1、 第十章第十章 外源基因表达与基因工程药物外源基因表达与基因工程药物 第一节第一节 概概 述述 生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的成就是用于新生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的成就是用于新型生物药物的研制。之前，许多在疾病诊断、治疗和预防中有重要价值型生物药物的研制。之前，许多在疾病诊断、治疗和预防中有重要价值的内源性生理活性物质（激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类的内源性生理活性物质（激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子等）以及某些疫苗，由于、凝血因子等）以及某些疫苗，由于材料来源困难材料来源困难；提取技术提取技术问题问题；或；或因为因为造价太高造
2、价太高使患者望而却步；或使患者望而却步；或由于由于免疫抗原免疫抗原等缘故使传统等缘故使传统生物药物的使用受到限制生物药物的使用受到限制 而应用基因工程技术就可以从根本上解决上述问题，它的应用使人们而应用基因工程技术就可以从根本上解决上述问题，它的应用使人们在解决癌症、心血管疾病和内分泌疾病等方面取得明显效果，它为上述在解决癌症、心血管疾病和内分泌疾病等方面取得明显效果，它为上述疾病的预防、治疗和诊断提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂疾病的预防、治疗和诊断提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂 基因工程技术在医药行业中为预防、诊断、治疗癌症、病毒性疾病、基因工程技术在医药行业中为预防、诊断、
3、治疗癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等疑难病方面提供了新型疫苗、新型药物和新型心血管疾病和内分泌疾病等疑难病方面提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂；利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽诊断试剂；利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽免疫性蛋白：免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体如各种抗原和单克隆抗体细胞因子：细胞因子：如干扰素、白介素、生长因子如干扰素、白介素、生长因子激素：激素：如胰岛素、生长激素如胰岛素、生长激素酶类：酶类：如尿激酶、链激酶、超氧化物歧化酶如尿激酶、链激酶、超氧化物歧化酶 一、基因工程药物的类型一、基因工程药物的类型二、利用基因工程技术生产药物
4、的优点二、利用基因工程技术生产药物的优点 1.1.可大量生产（过去难以获得的）生理活性蛋白和多肽，以保可大量生产（过去难以获得的）生理活性蛋白和多肽，以保障临床供应障临床供应2.2.可提供足量的生理活性物质，以便进行深入研究，从而扩大可提供足量的生理活性物质，以便进行深入研究，从而扩大这些物质的应用范围这些物质的应用范围3.3.可以发现、挖掘出更多的内源性生理活性物质可以发现、挖掘出更多的内源性生理活性物质4.4.可通过基因工程和蛋白质工程技术对内源生理活性物质的不可通过基因工程和蛋白质工程技术对内源生理活性物质的不足之处进行改造和去除足之处进行改造和去除5.5.可获得新型化合物，扩大药物筛选
5、来源可获得新型化合物，扩大药物筛选来源 我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差，我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差，重点放在运用现代生物技术手段开发化学合成法难以生产重点放在运用现代生物技术手段开发化学合成法难以生产的医药产品，如的医药产品，如19971997年，我国自行研制开发的具有国际先年，我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技产品进水平的生物高科技产品1b1b性干扰素性干扰素三、国内基因工程制药现状三、国内基因工程制药现状第二节第二节 基因工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程 就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的就是将重组对象的目的基因插入
6、载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术 通过基因工程技术，可以大规模生产很多从自然界很难通过基因工程技术，可以大规模生产很多从自然界很难或不能获得的蛋白质或多肽类物质。如以或不能获得的蛋白质或多肽类物质。如以E.ColiE.Coli为宿主，表为宿主，表达病毒抗原基因，获得病毒抗原，再通过一定手段除去抗原达病毒抗原基因，获得病毒抗原，再通过一定手段除去抗原的反应性，而保留抗原原性，就得到了病毒疫苗的反应性，而保留抗原原性，就得到了病毒疫
7、苗 一、基因工程技术的概念一、基因工程技术的概念二、基因工程药物生产的主要程序二、基因工程药物生产的主要程序目的基因的分离与克隆（目的基因来源于人体或病原体）目的基因的分离与克隆（目的基因来源于人体或病原体）构建构建DNADNA重组体（通常将目的基因与质粒重组体（通常将目的基因与质粒DNADNA整合，组建重组质粒）整合，组建重组质粒）将将DNADNA重组体转入宿主菌构建工程菌重组体转入宿主菌构建工程菌工程菌的发酵（在工程菌的发酵培养过程中，目的基因同时表达）工程菌的发酵（在工程菌的发酵培养过程中，目的基因同时表达）外源基因表达产物的分离纯化（用生物技术及化学、化学方法）外源基因表达产物的分离纯
8、化（用生物技术及化学、化学方法）成品的检验成品的检验 及包装等及包装等附：制备基因工程药物的一般程序附：制备基因工程药物的一般程序 目的基因目的基因 组建重组质粒组建重组质粒 构建基因工程菌构建基因工程菌 培养工程菌培养工程菌 除菌过滤除菌过滤 产物分离纯化产物分离纯化 半成品检定半成品检定 成品检定成品检定 包装包装u表达系统：原核生物系统和真核生物系统。表达系统：原核生物系统和真核生物系统。u选择表达系统主要考虑：选择表达系统主要考虑：保证表达的蛋白质的功能保证表达的蛋白质的功能 其次是表达量的多少和分离纯化的难易其次是表达量的多少和分离纯化的难易说说 明明u上游阶段：上游阶段：在实验室完
9、成，获得目的基因后，用限制性内切在实验室完成，获得目的基因后，用限制性内切酶和连接酶将目的基因插入载体，并转入宿主菌酶和连接酶将目的基因插入载体，并转入宿主菌u下游阶段：下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，为获得高质量、将实验室成果产业化、商品化，为获得高质量、高产量的表达产物，需对影响表达及分离纯化的因素进行分析高产量的表达产物，需对影响表达及分离纯化的因素进行分析（如新型生物反应器、高效分离介质及装置、分离纯化的优化（如新型生物反应器、高效分离介质及装置、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术等）控制、高纯度产品的制备技术等）第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得 对于原核生物，其
10、基因总量不大，可以选用合适的限制性对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因，而核酸内切酶切下目的基因，而真核生物的目的基因不能进行直真核生物的目的基因不能进行直接分离接分离 真核细胞中基因总量较大，单拷贝目的基因只是染色体真核细胞中基因总量较大，单拷贝目的基因只是染色体DNADNA中很小的一部分，直接分离纯化极为困难；中很小的一部分，直接分离纯化极为困难；另外，另外，真核真核基因一般都有内含子，若以原核细胞作为表达系统，即使分离基因一般都有内含子，若以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNAmRNA转录后的加
11、工系统，真核转录后的加工系统，真核基因转录的基因转录的mRNAmRNA也不能被加工、拼接成为成熟的也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA mRNA，因此，因此不能直接克隆真核基因。不能直接克隆真核基因。克隆真核基因常用的方法有克隆真核基因常用的方法有逆转录法逆转录法和和化学合成法化学合成法 一、逆转录法一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNAmRNA，再反转录，再反转录成互补成互补DNADNA，然后进行互补，然后进行互补DNADNA的克隆表达。从产生该蛋白的克隆表达。从产生该蛋白质的真核细胞中提取质的真核细胞中提取mRNAmRNA，以其为模板，在逆转
12、录酶的作，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质用下，反转录合成该蛋白质mRNAmRNA的互补的互补DNADNA，再以互补，再以互补DNADNA为模板，在逆转录酶或为模板，在逆转录酶或DNADNA聚合酶作用下，最终合成编码聚合酶作用下，最终合成编码该蛋白质的双链该蛋白质的双链DNADNA序列，该序列序列，该序列不含内含子不含内含子 细胞内含有三种细胞内含有三种RNARNA，mRNAmRNA占占RNARNA总量的总量的2%-5%2%-5%，相对分，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难，但是子量大小不一致，分离也有很大的困难，但是mRNAmRNA的的33末末端常含有一多聚腺苷酸端常
13、含有一多聚腺苷酸(polyApolyA)组成的末端，长达组成的末端，长达20-25020-250个个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸-纤维素上，从而可以用纤维素上，从而可以用亲亲和层析法和层析法将将mRNAmRNA从细胞总从细胞总RNARNA上分离出来，可得到纯度较高上分离出来，可得到纯度较高的的mRNAmRNA1.mRNA1.mRNA的纯化的纯化 mRNAmRNA的的33末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化逆转录酶的催化下，开始互补下，开始互补DNADNA的合的合成。在合成反应体
14、系中加入一种放射性标记的成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTPdNTP，在反，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTPdNTP掺入量，计掺入量，计算出互补算出互补DNADNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件分析产物的分子大小，探索最佳反应条件2.2.互补互补DNADNA第一链的合成第一链的合成 先用碱解或核酸酶酶解先用碱解或核酸酶酶解(RNaseHRNaseH 酶活性酶活性)的方法除去的方法除去互补互补DNA-mRNADNA-mRNA杂交链中的杂交链中的mR
15、NAmRNA链，然后以互补链，然后以互补DNADNA第一链第一链为模板合成第二链，并用核酸酶为模板合成第二链，并用核酸酶S1S1专一性切除单链专一性切除单链DNADNA 3.3.互补互补DNADNA第二条链的合成第二条链的合成 载体有两种质粒和噬菌体，根据重组后插入的互补载体有两种质粒和噬菌体，根据重组后插入的互补DNADNA是否能够表达、能否经转录和翻译是否能够表达、能否经转录和翻译 合成蛋白质，又将载体合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。互补分为表达型载体和非表达型载体。互补DNADNA插入片段小于插入片段小于1010千碱基对，可选用质粒载体，如大于千碱基对，可选用质粒载体，
16、如大于1010千碱基对则选用噬菌千碱基对则选用噬菌体作为载体体作为载体 4.4.互补互补DNADNA克隆克隆（1 1）载体的分类）载体的分类用于用于cDNAcDNA克隆的载体克隆的载体质粒质粒DNADNA，如，如 PUCPUC、PBR322PBR322等等噬菌体噬菌体DNADNA，如，如 gtgt 10 10、gtgt 11 11等等（2 2）载体的特点）载体的特点 PUC PUC和和gtgt 11 11属于表达型载体，而属于表达型载体，而PBR322PBR322和和gtgt 10 10属于非表达型载体属于非表达型载体表达型载体：表达型载体：在在cDNAcDNA插入位置的上游具有启动子序列，重
17、组后插入的插入位置的上游具有启动子序列，重组后插入的cDNAcDNA能够表达，并经转录和翻译合成相应蛋白质的载体能够表达，并经转录和翻译合成相应蛋白质的载体非表达型载体：非表达型载体：在在cDNAcDNA插入位置的上游无启动子序列，重组后插入的插入位置的上游无启动子序列，重组后插入的cDNAcDNA不能表达，不能经转录和翻译合成相应蛋白质的载体不能表达，不能经转录和翻译合成相应蛋白质的载体质粒载体容量小（只能插入小于质粒载体容量小（只能插入小于10kb10kb的的cDNAcDNA 片段）；而要插入大于片段）；而要插入大于10kb10kb的外源的外源cDNAcDNA 片段时，只能选用噬菌体作为载
18、体片段时，只能选用噬菌体作为载体（噬菌体作为载体，克隆效率噬菌体作为载体，克隆效率高，容量大高，容量大）（3 3）cDNAcDNA与载体的连接与载体的连接加同聚尾连接法加同聚尾连接法在在3-3-末端脱氧核苷酸转移酶的催化下，将载体和末端脱氧核苷酸转移酶的催化下，将载体和cDNAcDNA的的3-3-端加上互补端加上互补的同型多聚体序列（的同型多聚体序列（A-TA-T、G-CG-C），借助同型多聚体的退火作用形成重组分子），借助同型多聚体的退火作用形成重组分子在在T T4 4DNADNA连接酶作用下，封口环化连接酶作用下，封口环化加人工接头连接法加人工接头连接法 在在T T4 4DNADNA连接酶
19、作用下，人为地在目的基因两端接上人工接头，使连接酶作用下，人为地在目的基因两端接上人工接头，使DNADNA发生发生连接的方法连接的方法u人工接头：人工接头：由人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的由人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡聚核苷酸片段。它能使目的基因产生粘性末端，从而与载体连接寡聚核苷酸片段。它能使目的基因产生粘性末端，从而与载体连接5.将重组体导入宿主细胞将重组体导入宿主细胞 此过程是一个非同源此过程是一个非同源DNADNA重组的过程；即让质粒或噬菌重组的过程；即让质粒或噬菌体转化或感染感受态的大肠杆菌，从而将重组体引入宿主体转化或感染感受态的大肠
20、杆菌，从而将重组体引入宿主（E.ColiE.Coli）细胞内）细胞内6.cDNA6.cDNA文库的鉴定文库的鉴定根据重组体表型进行初步筛选根据重组体表型进行初步筛选然后采用凝胶电泳、分子杂交、然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNADNA序列分析等方法进一步筛选和鉴定序列分析等方法进一步筛选和鉴定抗性基因失活法抗性基因失活法菌落或噬菌体颜色改变法菌落或噬菌体颜色改变法7.7.目的目的cDNAcDNA克隆的分离纯化克隆的分离纯化核酸探针杂交法核酸探针杂交法 用层析和电泳技术纯化目的蛋白，根据目的蛋白的氨基酸序列分析用层析和电泳技术纯化目的蛋白，根据目的蛋白的氨基酸序列分析结果人工合成相应的单链寡聚核苷
21、酸序列作为探针；然后从结果人工合成相应的单链寡聚核苷酸序列作为探针；然后从cDNAcDNA文库中文库中分离出特异分离出特异cDNAcDNA克隆克隆免疫反应鉴定法免疫反应鉴定法 在无目的基因表型特征和核酸探针的情况下，本法是筛选特异在无目的基因表型特征和核酸探针的情况下，本法是筛选特异cDNAcDNA克隆的重要途径，即用目的蛋白的抗体寻找相应的特异克隆的重要途径，即用目的蛋白的抗体寻找相应的特异cDNAcDNA克隆克隆二、化学合成法二、化学合成法 1.1.适用条件：适用条件：只能合成较小蛋白质或多肽的编码基因只能合成较小蛋白质或多肽的编码基因 目的基因的核苷酸序列必须清楚；或目的蛋白质的氨基酸序
22、列清目的基因的核苷酸序列必须清楚；或目的蛋白质的氨基酸序列清 楚，然后按相应的密码子反推楚，然后按相应的密码子反推DNADNA碱基序列碱基序列2.2.过程：过程：用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火 成为两端形成粘末端的成为两端形成粘末端的DNADNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次双链片段，然后将这些双链片段按正确的次 序进行退火使连接成较长的序进行退火使连接成较长的DNADNA片段，再用连接酶连接成完整的基因片段，再用连接酶连接成完整的基因3.3.局限性：局限性：1.1.不能合成太长的基因，不能合
23、成太长的基因，50-6050-60个碱基对个碱基对 2.2.人工合成碱基对时，遗传密码的简并性为选择密码子带来很大的困难人工合成碱基对时，遗传密码的简并性为选择密码子带来很大的困难 3.3.费用较高费用较高 第四节第四节 基基 因因 表表 达达 是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程用基因工程制备药物，必须使目的基因进行高效表达用基因工程制备药物，必须使目的基因进行高效表达 一、基因表达一、基因表达目的产物产量高目的产物产量高目的产物质量高目的产物质量高表达产量表达产量分离纯化分离纯化产物的稳定性产物的稳定性产物的生物学活性产物的生
24、物学活性高效表达高效表达二、宿主细胞的选择二、宿主细胞的选择 （一）宿主细胞应满足以下要求（一）宿主细胞应满足以下要求 1.1.容易获得较高浓度的细胞容易获得较高浓度的细胞 2.2.能利用廉价易得的原料培养能利用廉价易得的原料培养 3.3.不致病、不产生内毒素不致病、不产生内毒素 4.4.发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态 5.5.容易进行代谢调控容易进行代谢调控 6.6.容易进行容易进行DNADNA重组技术操作重组技术操作 7.7.产物的产量、产率高，产物容易提取产物的产量、产率高，产物容易提取（二）宿主细胞的分类（二）宿主细胞的分类 1.1
25、.原核细胞：原核细胞：如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌2.2.真核细胞：真核细胞：如酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞如酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞 （1）大肠杆菌）大肠杆菌 生长迅速、对其遗传学背景研究比较深入、透彻，所以是目前基因工程研究生长迅速、对其遗传学背景研究比较深入、透彻，所以是目前基因工程研究中最常用的原核表达体系中最常用的原核表达体系特点：特点：产物多为胞内产物（因为大肠杆菌的表达产物不存在产物多为胞内产物（因为大肠杆菌的表达产物不存在信号肽信号肽）真核蛋白质常以不溶性真核蛋白质常以不溶性包含体包含体的形式存在（故下游处理过程必须经过复的形式存在（
26、故下游处理过程必须经过复 杂的变性和复性等工艺才能恢复其生理活性）杂的变性和复性等工艺才能恢复其生理活性）蛋白质产物不能糖基化（因为大肠杆菌的表达不存在翻译后修饰作用）蛋白质产物不能糖基化（因为大肠杆菌的表达不存在翻译后修饰作用）目的蛋白的目的蛋白的N-端常带有一个多余的端常带有一个多余的Met残基，易引起免疫反应残基，易引起免疫反应 有时会产生很难除去的内毒素（阴性杆菌的细胞壁成分）有时会产生很难除去的内毒素（阴性杆菌的细胞壁成分）有时会产生蛋白酶破坏目的蛋白有时会产生蛋白酶破坏目的蛋白1.1.原核细胞原核细胞（2 2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌 特点：特点：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分
27、泌到培养液中分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中 不形成包含体不形成包含体 不能使蛋白质产物糖基化不能使蛋白质产物糖基化 有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解 链霉菌作为外源基因的表达体系，目前正逐步受到人们的链霉菌作为外源基因的表达体系，目前正逐步受到人们的重视重视主要特点：主要特点：不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直 接分泌到培养液中，具有糖基化能力接分泌到培养液中，具有糖基化能力 （3 3）链霉菌）链霉菌2.2.真核细胞真核细胞（1 1）酵母）酵母 是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物
28、是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物特点特点 繁殖迅速繁殖迅速 基因工程操作简单（可以廉价地大规模培养，没有毒性）基因工程操作简单（可以廉价地大规模培养，没有毒性）能将表达产物直接分泌到胞外能将表达产物直接分泌到胞外 表达产物能糖基化表达产物能糖基化 特点特点 有很强的蛋白质分泌功能有很强的蛋白质分泌功能 能正确进行翻译后加工（包括肽剪切和糖基化等）能正确进行翻译后加工（包括肽剪切和糖基化等）糖基化方式与高等真核生物相似糖基化方式与高等真核生物相似 为无毒安全菌株为无毒安全菌株 如：胰岛素原在分泌贮备小泡中向细胞外运送时，其中的如：胰岛素原在分泌贮备小泡中向细胞外运送时，其中的C-C-肽
29、被切肽被切除后才变成具有活性的胰岛素除后才变成具有活性的胰岛素（2 2）丝状真菌（如霉菌）丝状真菌（如霉菌）（3 3）哺乳动物细胞）哺乳动物细胞 特点：特点：产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易 表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物 动物细胞生产慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀动物细胞生产慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀 综上所述，目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。因为对综上所述，目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母
30、。因为对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNADNA导导入方式，并且许多外源基因在这两种宿主菌中得到表达成功入方式，并且许多外源基因在这两种宿主菌中得到表达成功 三、不同宿主菌中的基因表达三、不同宿主菌中的基因表达（一）大肠杆菌中的基因表达（一）大肠杆菌中的基因表达 1.1.载体载体根据真核基因在原核细胞中表达的特点，根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件：表达载体应具备下列条件：载体能够独立复制载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型，有复制起点，有严紧型和松弛型严紧型载体：
31、严紧型载体：伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少（伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少（1-31-3）松弛型载体：松弛型载体：其复制可不依赖于宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达其复制可不依赖于宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达30003000个个应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选应具有很强的启动子应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的，能为大肠杆菌的RNARNA聚合酶所识别聚合酶所识别应具有阻遏子应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进
32、行转录应具有很强的终止子应具有很强的终止子，以便使，以便使RNARNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNAmRNA较为稳定较为稳定所产生的所产生的mRNAmRNA必须具有翻译起始信号必须具有翻译起始信号 2.2.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的，所以在建立表达体系外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的，所以在建立表达体系时要综合考虑各种因素的作用，建立一个合适的表达体系，从而使外源时要
33、综合考虑各种因素的作用，建立一个合适的表达体系，从而使外源基因得到最大的表达量，获得最多的表达产物基因得到最大的表达量，获得最多的表达产物（1 1）外源基因的拷贝数）外源基因的拷贝数 外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对外源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利于提高外源基因的总体表达水平非常有利（2 2）外源基因的表达效率）外源基因的表达效率 启动子的强弱启动子的强弱在转录水平上直接影响基因的表达
34、、在转录水平上直接影响基因的表达、核糖体结合位核糖体结合位点的有效性点的有效性、SDSD序列和起始序列和起始ATGATG的间距的间距、密码子的组成密码子的组成等都会不同程度等都会不同程度地影响外源基因的表达地影响外源基因的表达 基因表达调控的关键环节是转录，要实现外源基因的高效表达，首基因表达调控的关键环节是转录，要实现外源基因的高效表达，首先必须保证外源先必须保证外源DNADNA向向mRNAmRNA的高效转录，而转录的顺利进行，必须依靠的高效转录，而转录的顺利进行，必须依靠强强有效的启动子有效的启动子，因此在载体的目的基因上游必须连有一个适当的启动子，因此在载体的目的基因上游必须连有一个适当
35、的启动子；另外，真核基因的启动子不能被大肠杆菌的；另外，真核基因的启动子不能被大肠杆菌的RNA-RNA-polpol识别，故将真核基识别，故将真核基因的编码区置于大肠杆菌因的编码区置于大肠杆菌RNA-RNA-polpol能识别的强启动子（如能识别的强启动子（如 laclac、trptrp等）等）控制下，并将其控制下，并将其插入表达载体启动子的下游插入表达载体启动子的下游，以增加表达的机会，以增加表达的机会启动子的强弱启动子的强弱核糖体结合位点的有效性核糖体结合位点的有效性 核糖体结合位点是对真核基因在细菌中的高效表达十分核糖体结合位点是对真核基因在细菌中的高效表达十分重要；必须通过消除空间位阻
36、等的影响增加其有效性重要；必须通过消除空间位阻等的影响增加其有效性SDSD序列和起始序列和起始ATGATG的间距的间距 SDSD序列与起始密码间的间距对非融合蛋白的合成水平有序列与起始密码间的间距对非融合蛋白的合成水平有很大影响；距离过长或过短都不利于真核基因的表达（一很大影响；距离过长或过短都不利于真核基因的表达（一般距离般距离1010 35bp35bp较合适）较合适）密码子的组成密码子的组成 tRNAtRNA对密码子的对密码子的“偏爱性偏爱性”也是影响翻译效率的因素之一。也是影响翻译效率的因素之一。真核基因与原核基因在编码同一氨基酸时所偏爱使用的密码子真核基因与原核基因在编码同一氨基酸时所
37、偏爱使用的密码子不尽相同，为了实现真核基因在大肠杆菌中的高效表达，在设不尽相同，为了实现真核基因在大肠杆菌中的高效表达，在设计引物和合成基因时，应选择使用大肠杆菌计引物和合成基因时，应选择使用大肠杆菌“偏爱偏爱”的密码子的密码子（3 3）表达产物的稳定性）表达产物的稳定性 当外源基因大量表达时，由于应急反应，细胞内会迅速分泌大量降解当外源基因大量表达时，由于应急反应，细胞内会迅速分泌大量降解该蛋白质的酶，所以即使原始表达量很高，实际产量也不一定高，那就得该蛋白质的酶，所以即使原始表达量很高，实际产量也不一定高，那就得看被酶降解的程度。为了提高产量，必须提高表达产物的稳定性。具体措看被酶降解的程
38、度。为了提高产量，必须提高表达产物的稳定性。具体措施如下：施如下：组建融合基因，产生融合蛋白组建融合基因，产生融合蛋白利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性白质的稳定性选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞（4 4）细胞的代谢负荷）细胞的代谢负荷
39、外源基因在宿主细胞内的大量表达，必然会影响宿主细胞正常的生长外源基因在宿主细胞内的大量表达，必然会影响宿主细胞正常的生长代谢，有些产物对宿主还会有毒害作用，将细胞杀死，为了减轻宿主细胞的代谢，有些产物对宿主还会有毒害作用，将细胞杀死，为了减轻宿主细胞的代谢负荷，同时还得提高外源基因的表达水平，可采用代谢负荷，同时还得提高外源基因的表达水平，可采用两步培养法两步培养法 方法一方法一 将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，当宿主细胞的生将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，当宿主细胞的生物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合
40、成，以减低宿主细胞的代谢负荷 方法二方法二 将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开，当宿主细胞迅速生长将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开，当宿主细胞迅速生长时，抑制重组质粒的复制，当细胞生长量累积到一定水平后，再诱导细胞中时，抑制重组质粒的复制，当细胞生长量累积到一定水平后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加质粒拷贝数重组质粒的复制，增加质粒拷贝数（5 5）工程菌的培养条件）工程菌的培养条件 优化培养条件使外源基因大量表达优化培养条件使外源基因大量表达 （1）融合蛋白）融合蛋白（2）非融合蛋白）非融合蛋白（3）分泌型）分泌型 3.3.真核基因在大肠杆菌中的表达形式真核基因在大肠杆菌中的表达形式（
41、1 1）融合蛋白）融合蛋白 概念：概念：是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起所形成的蛋白质；其氨是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起所形成的蛋白质；其氨基基 端是原核序列，羧基端是真核序列端是原核序列，羧基端是真核序列优点：优点：基因操作简便基因操作简便 蛋白质在菌体内比较稳定蛋白质在菌体内比较稳定 蛋白质在菌体内稳定性好，不易被细菌酶类所降解蛋白质在菌体内稳定性好，不易被细菌酶类所降解 容易实现高效表达容易实现高效表达缺点：缺点：不能作抗原使用（因为原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原不能作抗原使用（因为原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原 性；目的蛋白需要回收性；目的蛋白需要回
42、收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获 目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段 ）（2 2）非融合蛋白）非融合蛋白 表达非融合蛋白的操纵子必须改建成表达非融合蛋白的操纵子必须改建成 细菌或噬菌体的启动子细菌或噬菌体的启动子细菌的核糖体结合位点（细菌的核糖体结合位点（SDSD序列）序列）真核基真核基因的起始密码子因的起始密码子结构基因结构基因终止密码终止密码（要求核糖体结合位点序列与翻译（要求核糖体结合位点序列与翻译起始密码之间的距离要合适，稍有不适就会影响表达效率）起始密码之间的距离要合适，
43、稍有不适就会影响表达效率）优点：优点：能够较好地保持原来的蛋白活性；能够较好地保持原来的蛋白活性；缺点：缺点：容易被蛋白酶破坏容易被蛋白酶破坏 N-N-末端常常带有甲硫氨酸，在人体内用药时可能会引起免疫反应末端常常带有甲硫氨酸，在人体内用药时可能会引起免疫反应 将外源基因连接到信号肽的下游，利用大肠杆菌的信号肽，构建成分泌将外源基因连接到信号肽的下游，利用大肠杆菌的信号肽，构建成分泌型表达质粒；当其在大肠杆菌中表达时，外源基因的表达产物（目的蛋白）型表达质粒；当其在大肠杆菌中表达时，外源基因的表达产物（目的蛋白）在信号肽的帮助下，以生物活性形式被分泌到细胞外在信号肽的帮助下，以生物活性形式被分
44、泌到细胞外特点：特点：提高了易被细胞内蛋白酶降解的表达产物的稳定提高了易被细胞内蛋白酶降解的表达产物的稳定 在细胞内表达时无活性的蛋白质，分泌表达时能按一定的方式在细胞内表达时无活性的蛋白质，分泌表达时能按一定的方式 折折 叠，形成具有活性的蛋白质叠，形成具有活性的蛋白质 分泌后的蛋白质产物不含起始密码所编码的分泌后的蛋白质产物不含起始密码所编码的MetMet（因为（因为MetMet随着信随着信 号肽被信号肽酶切割掉了）号肽被信号肽酶切割掉了）（3 3）分泌型蛋白）分泌型蛋白（二）酵母中的基因表达（二）酵母中的基因表达 1.1.酵母载体酵母载体（1 1）概念：）概念：是可以携带外源基因在酵母细
45、胞内保存和复制，并随酵母分是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分 裂传递到子代细胞的裂传递到子代细胞的DNADNA或或RNARNA单位单位（2 2）酵母载体分类：）酵母载体分类：普通表达载体普通表达载体和和精确表达载体精确表达载体 普通表达载体普通表达载体只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物 的组成，特别是对其的组成，特别是对其N-N-末端氨基酸是否有增减并无严格要求末端氨基酸是否有增减并无严格要求 精确表达载体精确表达载体要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切 酶位点，以利于接
46、入外源基因，并使它在表达和加工后酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后N-N-末端氨基酸末端氨基酸 序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸 由于从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母由于从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段再转入酵母中再转入酵母中 （3 3）克隆载体）克隆载体（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素 1.1.外源基因的拷贝数
47、外源基因的拷贝数 拷贝数要适当。拷贝数要适当。高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，但会引起细胞生长量的降低；单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长但会引起细胞生长量的降低；单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长没有影响，但表达的效率不高，必须调节好这两方面的关系没有影响，但表达的效率不高，必须调节好这两方面的关系 外源基因在酵母中表达效率外源基因在酵母中表达效率与与启动子启动子、分泌信号分泌信号、终止序列终止序列有关有关（1 1）要使外源基因在酵母中表达，必须将外源基因克隆到酵母菌表达载）要使外源基因在酵母中表达，必须将外源基因克隆到酵母菌表达载体的启动子和终止
48、子之间，构成表达框架（启动子体的启动子和终止子之间，构成表达框架（启动子-外源基因外源基因-终止子）终止子）（2 2）分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面）分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物（3 3）终止序列保证了转录产物在适当的部位终止，并加上）终止序列保证了转录产物在适当的部位终止，并加上polyApolyA，形成的，形成的mRNAmR
49、NA比较稳定并被有效地翻译比较稳定并被有效地翻译 2.2.外源基因的表达效率外源基因的表达效率3.3.外源蛋白的糖基化外源蛋白的糖基化 外源蛋白在酵母中可发生外源蛋白在酵母中可发生N-N-糖苷键（糖苷键（AsnAsn连接）和连接）和O-O-糖苷键（糖苷键（SerSer或或ThrThr连接）两种不同的糖基化，并在分泌过程中正确识别外源蛋白的糖连接）两种不同的糖基化，并在分泌过程中正确识别外源蛋白的糖基化信号，使其进行正确折叠和分泌到细胞外基化信号，使其进行正确折叠和分泌到细胞外 酵母细胞分泌的酵母细胞分泌的“异源异源”蛋白糖基化产物与天然产物完全相同，这蛋白糖基化产物与天然产物完全相同，这也是为
50、什么酵母细胞被广泛应用生产各种医用蛋白的原因也是为什么酵母细胞被广泛应用生产各种医用蛋白的原因 不同的酵母菌株及其生理状态对外源基因的表达有明显影响，不同的酵母菌株及其生理状态对外源基因的表达有明显影响，用用作表达的酵母宿主菌株应具备下列要求作表达的酵母宿主菌株应具备下列要求 菌体生长力强菌体生长力强 菌体内源蛋白酶较弱菌体内源蛋白酶较弱 菌体性能稳定菌体性能稳定 分泌能力强分泌能力强 4.4.宿主菌株的影响宿主菌株的影响五、动物细胞中的基因表达五、动物细胞中的基因表达 动物细胞表达的特点：动物细胞表达的特点：产物可分泌到细胞外，培养液成分可人工调产物可分泌到细胞外，培养液成分可人工调控，产物
