1、第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化质粒基因转化载体的构建载体的构建 Ti质粒的发现历史质粒的发现历史 1974年zeazen等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒，称为致癌质粒（Tumor inducing plasmid）,简称Ti质粒.最初的发现和命名是1907年,Smith 和Townsent发现双子叶植物常发生的冠瘿瘤是由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)诱发形成的.Ti质粒的遗传特性及类型质粒的遗传特性及类型 Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为分子，其分子量为9.5
2、1071.6108，大小为，大小为180250kb。迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它们的们的Ti质粒结构特性均有差别。质粒结构特性均有差别。根据根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，种类不同，Ti质粒可质粒可被分为四种类型：章鱼碱型被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱或称琥珀碱型型(succinamopine)。其中，章鱼碱型和胭脂碱型其中，章
3、鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。质粒较为常见。Ti质粒的基因位点及其功能区域质粒的基因位点及其功能区域Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右）质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右）（1）T-DNA区区（transferred-DNA regions）:T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下质粒上脱离下来转移并整合到植物的核基因组上的一段来转移并整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。片段上的基因与肿瘤形成有关。（2）Vir区区（virulence region）:该区段上的
4、基因的产物为该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需的转移及整合所必需，它导致农，它导致农杆菌产生毒性，故称之为杆菌产生毒性，故称之为毒区毒区。在。在Vir区有区有VirA、VirB、VirC、Vir D、VirE、VirG、VirH7个个操纵子操纵子共共24个基因。个基因。（3）Con区区（regions encoding conjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）,调控调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导基因，诱导Ti质粒转移，故称为质粒转移，故
5、称为结合结合转移编码区转移编码区。（4）Ori区区（origin of replication）:该区段基因调控该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为质粒的自我复制，故称为复制起始区复制起始区（点）。（点）。LBRB Ti质粒介导基因转化的原理质粒介导基因转化的原理 1.植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、如乙酰丁香酮、-羟基乙酰丁香酮等羟基乙酰丁香酮等)。2.酚类物质诱导酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因质粒上毒性基因(vir)表达表达:当根癌农杆菌接触当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经到植物表面的受伤部位
6、后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIR A蛋白传递给蛋白传递给VIR G，VIR G激活其它激活其它vir 基因基因(virB、virC、vir D、virE)表达表达Ti质粒上毒性基因质粒上毒性基因(vir)表达。表达。3.T-DNA单链分子释放：单链分子释放：virD 基因编码一种核酸内切酶，先基因编码一种核酸内切酶，先在在T-DNA右边缘区右边缘区(RB)切开一个单链缺口，再在同一链左边缘切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区区(LB)切开另一个单链缺口，使切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链形式释放出来。以单链形式释放出来。4.T-DNA单链分子转移到寄主细胞：单链分子转移到寄主细胞
7、：T-DNA单链分子与单链分子与vir产物产物VIR D2蛋白共价结合，并在蛋白共价结合，并在VIR D4和和VIR B蛋白的帮助引导下蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细胞膜和核膜。细胞膜和核膜。Ti质粒介导基因转化的原理质粒介导基因转化的原理 5.T-DNA整合到植物细胞的染色体中。整合到植物细胞的染色体中。T-DNA单链分子进入单链分子进入植物细胞后，在植物有关酶体系的催化下，互补的双链植物细胞后，在植物有关酶体系的催化下，互补的双链T-DNA分子分子,在在RB序列的引导下，序列的引导下，T-DNA
8、分子整合到植物细胞分子整合到植物细胞的染色体中。的染色体中。6.T-DNA区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细胞大量增值，形成冠瘿瘤，随着转化细胞的增值，胞大量增值，形成冠瘿瘤，随着转化细胞的增值，T-DNA也也被大量扩增，冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加，这些基因被大量扩增，冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加，这些基因表达后催化合成冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。表达后催化合成冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制酚类物质酚类物质VIR A 由此可见，农杆菌对植
9、物的侵染作用，就是一种天然发生的基因工程。由此可见，农杆菌对植物的侵染作用，就是一种天然发生的基因工程。一、Ti质粒的改造(一一)Ti质粒质粒1.定义定义 是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状DNA大分子，其大小为180-240 kb。2.种类种类 2.1 根据冠瘿碱的种类不同根据冠瘿碱的种类不同 章鱼碱型章鱼碱型(octopine);胭脂碱型胭脂碱型(nopaline);农杆碱型农杆碱型(agropine)和农杆菌素碱型农杆菌素碱型(agrocinopine)or琥珀碱型琥珀碱型(succinamopine)第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载
10、体的构建的构建第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(一一)Ti质粒质粒2.种类种类 2.2 根据功能区段不同根据功能区段不同 基因转移基因转移T-DNA区区(transferred DNA region)：与基因转移相关 毒性区毒性区,即即Vir区区(Virulence region,Vir):激活T-DNA转移,使农杆菌对植物表现出侵染性的毒性区 接合转移区接合转移区(region encoding conjuation,Con)调控Ti质粒在农杆菌间发生接合转移 自我复制区自我复制区(origin of replication,Ori)调控Ti
11、质粒自我复制第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(二二)天然天然Ti质粒存在的缺点质粒存在的缺点1.缺点缺点 野生型野生型Ti质粒分子十分巨大；质粒分子十分巨大；野生型Ti质粒分子一般都为180-240 kb,几乎无法进行基因工程的操作，所以应去除一切不必要的大片段DNA。限制性内切核酸酶位点众多；限制性内切核酸酶位点众多；Ti质粒是分布着各种限制性内切核酸酶，难以找到可利用的单一限制性内切核酸酶位，因此很难通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因.T-DNA区段内含有许多编码基因；区段内含有许多编码基因；植物生长素合成酶基因,细胞分
12、裂素合成有关酶基因等.在大肠杆菌中不能复制。在大肠杆菌中不能复制。第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(二二)天然天然Ti质粒存在的缺点质粒存在的缺点 2.改造改造 删除T-DNA左右边界中的tms、tmr和tmt基因,即切除T-DNA中onc基因,构建所谓的“卸甲载体卸甲载体”；引入大肠杆菌的复制起点和选择标记基因,或将Ti质粒的T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒当中,形成植物基因转化载体系统,从而使通过Ti质粒的基因重组成为可能并有利于转基因植物的筛选；插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆和操作；第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基
13、因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 引入植物基因的启动子和poly(A)信号序列，以确保外源基因在植物细胞内能正确高效地转录表达；除去Ti质粒上的其他非必需序列，以最大限度地缩短载体的长度。研究表明,大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性,因此,可以先将T-DNA的片段克隆到大肠杆菌的质粒中,并插入外源基因,最后通过接合转移把外源基因引入到农杆菌的Ti质粒上.中间载体中间载体:带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体;受体受体Ti质粒质粒:接受中间载体的Ti质粒.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(三三)御甲载体御甲载体定义定义:无毒的(
14、non-oncogenic)Ti质粒载体,又称onc-载体。野生型Ti质粒中T-DNA中onc基因具有致瘤作用，因此,作为基因转化的载体，必须切除T-DNA中的onc基因，即解除其武装，构建成卸甲载体。在onc-卸甲载体中，已经缺失的T-DNA部位通常被大肠杆菌中的一种常用质粒pBR322取代.这样任何适于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段,都可通过pBR322质粒DNA与卸甲载体的同源重组而被共整合到onc-Ti质粒载体上.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 二、二、Ti中间表达载体的构建中间表达载体的构建 中间载体 定义:是指在一个普通
15、大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适的T-DNA片段面构成的小型质粒。中间载体从功能上可分为两大类:1.克隆载体:复制和扩增基因 2.表达载体:适于在受体细胞中表达外源基因的载体 Ti中间表达载体结构区包括:选择标记基因区域;目的基因区域 每个区域由启动子、基因和终止序列组成.二、二、Ti中间表达载体的构建中间表达载体的构建(一一)启动子及调控序列启动子及调控序列 经由Ti质粒将外源基因整合到植物中并不一定就会发生基因的转录与表达，其先决条件在于必须要有合适的启动子和调控序列。真核生物基因调控序列中，大多数都具有“TATA”框，位于距离转录起始点约30个核苷酸的上游区域，上游DNA的序列成分如“
16、CAAT”(在上游-80-70bp处)也普遍存在于许多真核生物基因的启动子中。真核生物基因的3端具有AATAAA序列，从而使基因在转录过程中可以在mRNA的3端增加poly(A)的信号。第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 由AATAAA编码的mRNA序列AAUAAA的作用是发出信号，让核酸酶在此序列下游10-15bp 处切割mRNA,以便poly(A)聚合酶在切割点的3端加上100-200个腺苷酸.其作用是使mRNA的3端结合到内质网膜上,从而使3端稳定,起到保护m
17、RNA的作用.CaMV35S启动子 Ubiquitin启动子第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 二、二、Ti中间表达载体的构建中间表达载体的构建(二二)嵌合基因的构建嵌合基因的构建 嵌合基因:来自两种或两种以上生物的启动子,结构基因连接在一起而构成的基因.完整的嵌合基因:完整,正确的可读框,能正确表达,3端的终止信号.“植物特异性启动子+目的基因+终止子”、“植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和“植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。三、三、Ti共整合转化载体的构建共整合转化载体的构建共整合载体定义共整合载体定义 指中间载
18、体与改造后的受体Ti质粒之间,通过同源重组所产生的一种复合型载体.(一一)Ti共整合载体的特点共整合载体的特点Ti共整合载体由两个质粒组成,其中一个是E.coli质粒中间载体,另一个是御甲Ti质粒组成.农杆菌中两个质粒形成一个大的共整合载体.共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低.必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测构建是比较困难.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 三、三、Ti共整合转化载体的构建共整合转化载体的构建(二二)Ti共整合转化载体的类型和构建策略共整合转化载体的类型和构建策略 基于中间载体与受体T
19、i质粒重组序列的不同,共整合载体可分为以pBR322序列为同源序列的转化载体系统和基于左边界内部同源区(LIH)的转化载体系统,即SEV系统.1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略 此类载体系统的典型特点是在卸甲质粒的T-DNA区引入了pBR322,而中间载体是pBR322质粒或衍生质粒,二者之间通过同源重组实现目的基因及选择标记基因与卸甲Ti质粒的整合,进而以顺式方式将基因转化到植物细胞中去.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载
20、体的构建策略 中间载体导入农杆菌中间载体导入农杆菌 pBR322及由其衍生的质粒为接合缺陷型,所以它们进入到农杆菌菌株中必须要有协助质粒,在协助质粒的动员下转移到农杆菌中.三亲杂交法:即将分别含有中间表达载体,协助质粒,受体质粒的菌液混合培养,在混合培养过程中,通过杂交使协助质粒先转移到含有重组中间载体的菌株中,然后中间载体再被动员和转移到农杆菌中.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略(2)中间载体与受体中间载体与受体Ti质粒的同源重组质粒的同源重组 pGV110
21、3中间表达载体导入农杆菌后,由于两种质粒中都带有pBR322同源序列,因此少部分质粒发生重组和交换,使少数中间载体整合到pGV3850的T-DNA区域内,形成一个大的共整合载体.没有被整合的中间表达载体由于不能在农杆菌中复制,它将会随着农杆菌的分裂增殖而自行消失.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略(3)共整合载体的选择 通过pGV3850和pGV1103质粒同源重组形成的共整合载体
22、能够不断复制和增殖,整合在Ti质粒中的中间载体随同Ti质粒得岂到复制和增值.中间载体所带有的抗性基因(Ampr,Kanr,Smr或strr)都能得到表达.此时含有共整合质粒的农杆菌将表现出中间载体携带的抗性标记,从而在含有相应抗生素的培养基上得到生长和筛选.未发生重组的pGV3850,pGV1103等均不能生长.含有共整合质粒的根癌农杆菌即可用于植物的转化.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略(3)共整合载体的选择 整合后的Ti质粒含有重复的pBR322序列,此重
23、复序列在农杆菌转化植物细胞的过程中,与目的基因及选择标记基因一起被整合到植物染色体组上.但这种重复的序列有可造成基因的进一步重组及重排,从而影响外源基因的表达.因此,在对pGV3850系统进行改进的基础上,获得了pGV2260载体系统.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 1.基于基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略同源序列的共整合载体的构建策略(3)共整合载体的选择 pGV2260系统:来自章鱼碱型Ti质粒的pTiB6S3,整个T-DNA序列连同25bp末端序列均被一段pBR322所取代。与pGV3850的区别在于pGV2260系统的中
24、间载体必须在外源基因两侧连接25bp末端序列.共整合发生后,pGV2260系统中的pBR322重复序列在25bp末端序列以外,不会随T-DNA一起整合到植物染色体中.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 2.SEV系统的构建系统的构建 1985年美国孟山都公司的Fraley等建立了另一种共整合载体,即拼接末端载体(split-end vector,SEV)系统即T-DNA边界拼接系统,也因为它的两个“左边界内部同源区”(left inside homology,LIH)序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti
25、质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 2.SEV系统的构建系统的构建 构建过程:(1)SEV的受体Ti质粒是pTiB6S3-SE,来自野生型质粒pTiB6S3的突变体.它的TL-DNA上的致瘤基因(onc)及TR都缺失,T-DNA的保留部分被称为LIH,即左边界内部同源序列.该受体Ti质粒还保留了Vir基因及其他正常的功能基因,同时还携有用于细菌筛选的卡那霉素抗性基因(Kanr).第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(2)SEV中间载体是pMON200.它含有一个胭脂碱合成酶基因,一个在细菌里编码的壮观霉素抗性基因(Sper),链霉素抗性基
26、因(Strr)及在植物中作选择标记基因的新霉素磷酸转移酶基因(Npt).此外,它还含有一个多克隆位点(MCS),可以方便地插入外源基因.更为重要的是它具有与受体Ti质粒同源的LIH序列及TR.从pMON200衍生出的一个新的质粒pCIT30具有更理想的特性.质粒pCIT30中,潮霉素抗性基因(Hygr)代替了MMiI基因,并且引入了一个cos位点和多克隆位点.在噬菌体包装系统中可在cos位点上插入25-40kb的植物DNA,不需要额外的亚克隆步骤.多克隆位点上具有克隆和释放插入DNA所需要的限制酶酶切位点。该载体还具有T7和S6细菌噬菌体启动子，它们用于转录染色体步移中的末端特异性RNA探针.
27、第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(3)通过三亲杂交将中间载体pMON200或pCIT30导入农杆菌后,由于它之间都具有LIH同源序列,即可发生同源重组,形成SEV的共整合载体.SEV包含有分别来自两个质粒的左右边界及Vir基因,成为一个完整的非致瘤性Ti质粒.由于中间载体带有抗性嵌合基因,因而转化的植物可以直接进行筛选.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(3)SEV系统与系统与pGV3850系统的比较系统的比较 相同点:两者都是通过受全Ti质粒与中间载体同源重组而形成的,故同属于共整合载体.不同点
28、:它们的受体Ti质粒与中间载体的结构不同.pGV3850的左右边界(TL,TR)在一个受体Ti质粒上,而SEV来自两个质粒,即TR来自中间载体.同源序列不同.pGV3850重组的同源序列是pBR322,而SEV是LIH.SEV是更有效的共整合载体.pGV3850共整合载体转化的植物中也带有重复的pBR322序列.此重得序列可能对转化植物中的外源基因的稳定性有影响,而SEV系则排除了这种可能,所以更为有效.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建 四、四、TiTi双元转化载体的构建双元转化载体的构建 双元载体双元载体(binary vector)(bin
29、ary vector)定义定义:是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统.由于T-DNA与Vir基因分别位于两个独立的质粒上,Vir基因是通过反式激活的方式促成T-DNA的转移,故称为反式载体.通常含有T-DNA序列的穿梭载体用于携带嵌合基因,而含Vir基因的Ti质粒作为辅助质粒激活T-DNA的转移。第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(一一)Ti双元转化载体系统的构建原理双元转化载体系统的构建原理Ti质粒上的vir基因与T-DNA具有反式互补作用,即Vir基因可以反式激活TDNA 的转移。根据这一原理可以使T-DN
30、A与Vir区处于不同复制子或不同的Ti质粒上,同样可以激活T-DNA转移,使插入到T-DNA区的外源基因导入植物细胞中;双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点(ori),从而代替了在共整合载体中用以重组的同源区.它能够在任何农杆菌寄主里自发复制,这意味着所有的农杆菌菌株不论带有Ti质粒还是Ri质粒,不论它是武装的，还是解除武装的，都能导入中间表达载体而成为双元表达载体，寄主仅需要提供一套完整的Vir基因.第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(二二)Ti双元转化载体系统的特点双元转化载体系统的特点 由两个彼此相容的Ti质粒组成：1.转移载体质粒 是
31、T-DNA缺失的突变型质粒,类似于共整合表达系统中的卸甲质粒。2.穿梭质粒第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建穿梭质粒的特点：(1)具有PK2质粒的复制功能，可以在大肠杆菌和根癌农杆菌中复制，并且与Ti质粒是相容的;(2)具有Ti质粒的左右两侧或右侧的边缘区序列，使DNA可以转移到植物细胞；(3)边缘区序列内包含植物选择标记嵌合基因，用于转基因阳性株的初步筛选；(4)带有抗生素基因,一般是Kanr基因,可以作为细菌转化子的选择记号第一节第一节 根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体质粒基因转化载体的构建的构建(三三)共整合载体系统与双元表达载体系统的比较共整合载体系统与双元表达载体系统的比较 两个系统在构建思路上,一个是应用了Vir基因对T-DNA的顺式作用,一个是应用了反式调控,二者之间存在较大的差异.(1)双元表达载体构建简单;双元表达载体具有双复制位点;双元表达载体的接合频率更高;双元表达载体在鉴定上更为容易;(2)双元表达载体的稳定性不如共整合载体.
