1、授课人：XX XX XX学院 XX 专业【全套课件全套课件】第一章第一章 总论总论n一、发酵工程的概念一、发酵工程的概念n发酵的定义：利用生物细胞（含动物、植物和微生物细胞），在合适的条件下，经特定的代谢途径转变为所需产物或菌体的过程。n发酵工程：是发酵原理与工程学的结合，是研究由生物细胞参与的工艺过程的原理和科学，是研究利用生物材料生产有用物质，服务于人类的一门综合性科学技术。发发 酵酵 工工 程程 利用微生物进行产品生产利用微生物进行产品生产抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料
2、等生物农药、生物肥料等医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业基因工程药物、疫苗及抗体产品基因工程药物、疫苗及抗体产品基因工程菌发酵基因工程菌发酵n一、发酵工程的概念一、发酵工程的概念n一般的，发酵工程又可称为微生物工程，但严格来说，发酵（微生物培养）只是发酵工程的一部分，而不是全部，但是其核心内容。n通常，发酵工程分为两大部分：发酵部分：主要是通过一系列的环节，提供条件，使菌体生长繁殖，并产生发酵所要的目的产物（代谢产物）。提纯部分：这部分是通过一些物理的、化学的手段、方法，将代谢产物从发酵醪中提纯出来，获得最终产品。n一、发酵工程的概念一、发酵工程的
3、概念n现代发酵工程是以天然生物体和人工修饰的生物体为加工对象，集现代化高新技术为一体，生产产品或服务于人类社会的一种工程技术。n现代发酵工程加工的对象生物，除天然生物菌种和变异微生物菌株外，还有基因工程菌、细胞融合菌以及动植物细胞株。n发酵工程的无菌概念已由原来的将杂菌排除再发酵系统外的单向概念转变为同时要求发酵系统内的生物体不能逸出系统外的双向概念。n发酵的培养技术已不是简单的通气搅拌培养技术，而是要根据生物的类型、目的产物的特征不同而采用更复杂的培养技术，并引入了生化工程放大概念。n二、发酵过程的特点和分类二、发酵过程的特点和分类n获得发酵产品的条件：适宜的微生物、保证或控制微生物进行代谢
4、的各种条件、进行微生物发酵的设备、精制成产品的方法的设备。n发酵过程的特点：n1）发酵过程一般都在常温常压下进行的生化反应，反应条件比较温和。n2）可采用廉价原材料，甚至可以利用废物为发酵原材料生产高附加值的产品。n3）发酵过程是通过生物体的自适应调节来完成的，反应的专一性强，因而，可以得到单一的代谢产物。n4）发酵工业相对投资较少，见效较快，具有经济和效能的统一性。n二、发酵过程的特点和分类二、发酵过程的特点和分类n发酵过程分类：n根据发酵对氧的需要：厌氧和有氧发酵n根据发酵原料:糖质原料和烃类原料发酵n根据发酵状态：液体和固体发酵n根据发酵工艺类型：分批发酵和连续发酵n根据产物类型：食品发
5、酵、有机酸发酵、氨基酸发酵、维生素发酵、抗生素发酵等n三、发酵工业生产流程三、发酵工业生产流程n发酵工业生产过程主要包括：n原料预处理n培养基配制n无菌空气的制备n微生物菌种制备和扩大培养n发酵n发酵产品的分离和纯化发酵的流程空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵碳源、氮源、无机盐等营养物质灭菌产物分离纯化成品n三、发酵工业生产流程三、发酵工业生产流程n发酵原料的预处理发酵原料的预处理原料不同处理方法也有所差异。1.淀粉利用前需变成糊精或葡萄糖。方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法2.糖蜜加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐。3.碳氢化合物：石油脱蜡一定馏分的石油经冷却
6、脱蜡而获得的凝固点在-10的油，加入适量无机盐进行接种发酵。n三、发酵工业生产流程三、发酵工业生产流程n发酵培养基的配制与灭菌发酵培养基的配制与灭菌n（1）目的要明确；n（2）培养基的营养要协调；n（3）pH要适宜。n灭菌:主要采用高压水蒸汽直接对培养基进行加热灭菌，多采用121保温20-30min，然后冷却，这样称之为实罐灭菌；也可采用连续灭菌。n三、发酵工业生产流程三、发酵工业生产流程n无菌空气制备无菌空气制备n一般采用无菌空气作为氧气来源，高空采风，经空气压缩机加压后采用加热灭菌或过滤除菌。n微生物种子的制备微生物种子的制备n一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使
7、用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。n扩大培养的方法可以根据需要采用固体培养或液体培养两级不同方式。菌种筛选菌种筛选摇瓶试验摇瓶试验发酵罐试验发酵罐试验n三、发酵工业生产流程三、发酵工业生产流程n发酵过程的操作方式发酵过程的操作方式n三种模式：间歇发酵、连续发酵和流加发酵n间歇发酵又称分批发酵，在发酵过程中，除气体进出外，与外界没有其它的物料交换。分批发酵是一种操作简单并且广泛使用的发酵方式。n连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的体积维持恒定，使微生物细胞处于近似恒定状态下生长的微生物发酵方式。n流加发
8、酵是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式。n发酵产品及分离提纯工艺发酵产品及分离提纯工艺n固液分离技术、细胞破碎技术、浓缩分离技术、精制技术、结晶技术等四、发酵工程的发展历史四、发酵工程的发展历史发酵现象酿造食品工业非食品工业青霉素抗菌素发酵工业氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）基因工程菌动物细胞大规模培养植物细胞大规模培养藻类细胞大规模培养转基因动物1、发酵现象的早期认识1680年制成显微镜 微生物的存在1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精 酶四、发酵工程的发展历史四、发酵工程的发展历史2、发酵工程的早期阶段 人们的对发酵技术的认识起
9、始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。20世纪初期，1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油（第一次世界大战）由食品工业向非食品工业发展。3、发酵工程的重大转折点 二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发，青霉素的发现，迅速形成工业大规摸生产。抗生素工业的发展，建立了一套完整的好氧发酵技术，推动了整个发酵工业的深入发展，现代发酵工程奠定了基础。四、发酵工程的发展历史四、发酵工程的发展历史3、发酵工程的重大转折点 20世纪70年代，细胞融合技术、基因技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物：
10、增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数，可以大幅度地提高目标产物的产量。将动、植物或某些微生物特有产物的控制基因植入细胞中，快速经济地大量生产这些产物。将具有不同性能的多种质粒植入，使新菌株在清除污染或以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护。四、发酵工程的发展历史四、发酵工程的发展历史4、发酵工程产业化发展 目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年约78的速率增长。我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力，涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题。五、生物工程与发
11、酵工程的关系五、生物工程与发酵工程的关系 发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，是生物技术四大支柱的核心。发酵工程是生物技术产品走向工业化的必由之路。生物工程生物工程基因工程基因工程细胞工程细胞工程酶工程酶工程产品产品发酵工程发酵工程产物产物产品产品第二章第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术发酵工业微生物菌种制备原理和技术n第一节第一节 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育n第二节第二节 工业微生物种子的扩大培养工业微生物种子的扩大培养n第三节第三节 种子培养基及其制备种子培养基及其制备一、工业微生物的特点一、工业微生物的特点 工业微生物是指在发酵工业上已经应用的或具有潜在
12、应用价值的微生物，其范围随科学技术的发展而不断扩展。工业微生物的特点：个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能力强、易变异改造。第一节第一节 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育二、发酵工业常用微生物菌种及要求二、发酵工业常用微生物菌种及要求（一）发酵工业对菌种的要求1、能在廉价原料制备的培养基上迅速生长并生成所需的代谢产物，且产量高；2、培养条件易于控制；3、生长迅速，发酵周期短；4、满足代谢控制的要求；5、抗噬菌体和杂菌能力强；二、发酵工业常用微生物菌种及要求二、发酵工业常用微生物菌种及要求（一）发酵工业对菌种的要求6、遗传性状稳定，菌种不易变异退化；7、在发酵过程中产生的泡沫要
13、少；8、对需要添加的前体物质有耐受能力；并且不能将这些前体物质作为一般碳源使用；9、不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质（包括抗生素、激素和病毒）以保证安全。（二）工业生产常用的微生物菌种（二）工业生产常用的微生物菌种1、细菌（、细菌（Bacteria）细菌是单细胞原核生物，具有环状细菌是单细胞原核生物，具有环状DNADNA染染色体，以典型的二分分裂方式繁殖。色体，以典型的二分分裂方式繁殖。(1)球细菌球细菌根据形态可分为三类：根据形态可分为三类：(2)杆细菌杆细菌(3)螺旋细菌螺旋细菌 工业上常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、乳工业上常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸
14、杆菌、乳酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状单细胞原核生物。接近于细菌的一类丝状单细胞原核生物。因因菌落呈放射状菌落呈放射状而得名而得名2、放线菌（、放线菌（Actinomycetes）抗生素有抗生素有60以上是放线菌产生的以上是放线菌产生的工业生产常用的放线菌主要来自以下工业生产常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属、诺卡菌属几个属：链霉菌属、小单孢菌属、诺卡菌属3、酵母菌（、酵母菌（Yeast）酵母菌是单细胞真核生物，酵母菌是单细胞真核生物，常常以出芽方式进行无性繁殖。
15、以出芽方式进行无性繁殖。c、不形成孢子只通过芽殖的、不形成孢子只通过芽殖的“假酵母假酵母”属半知菌。属半知菌。a、形成子囊孢子的株系属于子囊菌门形成子囊孢子的株系属于子囊菌门根据产生孢子的能力，可将酵母分成三类：根据产生孢子的能力，可将酵母分成三类：b、形成担孢子的株系属于担子菌门形成担孢子的株系属于担子菌门(黑粉菌黑粉菌目目)工业上常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等工业上常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等4、霉菌（、霉菌（mould）霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养基质霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。上形成绒毛状，网状或絮状
16、菌丝的真菌统称霉菌。工业上常用的霉菌有：工业上常用的霉菌有：藻状菌纲：根霉，毛霉，犁头霉藻状菌纲：根霉，毛霉，犁头霉子囊菌纲：红曲霉子囊菌纲：红曲霉半知菌类：曲霉，青霉。半知菌类：曲霉，青霉。5、担子菌（、担子菌（Basidiomycetes）担子菌是会产生担子菌是会产生担子和担孢子担子和担孢子的真菌。的真菌。担子菌主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。担子菌主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。6 6、藻类（、藻类（AlgaAlga）n许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将通过藻类将COCO2 2转变为石油；国外还有从转变为石油；国
17、外还有从“藻类农藻类农场场”获得氢能的报道。获得氢能的报道。6、藻类（、藻类（Alga）螺旋藻螺旋藻栅列藻栅列藻单孢藻单孢藻三、发酵工业微生物菌种的分离和选育三、发酵工业微生物菌种的分离和选育（一）微生物菌种的分离（一）微生物菌种的分离1 1、施加选择压力分离法、施加选择压力分离法 施加选择压力分离法是利用不同种类的微生物的生长繁殖对环境和营养（如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等）的要求不同，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其它种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。n使用高糖或高盐培养基进行培养，可获得耐高渗透压的微生物n控制培养基的
18、各种营养成分（如使某种碳源、氮源成为唯一的碳源、氮源），可使能利用此种营养的微生物富集，从而大量获得n控制不同的pH条件，可分离出嗜酸和嗜碱微生物n在高温下培养，将嗜热微生物和非嗜热微生物分开n控制培养时的氧气，将好氧微生物和厌氧微生物分开n在分离培养基中加入不同的抗生素或试剂来增加选择性具体培养方法有两种方式：具体培养方法有两种方式：1 1、分批式富集培养（摇瓶培养）分批式富集培养（摇瓶培养）2 2、恒化式富集培养（连续培养）恒化式富集培养（连续培养）p重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可将优势微生物分离出来。p移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。p用于连续发酵生产的菌种选
19、育特别适合。p改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。2 2、随机分离方法、随机分离方法（1 1）抗生素产生菌的分离）抗生素产生菌的分离 抑菌圈法:工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。如春雷霉素和青霉素等。除使用高灵敏度的工具菌外，可以利用专一性很强的酶，酶抑制剂，激活剂，抗体等建立高灵敏度，专一的筛选技术。（2 2）抗肿瘤药物产生菌的分离）抗肿瘤药物产生菌的分离 临床上抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质，由于微生物和人的核酸结构与生物合成方式有许多共同之处，所以
20、大部分抗肿瘤药物也具有抗菌活性，据此发展出利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。生化诱导分析法（生化诱导分析法（BIA）SOS显色法显色法原理一：生物体中都存在两个以上的DNA修复基因，如果一个DNA修复基因损伤或变异，通常仍能存活，但对能引起DNA损伤的化合物十分敏感，易发生死亡，所以可以利用DNA修复能力突变株筛选抗肿瘤药物。实践中常使用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的重组缺失DNA修复基因突变株和亲株作为测试菌来筛选抗肿瘤药物。原理二：（3 3）酶抑制剂产生菌的分离）酶抑制剂产生菌的分离 酶抑制剂的生产主要是为了治疗某些疾病，如为治疗糖尿病需要糖苷酶抑制剂（阻止淀粉等分解为可被吸收的单糖
21、），为治疗肥胖需要脂肪酶抑制剂（阻止对摄入的脂肪物质的消化吸收）等等。酶抑制剂产生菌的筛选，主要以所需抑制的酶为靶酶进行筛选。如果某种化合物能在体外抑制某种关键的人体酶，它就可能在体内有药理作用，所以可以在体外进行筛选。例：例：糖苷酶抑制剂产生菌分离糖苷酶抑制剂产生菌分离 糖苷酶包括淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶 将待筛菌的菌丝提取物加入含-淀粉酶和1淀粉的溶液中，在适合淀粉酶水解淀粉的条件下经过一段时间，然后通过于540nm处比色测定OD值，确定淀粉的酶活力，如果酶活力被明显抑制则证明此菌可产生-淀粉酶抑制剂。例：脲酶抑制剂产生菌的分离例：脲酶抑制剂产生菌的分离（阻止土壤中尿素分解损失）将不同地点
22、分离的水稻土和厩肥中的待筛微生物的单菌落菌株接种在含2尿素和0.1酚红的琼脂培养基上形成单菌落（每一皿可以多接些菌株，如10株），培养一段时间后在培养基表面倒一层一定浓度的脲酶溶液，由于脲酶分解尿素产生碱性物质会使含酚红的培养基由黄色变为红色，如果某个菌落周围的培养基不变红，则证明此菌会产生脲酶抑制剂。（4 4）抗病毒药物产生菌的分离）抗病毒药物产生菌的分离b、用小平板测定由病毒引起的细胞变性效应（CPE：Cytopathic effect），更多称细胞病变效应。c、检测病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂。a、利用作用于核酸的方法，如噬菌斑法。如：壳二孢氯素、衣霉素的分离（5
23、5）生长因子生长因子产生菌的分离产生菌的分离 通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检出生长因子产生菌。例如氨基酸产生菌的筛选：首先将待试菌接入加了抗真菌化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3d后，用紫外线杀死长好的菌落，再往此平板上面铺一层含有相应氨基酸营养缺陷的营养缺陷型菌株悬液，培养16h后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。这样在另一个复印的平板相应的位置上便可以找出产生菌。（6 6）免疫激活剂产生菌的分离）免疫激活剂产生菌的分离 现已经发现抑制细胞表面的氨基肽酶B，氨基肽酶A，碱性磷
24、酸脂酶会增强细胞性免疫或抗体产生能力，所以可以利用细胞表面酶的抑制法来筛选免疫激活剂产生菌。（7 7）多糖产生菌的分离）多糖产生菌的分离 一般认为制糖工业，食品加工厂等产生的污水中，可能含有较多的多糖产生菌，并且这类菌的菌落外观一般比较粘稠，可以通过菌落外观的观察来识别。（二）微生物菌种的选育（二）微生物菌种的选育1 1、自然选育、自然选育 不经过人工处理，利用微生物自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。自然选育简单易行，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目
25、的。2 2、诱变选育、诱变选育 诱变育种是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。（1 1）诱变育种的原理）诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是突变，主要包括染色体畸变和基因突变两大类。染色体畸变指的是染色体或DNA片段发生缺失，易位，逆位，重复等。基因突变指的是DNA中的碱基发生变化即点突变。（2 2）诱变育种的基本方法）诱变育种的基本方法 诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分，是诱变和筛选过程的不断重复，直到获得高产菌株。A A、诱变、诱变 诱变的关键包括出发菌株的选择，诱变剂种类和剂量的选择以及合理的
26、使用。a、出发菌株的选择 出发菌株要有一定的目标产物的生产能力。其它生产性能如生长繁殖快，营养要求低，产孢子多而早，对诱变剂敏感，变异幅度大等。可以选择已经诱变处理的菌株，因为其对诱变剂的敏感性会有所提高。b、诱变剂种类的选择单一诱变剂处理复合诱变剂处理c、诱变剂剂量的选择 诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与突变率有一定的关系，因此可用致死率作为诱变剂剂量选择的依据。一般突变率随诱变剂剂量的增加而提高，但达到一定的程度以后，再提高剂量反使突变率下降。B B、筛选、筛选 诱变处理后，正向突变的菌株通常为少数，要用各种方法筛选出来a a、营养缺陷型突变株的筛选、营养缺陷型突变株的筛选 某些菌株
27、发生突变（自然突变或人工诱变）后，失去合成某种（或某些）对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子如氨基酸，维生素）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。（a）营养缺陷型定义（b）营养缺陷型的意义 在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克服生长障碍，就能使中间产物积累。营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，在杂交育种中作为出发菌株，有利于杂交重组的分析。营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，可以作为基因工程中的受体菌，检出克隆基因
28、的表达。（c）营养缺陷型的筛选首先：淘汰野生型，浓缩缺陷型首先：淘汰野生型，浓缩缺陷型 经诱变处理后，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来得以浓缩。(1)抗生素法 适用于进行丝状生长的
29、真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。(2)菌丝过滤法然后：检出缺陷型然后：检出缺陷型 先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多数都是营养缺陷型突变株。(1)夹层培养法 把诱变处理后的细胞接种在含有微量（0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则缓慢生长成小菌落。若需获得某
30、一特定营养缺陷型，可再在基本培养基中加入微量的相应物质。(2)限量补充营养法(3)影印平板法 可以将诱变后的菌液稀释后接种在完全培养基上，使之形成单株菌落，然后将菌落分别影印到基本培养基和完全培养基上继续培养，那些在基本培养基上不能生长的菌落就是营养缺陷型菌株的菌落，到完全培养基的相应位置就可以得到营养缺陷型菌株。完全培养基上完全培养基上长成单孢菌落长成单孢菌落无菌丝绒布无菌丝绒布橡皮箍橡皮箍圆木柱圆木柱轻压在绒布上轻压在绒布上接上所有菌落的绒布接上所有菌落的绒布转印在新鲜转印在新鲜的培养基上的培养基上基本培养基基本培养基完全培养基完全培养基所有菌都长所有菌都长营养缺陷型不长营养缺陷型不长(3
31、)影印平板法 b b、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选 末端产物的反馈调节在生物合成途径中普遍存在。抗反馈阻遏和抗反馈抑制两种突变均是由于代谢失调，它们有共同的表型，即在细胞中已经有了大量的末端产物时仍不断合成这一产物。（a）因为调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因。因此不再起反馈阻遏作用。（b）由于编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有催化活性，从而解除反馈抑制。代谢失调的原因：筛选方法筛选方法1 1：通常抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株是通过抗结构类似物突变的方
32、法筛选出来的。结构类似物与末端产物具有相似的结构，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用，但它们不能代替末端产物参与生物合成，它们的浓度不会降低，因此，它们与阻遏蛋白或变构酶的结合是不可逆的。未突变的细胞因代谢受阻，不能合成某种产物而死亡。抗反馈调节的突变株则即使在结构类似物存在的条件下仍可以合成末端产物形成菌落。筛选方法筛选方法2 2：可以从营养缺陷型的回复突变株获得抗反馈突变株。营养缺陷型突变株是因为对反馈调节作用敏感的酶钝化或缺失等原因所致，发生回复突变后，虽然酶的催化活性恢复了，但酶的结构发生了改变，对反馈调节作用不敏感，因此可过量积累末端代谢产物。c c、组成型突
33、变株的筛选、组成型突变株的筛选 微生物的产酶过程通常都受到底物诱导、终产物或分解代谢物的阻遏等机制的调节，为了解除对诱导物的依赖，摆脱阻遏调节，须筛选组成型突变株。突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。加诱导酶合成抑制物交替培养法显色反应法例1：加诱导酶合成抑制物 以-半乳糖苷酶生产为例，将诱变处理后的菌种培养在含有抑制物邻硝基-D-岩藻糖苷和乳糖的培养液中。在这种培养液中，-半乳糖苷酶的合成被抑制，因此诱导型菌株不能利用乳糖，则不能生长，而组成型菌株能够合成-半乳糖苷酶，利用乳糖生长，使组成型被富集。例2：交替
34、培养法 将诱导型菌株经诱变处理后，先在含诱导剂如乳糖的培养液中培养，由于组成型的菌株不需诱导物就能合成-半乳糖苷酶，利用乳糖，因此它会先于诱导型开始生长，在一段时间内，它们的菌数会增加很快。当诱导型在诱导物的诱导下合成-半乳糖苷酶，开始利用乳糖生长时，就将细菌全部转入葡萄糖培养基中，在葡萄糖培养基中两类菌同样生长繁殖，但是组成型菌株仍能合成-半乳糖苷酶，而诱导型菌株的-半乳糖苷酶合成停止，并且酶活力逐渐丧失。这时再将全部细菌转入乳糖培养基，组成型菌株又获得一次优势生长。如此反复多次后，组成型菌株数量大大超过诱导型菌株，然后用平板培养基分离出组成型菌株的单菌落。例3：显色反应法 利用显色反应在平
35、板上识别组成型菌株。在不含诱导物的平板上进行培养，由于组成型菌株能产生酶，培养后加入适当的所产生的酶的底物反应。常采用经酶解后有颜色变化的底物，以便快速检出组成型菌落。如：用邻硝基苯半乳糖苷来筛选-半乳糖苷酶组成突变型。(邻硝基苯半乳糖苷被分解后生成黄色的硝基苯酚)如：用刚果红来筛选纤维素酶组成突变型。（刚果红可使纤维素酶水解纤维素露出的还原基被染上色）n包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体抗生素抗性突变：提高产量 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染条件抗性突变：如温度，可提高产量物敏突变：提高产量 d d、抗性突变株的筛选、抗性突变株的筛选抗性突变菌株的筛选抗性突变菌株的筛选 抗生素抗性突变株抗生
36、素抗性突变株 在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。性突变可提高抗生素产量。抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。还能提高其它代谢产物的量。条件抗性突变株条件抗性突变株 因环境不同，能表现为因环境不同，能表现为 野生型野生型 菌株的特性和突变型菌菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。温度敏感突变常用于温度敏感突变常用于提高代谢产物产量提高代谢产物产量 致死致死营养缺陷营养缺陷抗性突变菌株的
37、筛选方法抗性突变菌株的筛选方法 一次性筛选法一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。一次性筛选出少量抗性变异株。噬菌体抗性菌株噬菌体抗性菌株 耐高温菌株耐高温菌株 阶梯性筛选法阶梯性筛选法 梯度平板法梯度平板法 纸片扩散法纸片扩散法 用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般的平板上，一般9 9厘米的培养皿中等距
38、放置三片为宜。经培养厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。3 3、杂交育种、杂交育种（1 1）杂交育种的优点）杂交育种的优点a、通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两株的优良性状集中在重组体内，获得新品种。b、通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的疲劳效应。c、通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展
39、。（2 2）杂交育种的方法）杂交育种的方法微生物常规杂交形式微生物常规杂交形式微生物类别杂交方式供体与受体细胞关系参与交换的遗传物质原核微生物接合体细胞间暂时沟通部分染色体杂合转化细胞不接触，吸收游离DNA片段个别或少数基因杂合转导细胞间不接触，噬菌体介导（纠错）个别或少数基因杂合真核微生物有性生殖生殖细胞融合或接合整套染色体高频率重组准性生殖体细胞接合整套染色体高频率重组4 4、原生质体融合、原生质体融合（1）原生质体融合法的定义 原生质体融合法是首先用酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁，在高渗的环境下释放出原生质，将它们混合，在助融剂或电场的作用下，使它们互相凝集，发生细胞融合，实现遗传重组。
40、（2）原生质体融合法的优越性a、受接合型和致育型的限制小，两亲株没有供体和受体之分，有利于不同种属微生物的杂交。b、重组频率高于其他杂交方法。c、遗传物质的传递更加充分、完善，既有核配又有质配。d、可以用温度、药物、紫外线等处理纯化亲株的一方或双方，然后使其融合，筛选再生重组子菌落，提高筛选效率。e、用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。（3）原生质体融合法的步骤a a、原生质体制备、原生质体制备b b、原生质体融合、原生质体融合c c、原生质体再生、原生质体再生d d、融合子的检出、融合子的检出5 5、基因工程育种、基因工程育种 基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质
41、DNA分子提取出来，在离体的条件下进行“切割”，获得代表某一性状的目的基因，把该基因与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的目的基因在受体细胞中进行复制和表达，从而获得目的产物。由于该受体细胞即包含了原有的一整套遗传信息，同时也含有外来基因的遗传信息，是一个自然演化中根本不存在的全新物种。携带人血清白蛋白基因的转基因试携带人血清白蛋白基因的转基因试管牛管牛“滔滔滔滔”（1 1）基因的分离）基因的分离去垢剂（如SDS）溶解细胞；用酚和蛋白酶除去蛋白质；核糖核酸酶除去RNA；乙醇沉淀。a a、总、总DNADNA提取提取：b b、分离特定的目的基因、分离特定的目的基因：物理分
42、离法；互补DNA分离法；“鸟枪法”（2 2）DNADNA分子的切割与连接分子的切割与连接（a）粘性末端连接：用同一种限制性内切酶或者用能够产生相同粘性末端的两种限制性内切酶分别消化外源DNA分子和载体，所形成的DNA末端彼此互补，用DNA连接酶共价连接起来，形成重组体DNA分子。（b）平头末端连接：将平末端的DNA分子在T4DNA连接酶催化下，使DNA分子的3OH和5P进行共价结合。（c）人工接头法：指利用人工接头加在平端DNA片段的两端，然后用相应限制酶切割人工接头以产生黏性末端，再与带相同黏性末端的载体相连。（d）同源多聚尾连接法：在末端脱氧核苷酸转移酶催化下，在线型载体分子的两端加上单一
43、核苷酸如dG组成的多聚尾；而在目的DNA分子的两端加上dC尾，两者混合退火，然后经DNA聚合酶或Klenow填补裂口处缺失的核苷酸，再通过DNA连接酶修复成环状的双链DNA。（3 3）载体）载体a a、常用的载体、常用的载体质粒质粒噬菌体噬菌体黏粒黏粒单链噬菌体单链噬菌体M13M13b b、载体应具备的特点、载体应具备的特点（a）载体本身是一个单独的复制子，在共价连接了外源DNA后仍能自我复制。（b）对某些限制酶只有一个切口，并在酶作用后不影响其自主繁殖能力。（c）从细菌核酸中分离和纯化很容易。（d）在宿主中能以多拷贝的形式存在，有利于插入的外源基因的表达，能在宿主中稳定地遗传。（4 4）引入
44、宿主）引入宿主（5 5）重组体的选择和鉴定）重组体的选择和鉴定:分两步分两步a、先根据载体的遗传标记等选择出含有重组分子的细胞。b、进一步根据外源DNA的遗传特性进行鉴定。（6 6）外源基因的表达）外源基因的表达影响外源基因表达的因素四、发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏四、发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏（一）微生物菌种的退化及原因（一）微生物菌种的退化及原因1 1、菌种退化、菌种退化 菌种退化通常指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。2 2、引起菌种退化的原因、引起菌种退化的原因（1 1）基因突变）基因突变（2 2）变异菌株性状分离（广义的退
45、化）变异菌株性状分离（广义的退化）（3 3）连续传代）连续传代（4 4）其它因素）其它因素（二）防止菌种的退化和退化菌种的复壮（二）防止菌种的退化和退化菌种的复壮1 1、防止菌种退化的方法、防止菌种退化的方法（1 1）控制传代次数）控制传代次数（2 2）选择合适的培养条件）选择合适的培养条件（3 3）利用不同类型的细胞进行传代）利用不同类型的细胞进行传代（4 4）选择合适的保藏方法）选择合适的保藏方法2 2、退化菌种的复壮、退化菌种的复壮复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性称为复壮。常用方法：对已退化菌株用一定培养条件进行单细胞分离纯化，淘汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。（三）菌种的保藏（
46、三）菌种的保藏1 1、菌种保藏的意义、菌种保藏的意义2 2、菌种保藏的原理、菌种保藏的原理3 3、菌种保藏的方法、菌种保藏的方法（1 1）斜面低温保藏法）斜面低温保藏法（2 2）石蜡油封保藏法）石蜡油封保藏法（3 3）砂土管保藏法砂土管保藏法（4 4）冷冻干燥法冷冻干燥法（5 5）超低温保藏法）超低温保藏法第二节第二节 工业微生物种子的扩大培工业微生物种子的扩大培养养 种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管等中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜干燥管等中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶或静置培养及种子罐逐级面活化后，再经过摇瓶或静置
47、培养及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。些纯种培养物称为种子。发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：1、菌体培养物总量适宜，以保证在发酵罐中有适当的接种量。2、菌种的生命力旺盛，移接到发酵罐中后能迅速生长，延滞期短。3、菌种能保持稳定的生产性能，生理状态稳定。4、无杂菌和噬菌体污染。一、菌种扩大培养的任务一、菌种扩大培养的任务 菌种扩大培养的任务就是要为每只发酵罐的投料提供相当数量代谢旺盛的种子。二、种子制备的过程二、种子制备的过程1 1、种子扩大培养的工艺流程、
48、种子扩大培养的工艺流程2 2、实验室种子培养、实验室种子培养 实验室种子培养阶段目的是为种子罐提供种子，包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。（1 1）固体斜面菌种培养）固体斜面菌种培养（2 2）固体培养基扩大培养）固体培养基扩大培养（3 3）摇瓶液体培养）摇瓶液体培养3 3、生产车间种子制备、生产车间种子制备（1 1）种子罐培养基）种子罐培养基（2 2）种子罐接种）种子罐接种 微孔接种法：利用注射器在罐的接种口橡皮膜上注入罐内进行接种。（3 3）种子罐级数）种子罐级数 种子罐级数是指制备种子需要逐级扩大培养的次数。二级发酵；三级发酵二级发酵；三级发酵细菌：细菌：生长快，种子用量比例
49、少，级数也较少，二级发酵二级发酵。茄子瓶茄子瓶种子罐种子罐发酵罐发酵罐 霉菌：霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵。三级发酵。孢子悬浮液孢子悬浮液一级种子罐一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐二级种子罐（27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐发酵罐 放线菌：放线菌：生长更慢，采用四级发酵。四级发酵。酵母：酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一一级种子级种子 。确定种子罐级数需注意的问题确定种子罐级数需注意的问题q 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；q 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。q 在发酵产品的放大中，反应级数的确定
50、是非常重要的一个方面。q 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；（4 4）菌种的种龄）菌种的种龄 菌种的种龄是指种子罐中的培养物移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。（5 5）种子罐和发酵罐的接种量）种子罐和发酵罐的接种量双种法：用两只种子罐接种一只发酵罐的接种方法。倒种法：从一只发酵罐中倒出适宜的，适量的发酵液给另一发酵罐做种子的方法。（5 5）接种量）接种量n接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。n通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%、有时202
