8 8版，每个版本都反映了当时细菌学发展的新成就
38、。版，每个版本都反映了当时细菌学发展的新成就。l第第9 9版由于内容增加，范围扩大，同时指出各类细菌间的关系，所以改名为版由于内容增加，范围扩大，同时指出各类细菌间的关系，所以改名为伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细菌学手册l第一版第一版 19841984年问世，至年问世，至19891989年出齐，共年出齐，共4 4卷。卷。l第二版第二版 由由George GarrityGeorge Garrity主编分为主编分为5 5卷，从卷，从20002000年起陆续出版。这一版纳入年起陆续出版。这一版纳入了研究核糖体了研究核糖体RNARNA测序所产生的系统发育分类系统。测序所产生的系统发育分类系统。202
39、2-8-4 吉林农业大学 51初染初染：草酸铵：草酸铵结晶紫结晶紫媒染媒染：革兰氏：革兰氏碘液碘液脱色脱色：95%酒精酒精复染复染：石炭酸：石炭酸复红复红2022-8-4 吉林农业大学 52G G菌菌：l细胞壁厚，当细胞壁厚，当乙醇脱色乙醇脱色时，时，肽聚糖脱水而使孔隙缩小肽聚糖脱水而使孔隙缩小，故，故保留保留结晶紫结晶紫-碘复合物碘复合物在细胞膜上在细胞膜上,呈紫色。呈紫色。GG菌菌：l肽聚糖层薄，交联松散，肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色乙醇脱色不能使其结构收缩，其不能使其结构收缩，其脂类含量高脂类含量高,乙醇将脂类溶解，缝隙加大乙醇将脂类溶解，缝隙加大，结晶紫，结晶紫-碘复合碘复合物溶出细
40、胞壁，复红物溶出细胞壁，复红复染后呈红色。复染后呈红色。2022-8-4 吉林农业大学 53（二）病原细菌种的鉴定（二）病原细菌种的鉴定l病原细菌病原细菌“种种”的鉴定工作比属的鉴定的鉴定工作比属的鉴定更为困难。更为困难。l鉴定主要依据细菌的形态、大小、染色鉴定主要依据细菌的形态、大小、染色反应、培养性状、生理生化性状、血清反应、培养性状、生理生化性状、血清学反应等。学反应等。2022-8-4 吉林农业大学 541.1.形态和染色形态和染色革兰氏染色阳性革兰氏染色阳性2022-8-4 吉林农业大学 55EMBEMB平板（伊红美蓝琼脂培养基）平板（伊红美蓝琼脂培养基）组成：无糖培养基乳糖伊红美蓝
41、组成：无糖培养基乳糖伊红美蓝 底物底物 指示剂、抑菌剂指示剂、抑菌剂 原理：原理：细菌细菌 乳糖乳糖 产酸：伊红美蓝产酸：伊红美蓝 紫黑紫黑/紫红紫红 结果：结果：分解乳糖细菌分解乳糖细菌 菌落变黑，有金属光泽菌落变黑，有金属光泽 不分解乳糖细菌不分解乳糖细菌 菌落无色、半透明（粉色）菌落无色、半透明（粉色）分解EMB agar2.2.培养特性培养特性（特殊培养基）（特殊培养基）2022-8-4 吉林农业大学 56色素色素有助于鉴别细菌，有两类：有助于鉴别细菌，有两类：水溶性色素、水溶性色素、脂溶性色素脂溶性色素红色红色柠檬色柠檬色白色白色特性特性 由于不同的由于不同的细菌可能具有不同的酶，代
42、可能具有不同的酶，代谢途径和代谢产物可能也有不同，生理生化谢途径和代谢产物可能也有不同，生理生化反应是反应是细菌分类鉴定的分类鉴定的重要指标重要指标。2022-8-4 吉林农业大学 58对照对照产酸产酸产酸产酸,产气产气2022-8-4 吉林农业大学 59VPVP test(test(伏普试验伏普试验)VPVP试验试验 阳性（红色）阴性（不变）阳性（红色）阴性（不变）2022-8-4 吉林农业大学 60吲哚吲哚(indol(indol)试验试验：吲哚试验吲哚试验阳性（液面红）阴性（阳性（液面红）阴性（液面液面黄）黄）2022-8-4 吉林农业大学 61正反应正反应(黑色黑色)负反应负反应(黄色
43、黄色)Hydrogen sulfide test(Hydrogen sulfide test(硫化氢试验硫化氢试验)2022-8-4 吉林农业大学 62尿素酶试验尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）阴性（黄）阳性（红）2022-8-4 吉林农业大学 63正反应产气泡正反应产气泡 负反应不产气泡负反应不产气泡 2022-8-4 吉林农业大学 64正反应蓝色正反应蓝色负反应不变色负反应不变色2022-8-4 吉林农业大学 65赖氨酸脱羧酶、丙二酸盐赖氨酸脱羧酶、丙二酸盐赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验对照对照 阳性（紫）阳性（紫）阴性（黄）阴性（黄）丙二酸盐试验丙二酸盐试验阳性（兰）阳性（兰）阴性（不变
44、）阴性（不变）2022-8-4 吉林农业大学 66微量多项试验鉴定系统微量多项试验鉴定系统（1）API 20 系统：系统：法国法国 Bio-梅里埃公司生产，有梅里埃公司生产，有 很多很多 种不同的生化反应，可鉴定种不同的生化反应，可鉴定 700 多种细菌，多种细菌，分不同系列，如分不同系列，如 20A厌氧菌，厌氧菌，20E肠道菌。肠道菌。（2）Biolog 系统：系统：美国安普公司生产，可自动化美国安普公司生产，可自动化鉴定，可鉴定鉴定，可鉴定 1140 种细菌。种细菌。（3）其他：）其他：众多。众多。（4）国产：国产：众多。众多。2022-8-4671 1、API API 细菌数值鉴定系统细
45、菌数值鉴定系统菌种菌种基本培养基基本培养基（液体）（液体）菌悬液菌悬液检测、编码、查表、鉴定检测、编码、查表、鉴定AnalyticaAnalytica Products INC Products INC的简的简称。目前中国各级疾病预防控称。目前中国各级疾病预防控制机构在细菌学检验中比较多制机构在细菌学检验中比较多地应用了此项技术地应用了此项技术 每个管中含有每个管中含有不同的底物，不同的底物，菌悬液加入培菌悬液加入培养养后后将发生生将发生生理生化变化。理生化变化。2022-8-468 在在9696孔的细菌培养板上检测微生物对孔的细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。不同
46、发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。自动化、快速自动化、快速每个孔中含有每个孔中含有不同的底物不同的底物菌悬液或菌悬液或无菌水无菌水2022-8-4 吉林农业大学 692022-8-4 吉林农业大学 7016S rRNA16S rRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的分子计时器被普遍公认为是一把好的谱系分析的分子计时器1 1）核糖体是细菌唯一的细胞器）核糖体是细菌唯一的细胞器,是蛋白质合成的场所。是蛋白质合成的场所。普遍存在普遍存在于各种细菌细胞内。于各种细菌细胞内。2 2）在）在16SrRNA16SrRNA分子中，既含有分子中，既含有高度保守高度保守的序列区域，又有的序列区域，又有中度保守中度
47、保守和和高度变化高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；亲缘关系的研究；3 3）16SrRNA16SrRNA分子量大小适中分子量大小适中，便于序列分析；，便于序列分析；4 4）rRNArRNA在细胞中含量大在细胞中含量大(约占细胞中约占细胞中RNARNA的的90%)90%)，也，也易于提取易于提取。2022-8-4 吉林农业大学 71l提取细菌总提取细菌总 DNA DNA PCR PCR 扩增扩增 16S rDNA 16S rDNA lPCR PCR 产物纯化序列分析产物纯化序列分析 物种确认与基因比较物种确认与基因比
48、较 （GeneBank&gene software GeneBank&gene software）l一般认为，一般认为，16S rDNA16S rDNA序列同源性小于序列同源性小于98%98%，可以认为属于不，可以认为属于不同的种，同源性小于同的种，同源性小于93%-95%93%-95%，可以认为属于不同的属。，可以认为属于不同的属。2022-8-4 吉林农业大学 721.1.袁美丽等著袁美丽等著：吉林省栽培植物细菌病害志，吉林科学：吉林省栽培植物细菌病害志，吉林科学技术出版社，技术出版社，19921992 本书中不仅全面描述了吉林省本书中不仅全面描述了吉林省125125种植物上的细菌种植物上
49、的细菌性病害和细菌性病害的诊断方法，而且详尽介绍了性病害和细菌性病害的诊断方法，而且详尽介绍了YDCYDC、MSMS、CVPCVP 、KBKB、D1D1等培养基的配方，病原细菌等培养基的配方，病原细菌“种种”的鉴定中应用的各种测定方法。的鉴定中应用的各种测定方法。2.2.方中达著方中达著：植病研究方法（第三版）：植病研究方法（第三版）,中国农业出版社，中国农业出版社，19981998 3.3.王金生著王金生著:植物病原细菌学，中国农业出版社植物病原细菌学，中国农业出版社,2000 ,2000 2022-8-4 吉林农业大学 73l请批评指正！2022-8-4 吉林农业大学 74植物病理学植物病
50、理学基础研究方法基础研究方法 第五章第五章 杀菌剂筛选的杀菌剂筛选的 生物测定技术生物测定技术2022-8-4 吉林农业大学 75第一节第一节 杀菌剂的室内毒力测定杀菌剂的室内毒力测定第二节第二节 杀菌剂的田间药效测定杀菌剂的田间药效测定2022-8-4 吉林农业大学 76第一节第一节 杀菌剂的杀菌剂的 室内毒力测定室内毒力测定2022-8-4 吉林农业大学 77一一.杀菌剂相对毒力的室内测定杀菌剂相对毒力的室内测定 从定性角度比较不同药剂的相对毒力大小；从定性角度比较不同药剂的相对毒力大小；二二.化学农药毒力回归线的建立及化学农药毒力回归线的建立及ECEC5050的推算的推算 从定量角度研究
