1、第第 十二章十二章 基因工程基因工程第第 1节节 基因工程概述基因工程概述第第 2节节 基因的分离基因的分离第第 3节节 外源基因导入受体外源基因导入受体第第 4节节 转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定第第 5节节 基因工程的应用基因工程的应用The future of gene engineering:Can human fly?遗传工程（遗传工程（genetic engineering），也称），也称生生物工程物工程，是指：利用工程技术的方法改造和，是指：利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手
2、段。而改良生物体的一种遗传学手段。细胞工程（细胞工程（cell engineering）基因工程（基因工程（gene engineering）酶工程（酶工程（enzyme engineering）发酵工程（发酵工程（fermentation engineering）第第 1节节 基因工程概述基因工程概述基因工程（基因工程（gene engineering）l利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行行切割切割、拼接拼接和和重组重组，获得，获得重组重组DNA分子，分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变
3、的过程。性得到修饰或改变的过程。l基因工程操作的对象是基因工程操作的对象是DNA分子，分子，首先首先把把目标基因克隆出来插入到一定的载体中，目标基因克隆出来插入到一定的载体中，然然后后将重组将重组DNA分子导入到受体细胞，并使其分子导入到受体细胞，并使其保持和遗传下去。保持和遗传下去。第第 1节节 基因工程概述基因工程概述u目的基因的获得目的基因的获得u目的基因与载体连接成重组目的基因与载体连接成重组DNADNA分子分子u重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞u筛选重组克隆筛选重组克隆u基因表达与产物分离基因表达与产物分离基因工程的内容 第第 1节节 基因工程概述基因工程概述第第
4、 2节节 基因的分离基因的分离一一 工具酶工具酶二二 载体载体三三 基因分离方法基因分离方法 The future of genetic engineering?第第 2节节 基因的分离基因的分离一、工具酶一、工具酶（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restriction enzymes)限制性内切核酸酶（限制酶）是限制性内切核酸酶（限制酶）是细菌细菌中降解外中降解外来来DNA分子的一类酶。分子的一类酶。细菌中限制细菌中限制修饰现象：修饰现象：作用于同一作用于同一DNA的两的两种酶种酶分解分解DNA的的限制酶限制酶和改变和改变DNA碱基碱基结构使其免遭限制酶分解的结构使其免遭限制酶
5、分解的修饰酶修饰酶。通过某些。通过某些碱基进行甲基化修饰，使得限制酶不能进行切碱基进行甲基化修饰，使得限制酶不能进行切割。而外来的割。而外来的DNA没有被甲基化，限制酶将其没有被甲基化，限制酶将其降解。降解。（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶共同的特性：共同的特性：只切割双链只切割双链DNA分分子，不切单链子，不切单链DNA；每种酶有其特定的每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异核苷酸序列识别特异性；性；需要镁离子激活等。需要镁离子激活等。限制酶可分为限制酶可分为3类。类。（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶限制酶限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列：作用于特定（异）核苷酸序列 的
6、的磷酸二脂酶磷酸二脂酶；型酶型酶：仅：仅EcoEcoB B和和EcoEcoK K两种，催化限制两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸性切割和修饰核苷酸2 2种功能；种功能；型酶型酶：基因工程中应用最广泛；：基因工程中应用最广泛；型酶型酶：具有特异的识别位点，识别位：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的。点是非对称的。（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶通过用相通过用相同的限制同的限制性内切核性内切核酸酶切割酸酶切割形成一个形成一个重组重组DNA分子分子（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（二）（二）DNA连接酶（连接酶（ligase）在分子克隆中使用在分子克隆中使用的的DNA连
7、接酶有两种：连接酶有两种：大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶和和T4 DNA连接酶连接酶。催化催化DNA中相邻的中相邻的3 OH和和5 磷酸基磷酸基末端之间形成末端之间形成磷酸二磷酸二酯键酯键并把两段并把两段DNA连连接起来。接起来。（三）（三）反转录酶反转录酶（reverse transcriptase）反转录酶是一类以反转录酶是一类以RNA为模板来指导为模板来指导DNA合成的合成的DNA聚合聚合酶，所以又称为依赖于酶，所以又称为依赖于RNA的的DNA聚合酶。聚合酶。反转录酶在遗传工程反转录酶在遗传工程中的主要用途是以中的主要用途是以mRNA为模板合成为模板合成cDNA。第第 2节节 基因的
8、分离基因的分离1 1、工具酶：、工具酶：1 1、内切酶、内切酶2 2、连接酶、连接酶3 3、反转录酶、反转录酶 4 4、DNADNA聚合酶聚合酶(TaqTaq)-)-PCRPCR第第 1节节 基因工程的概念基因工程的概念（四）（四）聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是体外快是体外快速扩增速扩增DNA的方法的方法。PCR反应包括三个步骤：反应包括三个步骤：变性：变性：在在94-9594-95使模板使模板DNADNA的双的双链变性成单链。链变性成单链。复性复性：两个引物分别与单链两个引物分别与单链DNAD
9、NA互补复性，复性的温度在互补复性，复性的温度在50-6050-60 延伸延伸：在引物的引导及：在引物的引导及TaqTaq酶的酶的作用下，于作用下，于7272合成模板合成模板DNADNA的互补的互补链链 这三个步骤称为一个循环，这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有反应常有25-35个循环。个循环。The Polymerase Chain Reaction(animations)A T G A C G A T C G A G T A T A C T G C T A G C T CACT G PCR产物可以通过产物可以通过电泳检测电泳检测琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（
10、四）（四）聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)第第 2节节 基因的分离基因的分离一一 工具酶工具酶2 2 载体载体 二二 载体载体 载体（载体（vectorvector）是将外源基因送入受体细胞的）是将外源基因送入受体细胞的工具。工具。作为载体作为载体DNADNA分子，需要具备：分子，需要具备：在宿主细胞中能独立复制，有独立的复制起始位点；载体DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，即有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增；有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主细胞；分子量小，多拷贝，易于操作。除了上述特点外，一般还要求载体载荷外源DNA的幅度要宽
11、，具有安全性等。（一）（一）质粒质粒 质粒质粒(plasmid)是细菌染色体外存在的一种是细菌染色体外存在的一种能够自我复制的能够自我复制的双链闭合环状双链闭合环状DNA分子，大分子，大小小1kb200kb。质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因，质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。抗抗生素的基因等等。一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。质粒质粒DNA复制与宿主之间的关系，可分为复制与宿主之间的关系，可分为“严严谨型谨型”和和“松弛型松弛型”。“严谨型严谨型”质粒在每个质粒在每个细胞中的拷贝数通常细胞中的拷贝数通常13个，
12、而个，而“松弛型松弛型”通通常在常在10个以上，可高达个以上，可高达200个拷贝。个拷贝。一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。（一）（一）质粒质粒 pUC18可以克隆比较大的可以克隆比较大的DNA片段，在细胞片段，在细胞中产生中产生500个拷贝左右。个拷贝左右。有一个多克隆位点，位于大肠杆菌的有一个多克隆位点，位于大肠杆菌的lacZ基基因因之内，有利于筛选和分离转化细胞。之内，有利于筛选和分离转化细胞。筛选的原理是：筛选的原理是：细细菌细胞含有野生质粒，菌细胞含有野生质粒，在含有在含有X-gal（5-溴溴-氯吲哚氯吲哚-半乳糖苷酶半乳糖苷酶）的培养基上培养时
13、产的培养基上培养时产生生兰色菌斑兰色菌斑；插入克；插入克隆片段后，隆片段后，lacZ基因基因失去功能，不能代谢失去功能，不能代谢X-gal，从而产生，从而产生白白色菌斑。色菌斑。（一）（一）质粒质粒（二）（二）病毒载体病毒载体 噬菌体基因组噬菌体基因组全长全长48kb。中间约。中间约1/3的序的序列为列为中间基因簇中间基因簇(central gene cluster)，两端为两端为DNA左、右臂。左、右臂。基因组的基因组的中间基因簇中间基因簇序列序列可被外源可被外源DNA片片段取代段取代,而不影响噬菌而不影响噬菌体感染细菌及形成噬体感染细菌及形成噬菌斑的能力。菌斑的能力。噬菌体噬菌体（二）（二
14、）病毒载体病毒载体 噬菌体载体可接受噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，广泛用于为表达载体，广泛用于各类基因库各类基因库的构建，的构建，多用于多用于cDNA文库文库的构建。的构建。(三三)克隆大片段载体克隆大片段载体粘粒载体粘粒载体、细菌人工染色体细菌人工染色体和和酵母人工染色体酵母人工染色体载体等。载体等。u粘粒载体粘粒载体（cosmid）是一类含有是一类含有cos位点的位点的质粒载体质粒载体.u兼有兼有噬菌体的高效噬菌体的高效感染能力感染能力和和质粒的易于质粒的易于克隆和选择克隆和选择的优点，既
15、的优点，既能像质粒一样在寄主细能像质粒一样在寄主细胞内复制，又能象胞内复制，又能象DNA一样被包装到噬一样被包装到噬菌体颗粒中去。菌体颗粒中去。与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：具有具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制；杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制；有像质粒一样的选择标记；有像质粒一样的选择标记；cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可载体比较小，但能插入较大的外源片段，可克隆外源片段的长度在克隆外源片段的长度在1545 kb之间。之间。由于
16、由于cosmid载体的大片段克隆能力，多用载体的大片段克隆能力，多用于于基因组文库基因组文库的构建。已有多种粘粒载体可用的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克隆，于基因克隆，pJB8是最常用的粘粒载体之一是最常用的粘粒载体之一粘粒载体粘粒载体细菌人工染色体细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）BAC载体是基于细菌的载体是基于细菌的性因子性因子(F因子因子)质粒质粒的的一些特点构建的。一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移因子在细菌接合时转移1Mb（106bp）的细菌染色体片段。将）的细菌染色体片段。将F因子经基因工因子经基因工程改良构成的程改良构
17、成的BAC载体，可用于克隆载体，可用于克隆100 kb以上以上的的DNA片段。片段。带有外源片段的带有外源片段的BACBAC载体在细菌细胞中通常仅单载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持个拷贝，这一特点有利于保持DNADNA大分子，在细胞大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。内稳定复制而不发生重组。BACBAC载体本身分子量小载体本身分子量小，具有具有氯霉素氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。抗性选择基因及多克隆位点。酵母人工染色体酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）酵母人工染色体酵母人工染色体是另一类酵母穿梭载体。是另一类酵母穿梭载体。具有
18、具有自主复制序列自主复制序列、克隆位点克隆位点以及可在细菌以及可在细菌和酵母菌中选择的和酵母菌中选择的标记基因标记基因。YAC可以接受可以接受100-1000 kb的外源的外源DNA片段，片段，这一特点使这一特点使YAC成为成为人类基因组计划人类基因组计划及及图位图位克隆克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体类人工染色体(human artificial chromosome，HAC)的研究。的研究。三三 基因分离方法基因分离方法 基于基因库的分离基因方法基于基因库的分离基因方法 T-DNA标签克隆基因标签克隆基因 基于基于PCR的基因克隆的基因克
19、隆 人工合成基因人工合成基因1 构建基因库构建基因库 基因库基因库(library)是一组是一组DNA和和cDNA序列序列克隆的集合体。从基因库中克隆的集合体。从基因库中分离基因分离基因，首，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。分子遗传学工作才能继续深入下去。（一）（一）基于基因库的分离基因方法基于基因库的分离基因方法 National Gene Bank in Korea核基因库核基因库 核基因库核基因库(genomic library或或genomi
20、c bank)是将某一生物的全部基因组是将某一生物的全部基因组DNA酶酶切后与载体连接构建而成的。切后与载体连接构建而成的。通常的方法是，尽量提取大分子量的核通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNADNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度一定长度(大于大于15kb)15kb)的的DNADNA片段片段，与适宜，与适宜的载体连接构成重组的载体连接构成重组DNADNA分子分子,选择相应选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒质粒，噬菌体噬菌体，BACBAC或或YACYAC等等（一）（一）基于基因库的分离基因方法基于基因库的分离基因
21、方法 染色体基因库染色体基因库 将基因组的一部分（将基因组的一部分（如一条染色体如一条染色体）用来构）用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。构和组织十分有价值。果蝇果蝇X X染色体上的一个片段，具有染色体上的一个片段，具有5050多个多线染色多个多线染色体带，利用体带，利用微切割技术微切割技术切割，抽提切割，抽提DNADNA，构建染色体，构建染色体片段基因库。片段基因库。在人类基因组项目研究中，利用在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术流动细胞分拣技术将人类染色体分开，构建单个染色体基因库，大大将人类染色体分开，构建单个
22、染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。加速了人类基因组作图和分析。在酵母菌中，利用一种改良的在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳方法脉冲电泳方法，将酵，将酵母菌的母菌的1616条染色体分开，用于构建染色体库。条染色体分开，用于构建染色体库。cDNA库库 以以mRNA为模板，经反为模板，经反转录酶合成互补转录酶合成互补DNA(cDNA)，构建的基因库。，构建的基因库。绝大多数真核生物绝大多数真核生物mRNA的的3端具有一段多端具有一段多聚聚A(poly-A)尾端序列。尾端序列。在反转录酶作用下，用在反转录酶作用下，用poly-T引物引物(primer)，引，引导合成一条互补导合成一条互补D
23、NA，即，即第一条第一条DNA链，形成链，形成RNA-DNA杂合双链。然杂合双链。然后合成第后合成第2条链。条链。cDNA库仅具有用于分离库仅具有用于分离mRNA的细胞或的细胞或组织内表达的基因的组织内表达的基因的mRNA序列，仅包括基序列，仅包括基因组的部分基因序列。因组的部分基因序列。构建什么样的基因库取决于研究目的。构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA 库对于研究基因的表达模式、分离某库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。如分离在某一细一特定基因是十分有用的。如分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因。胞或组织高效表达的某种基因。通常是将通常是将cDNA库与核基因库
24、配合库与核基因库配合使用，使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。因的调控序列。cDNA库库 2 筛选基因库筛选基因库 从基因库中筛选、分离基因，可据对待选从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。条件。常用方法是利用一段核苷酸序列常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸或寡核苷酸)作作探针探针(probe)，用放射性，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。抗体作探针，筛选基因库
25、。菌落杂交技术寻找目标菌落杂交技术寻找目标DNA克隆克隆从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行测序才能进行生物信息分析和功能预测。测序才能进行生物信息分析和功能预测。3、序列测定和分析、序列测定和分析DNA sequencing（二）（二）T-DNA标签克隆基因标签克隆基因基本原理：基本原理：利用利用T-DNA插入突变创造突变体，获得插入突变创造突变体，获得各突变体的各突变体的纯合材料纯合材料；然后分析突变性状与然后分析突变性状与T-DNA的共分离关的共分离关系，存在共分离的材料用适当的系，存在共分离的材料用适当的PCR克隆克隆技术获得技术获得T-DNA的的侧
26、翼基因组序列侧翼基因组序列；用其作探针用其作探针筛选基因文库筛选基因文库，获取目标基，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析因或克隆，再进行下一步的分析。T-DNA 载体构建载体构建转化植物（转化植物（T1，T-DNA杂合子杂合子)收获收获T2种子种子筛选筛选T2，获突变子，应为，获突变子，应为3:1分离分离确定确定T-DNA与突变型共分离的个体与突变型共分离的个体产生纯合后代产生纯合后代克隆克隆T-DNA两侧的植物两侧的植物DNA利用侧翼利用侧翼DNA序列作探针从该植物的序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因文库中钓取基因基因功能的验证基因功能的验证（三）基于（三）基于PCR的基因克隆的
27、基因克隆基于基于PCR的的DNA克隆与基于载体的克隆技克隆与基于载体的克隆技术相比具有一定优越性。术相比具有一定优越性。PCR反应速度很快，可以在几个小时内反应速度很快，可以在几个小时内完成，而载体克隆需要几周时间。完成，而载体克隆需要几周时间。PCR反应非常灵敏，可以用来扩增痕量反应非常灵敏，可以用来扩增痕量样品的样品的DNA。对于部分降解、甚至污染，用载体克隆对于部分降解、甚至污染，用载体克隆无法进行的无法进行的DNA样品，样品，PCR扩增仍可获得扩增仍可获得目的基因克隆。目的基因克隆。（四）（四）人工合成基因人工合成基因 根据已知的根据已知的基因或氨基酸基因或氨基酸序列，将化学合成序列，
28、将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。来，可以很快地人工合成基因。例如，首先化学合成多个含有例如，首先化学合成多个含有80-100个核苷个核苷酸的寡核苷酸酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有，每个寡核苷酸之间具有19-24个个核苷酸的重叠序列核苷酸的重叠序列，再将各个寡核苷酸等量混，再将各个寡核苷酸等量混合，在合，在DNA聚合酶聚合酶(或或Taq酶酶)作用下，各寡核苷作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个双链，再用两个PCR引物，经引物，经PCR扩
29、增出扩增出DNA片段。若将两个片段。若将两个DNA片段放在一起，片段放在一起，经经SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)扩扩增出完整的基因片段。增出完整的基因片段。第三节第三节 外源基因的导入外源基因的导入一、农杆菌介导的遗传转化一、农杆菌介导的遗传转化二二 、基因枪法、基因枪法 需要具备如下条件：需要具备如下条件：高效的植株再生体系。高效的植株再生体系。选择容易从体细胞再选择容易从体细胞再生植株的受体基因型是获得转化成功的关键。生植株的受体基因型是获得转化成功的关键。受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。一般认
30、为受体细胞应处于高度的分裂状态，一般认为受体细胞应处于高度的分裂状态，T-DNA才能插入植物基因组；才能插入植物基因组；具有有效的选择系统。具有有效的选择系统。必须有一个理想的选必须有一个理想的选择方法将转化细胞从非转化细胞中选择出来；择方法将转化细胞从非转化细胞中选择出来；稳定的转化技术和基因表达。稳定的转化技术和基因表达。外源基因转入外源基因转入植物后应能传代并稳定表达。植物后应能传代并稳定表达。一、农杆菌介导的遗传转化一、农杆菌介导的遗传转化1 1、根癌农杆菌、根癌农杆菌(Ti(Ti质粒质粒)Ti质粒质粒是一种是一种细菌质粒细菌质粒，它自然存在于土壤，它自然存在于土壤农杆菌细胞中。土壤农
31、杆菌可感染大多数双子农杆菌细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤冠瘿瘤(grown gall tumors)。致毒区 Ti 质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与 Ti 质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-DNA 区 右边界 生长素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 Ti 质粒。质粒。Ti质粒的一质粒的一部分部分DNA叫做转移叫做转移DNA（T-DNA），当），当T-DNA整合到整合到宿主植物细胞的宿主植物细胞的染色体后染色体后，就诱导出，就诱导出根根瘤瘤，并使根瘤细胞合成，并使根瘤细胞合成冠瘿碱冠瘿碱(opine),作
32、为土壤作为土壤农杆菌的碳源和氮源农杆菌的碳源和氮源。（1）T-DNA区（区（transferred-DNA regions）T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒质粒上导入植物细胞的一段上导入植物细胞的一段DNA。T-DNA两端各有一段两端各有一段25bp的重复序列的重复序列(LB,RB)。T-DNA携带的致瘤基因是一些与携带的致瘤基因是一些与激素合成有关激素合成有关的基的基因，由于激素合成基因使细胞处于因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态不停的分裂状态，形成形成冠瘿瘤冠瘿瘤，不能进行细胞分化。，不能进行细胞分化。Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。
33、质粒改造后才能应用于植物的基因工程。保留保留T-DNA两端的末端序列，然后用外源两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直插入或直接取代野生型接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。胞不具有成瘤能力。（2）Vir区（区（virolence region）Vir区段上的基因与区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌农杆菌表现出毒性，表现出毒性，故称之为故称之为毒性区毒性区。（3）Con区区(regions encoding conjugations)
34、该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tratra），），调控调控TiTi质粒在农杆菌之间的转移质粒在农杆菌之间的转移。（4）Ori区区(origin of replication)该区段基因调控该区段基因调控TiTi质粒的自我复制质粒的自我复制，故称之为，故称之为复制起复制起始区始区。2、发根农杆菌(Ri质粒)发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根(发状根)Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部分。T区与Ti质粒的T-DNA十分相似，包括T区的左
35、右边界序列;TL-DNA区;TR-DNA区。图12-15 棉花转基因植株生产过程F1.共培养2.在选择培养基上筛选3.筛选获得的抗性愈伤 5.胚萌发成苗6.转基因植株移栽大田4.抗性愈伤分化成胚状体二二 、基因枪法、基因枪法 基因枪法基因枪法 生物弹法生物弹法 微粒枪法微粒枪法 微粒微粒轰击法轰击法 u基因枪法（基因枪法（gene gun）是依赖高速的）是依赖高速的金属微粒将外源基因金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转导入活细胞的一种转化技术。化技术。基因枪介法基因枪介法优点优点：（1 1）无宿主限制。可以对任何无宿主限制。可以对任何基因基因型材料型材料进行转化研究；靶受体几乎包括所有具进行转
36、化研究；靶受体几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞。有潜在分化能力的组织或细胞。（2 2）易于操易于操作。作。缺点：如缺点：如转化频率低转化频率低、嵌合体较多嵌合体较多、结果的、结果的重复性差重复性差，转化的外源基因以多拷贝居多，易，转化的外源基因以多拷贝居多，易导致基因沉默，实验成本较高等。导致基因沉默，实验成本较高等。还有很多将外源基因引入植物基因组的方法，还有很多将外源基因引入植物基因组的方法，如如电激法电激法、花粉管通道法花粉管通道法、超声波法超声波法等，它们等，它们都在不同程度上得到应用。都在不同程度上得到应用。基因枪法基因枪法第第 二节二节 基因的分离基因的分离第三节第三节 外
37、源基因的导入外源基因的导入一、农杆菌介导的遗传转化一、农杆菌介导的遗传转化二二 、基因枪法、基因枪法 第四节第四节 转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定 基于基因库的分离基因方法基于基因库的分离基因方法 T-DNA标签克隆基因标签克隆基因 基于基于PCR的基因克隆的基因克隆 人工合成基因人工合成基因第第4节节 转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定一、分子检测一、分子检测二、二、生物学性状鉴定生物学性状鉴定Fields trials for herbicide resistance of transgenic wheat lines(T3 progeny)in Russia up
38、on treatment with 1%Basta.A.before treatment.B.one week after treatment.PCRSouthern杂交杂交Northern杂交杂交Western杂交杂交常用的转基因生物分子检测手段有常用的转基因生物分子检测手段有一、分子检测一、分子检测PCR检测检测PCR检测外源基因的原理是根据被转移的外源检测外源基因的原理是根据被转移的外源基因（基因（目的基因目的基因或选择标记基因）设计引物，或选择标记基因）设计引物，扩增外源基因的片段。如果扩增出的片段与设扩增外源基因的片段。如果扩增出的片段与设计的一对引物之间的实际片段在长度上相吻合，计
39、的一对引物之间的实际片段在长度上相吻合，说明基因已转入受体细胞。说明基因已转入受体细胞。在进行在进行PCR检测时应设两个对照：检测时应设两个对照：阳性阳性对照即质粒对照即质粒DNA和和阴性阴性对照即非转基因材料的对照即非转基因材料的DNA。PCR扩增结果只能初步确定转基因材料的真实性，扩增结果只能初步确定转基因材料的真实性，并不能完全确信。容易出现假阳性，通常需要进一步并不能完全确信。容易出现假阳性，通常需要进一步用用Southern杂交杂交才能证实。才能证实。转基因棉花选择标记基因转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的编码区段的PCR扩增结果（扩增结果（M为分子量标准，为分子量标准，C为
40、非转基为非转基因植株（因植株（阴性对照阴性对照），），P为质粒对照（为质粒对照（阳性对阳性对照照），），1-20为转基因植株）为转基因植株）Southern杂交杂交(Southern blotting)将将DNA用限制性酶酶切用限制性酶酶切酶切酶切DNA电泳电泳变性变性转移到膜上转移到膜上经过标记的经过标记的DNA探针与探针与膜上的膜上的DNA片段杂交片段杂交洗去膜上非特异性结洗去膜上非特异性结合的探针合的探针检测杂交信号检测杂交信号。如果转移的膜上具有与如果转移的膜上具有与杂交探针杂交探针相同或部相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。分同源的序列，就会检测到杂交带信号。Agarose
41、gel with DNA fragments after electrophoresis Gel with smear DNAMembrane filterCapilary transfer(虹吸转移虹吸转移）Electronic transfer（电转移电转移）Cathode-Anode+Gel with smear DNAFilterSouthern blot:invisible DNA bands now on filter500gSouthern杂交杂交Block with nonspecific DNA,then incubate with labeled probePositive
42、 band“lights up”Photographic detectionDiagram of RFLP：First,DNA fragments were separated in an agarose gel by electrophoresis.Next,denature the DNA with base(e.g.NaOH solution)and transfer the single-stranded DNA fragments from the gel to a sheet of nitrocellulose or nylon membrane.One can do this i
43、n two ways:by diffusion,in which buffer passes through the gel,carrying the DNA with it(left),or by electrophoresis(right).Next,hybridize the blot to a labeled probe and detect the labeled bands by autoradiography.M 1 2 3 4 5 6 7 8 9kb23.1-9.4-6.6-4.4-2.3-2.0-转基因棉花的转基因棉花的Southern杂交检测（杂交检测（M为分为分子量标准，
44、子量标准，1为阳性对照，为阳性对照，2为阴性对照，为阴性对照，3-8为转基因植株）为转基因植株）NorthernNorthern杂交是一种杂交是一种RNA-DNARNA-DNA杂交。杂交。将提取的植物总将提取的植物总RNA或或mRNA用变性凝用变性凝胶电泳分离，则不同的胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子分子将按分子量大小依次排布在凝胶上；量大小依次排布在凝胶上；将它们原位转移到固相膜上；在适宜的离将它们原位转移到固相膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；然后通过探针的标记性质检出杂交体。然后通过探针的标记性质检出杂交体。Northern杂交
45、杂交从转基因植物中提取总蛋白质，经纯化处从转基因植物中提取总蛋白质，经纯化处理后，进行理后，进行SDS(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠)聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子量大小分离，将胺凝胶电泳使蛋白质按分子量大小分离，将凝胶上的凝胶上的蛋白质蛋白质转移到膜上，按特定的程序转移到膜上，按特定的程序与与抗体抗体杂交，对杂交结果进行检测便可得知杂交，对杂交结果进行检测便可得知被检植物组织内目的被检植物组织内目的蛋白表达蛋白表达与否及其表达与否及其表达量。量。Western杂交杂交Flower Leaf Stem Root鉴定转移的鉴定转移的目的基因目的基因、选择标记基因是否表、选择标记基因是否
46、表达。达。观察是否发生外源基因以外的变异观察是否发生外源基因以外的变异。转基因。转基因生物还可能因为细胞培养或生物还可能因为细胞培养或T-DNA的插入而的插入而造成其它性状的突变。最好选出其它性状均未造成其它性状的突变。最好选出其它性状均未改变而仅产生目的基因性状的转基因材料。改变而仅产生目的基因性状的转基因材料。但是，不应忽视转基因过程中产生的其它变异的应但是，不应忽视转基因过程中产生的其它变异的应用价值，如转基因抗虫棉的研究中就可筛选到既用价值，如转基因抗虫棉的研究中就可筛选到既抗抗虫纤维品质的某方面也改善的品系虫纤维品质的某方面也改善的品系。二二 生物学性状鉴定生物学性状鉴定转转基基因因
47、抗抗虫虫棉棉非非转转基基因因对对照照棉棉转基因棉花饲喂棉铃虫时被食用情况（左图为转转基因棉花饲喂棉铃虫时被食用情况（左图为转基因抗虫棉，右图为非转基因棉）基因抗虫棉，右图为非转基因棉）第第 5节节 基因工程的应用基因工程的应用 第五节第五节 基因工程的应用基因工程的应用一、基因工程的应用一、基因工程的应用1 1、转基因植物、转基因植物抗抗除草剂除草剂、抗虫抗虫、抗病抗病、抗逆抗逆的优良品系或品种，的优良品系或品种，很多已经大面积种植推很多已经大面积种植推广。广。20022002年年50005000万公顷：万公顷：大豆、玉米、棉花、大豆、玉米、棉花、水稻、马铃薯、番茄、水稻、马铃薯、番茄、小麦等
48、小麦等2 2、转基因动物：羊、牛、转基因动物：羊、牛转基因动物比转基因植物的发展要转基因动物比转基因植物的发展要缓慢些缓慢些，这不仅涉及到技术问题，也涉及到这不仅涉及到技术问题，也涉及到伦理和宗教伦理和宗教问题。问题。转基因动物通常是将目的基因构建到载体上，转基因动物通常是将目的基因构建到载体上，然后用微量注射法将重组然后用微量注射法将重组DNA导入导入受体合子细受体合子细胞核胞核中，借助母体环境实现转基因动物生产。中，借助母体环境实现转基因动物生产。转基因动物遇到的技术难题是动物转基因动物遇到的技术难题是动物体细胞再体细胞再生生并不像植物那么容易，而且动物的繁殖数量并不像植物那么容易，而且动
49、物的繁殖数量十分有限。克隆动物的成功（十分有限。克隆动物的成功（1997年克隆羊年克隆羊多多利利）和转基因鱼在生产上的应用是动物基因工）和转基因鱼在生产上的应用是动物基因工程的典范示例。程的典范示例。2 2、转基因动物、转基因动物例如：例如：已把人的已把人的抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶-1基因基因转移到羊：转移到羊：克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因启动子仅在乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊体注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊体内，产下的转基因羊发育正常。交配后产生的内，产下的
50、转基因羊发育正常。交配后产生的羊奶中含有大量有功能的羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶人类抗胰蛋白酶(每每升升35克克)，这一结果说明可利用家禽作为，这一结果说明可利用家禽作为生物生物反应器反应器，生产人类大量需要的重要蛋白质。，生产人类大量需要的重要蛋白质。人类生长激素人类生长激素基因转移到老鼠和猪基因转移到老鼠和猪在动物体内在动物体内胰岛素胰岛素是是胰腺细胞先形成一种前胰腺细胞先形成一种前体胰岛素，再加工成两体胰岛素，再加工成两条不同的成熟胰岛素原条不同的成熟胰岛素原分子，分子，A链链含含21个氨基酸个氨基酸残基，残基，B链链含含30个氨基酸个氨基酸残基，经两对残基，经两对二硫键二硫键连
