1、食品酶学综合性实验1/111食品酶学综合性实验食品酶学综合性实验实验实验 1 1菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定【目的和要求】1.了解酶分离纯化的一般程序；2.掌握硫酸铵沉淀法、透析法分离提取菠萝蛋白酶的基本原理和方法；3.熟悉蛋白质含量测定、菠萝蛋白酶活力测定等实验原理和方法。【实验原理】1.建立有效的酶纯化程序应考虑的原则（1）利用酶在分离纯化上最有利的特性；（2）尽早使用一种选择性好的方法；（3）选择交换能力高的层析技术作为第一步层析；（4）不要连续使用相同的纯化方法；（5）将各层析步骤连接起来，使前一步得到的样品适用于下一步层析；（6）在
2、造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法；（7）要使每步过程的分辨能力呈递增趋势；（8）每步纯化过程后，通过量体积，酶活力和蛋白质浓度测定，监测纯化的进程。2.菠萝蛋白酶简介菠萝蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症。1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以
3、菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000DW，等电点 9.55，食品酶学综合性实验2/112最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是5565。金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。3.菠萝蛋白酶的粗分离（1）盐析分离盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶。但当
4、盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉淀出来，这种现象即为盐析。利用盐析作用可使不同蛋白质从溶液中析出从而实现分离。这是因为蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及 pH 有关。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使得不同分子量的蛋白质分别析出。用于盐析的中性盐通常有硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁等。由于硫酸铵的溶解度大而温度系数小（在 25时，溶
5、解度为 767g/L；在 0时，溶解度为 697g/L），分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉易得，以硫酸铵最为常用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，调节盐浓度可适当地将不同的蛋白质分开。如鸡蛋清中的球蛋白在 50%饱和度硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白 100%饱和硫酸铵中沉淀。硫酸铵的饱和度可从附录的“硫酸铵饱和度计算表”中查找，计算所需添加的硫酸铵量。（2）透析和超滤透析和超滤是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而小分子可以自由透过的性质，使蛋白质与小分子物质分开。透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，扎紧袋口放在蒸馏水或缓冲溶液中进行。透析时，需不断更换透析外液，直到透析袋内小分子
6、物质降低至内外平衡为止。超滤是利用压力或离心力，借助超滤膜将不同分食品酶学综合性实验3/113子质量物质分离的技术。超滤膜是由丙烯晴、醋酸纤维、硝酸纤维、尼龙等高分子聚合物制成的多空薄膜，截留的颗粒直径为220nm，相当于相对分子质量1 0005105.超滤技术不仅使蛋白质得以分离纯化，还可以达到浓缩的目的。4.菠萝蛋白酶活性测定酪蛋白是一种蛋白质，它被菠萝蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 280nm 处有最大吸收，且光吸收值与含量成正比，符合 Beer 定律。根据测定的 280nm 处的吸收值，可判定菠萝蛋白酶的酶活性。【实验仪器和用品】1.实验仪器电子天平、恒温水浴锅、电磁搅拌器、酸度计、
7、可见紫外分光光度计（配石英比色杯和玻璃比色杯）、冰箱、高速离心机、台式天平（离心平衡用）。2.实验用品（1）以组为单位的用品大试管 18mm200 mm（10 支）、试管架（2 个）、烧杯（50mL1，100mL2，200mL1）、滴管（2 支）、玻璃棒（2 支）、移液管（5mL1，1mL2，0.1mL1，0.2 mL1）、漏斗（3 个）、量筒（100mL1）、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。（2）全班共用的用品试剂瓶（1000mL7，250mL3，60mL20）、烧杯（1000mL4）、塑料烧杯（2000mL2）、量筒（500mL2，1000mL2）、广泛 pH
8、试纸、剪刀、电炉和锅、蒸馏水容器、透析袋（截留相对分子质量 8 00014 000）。【实验材料及试剂】1.实验材料新鲜菠萝（3 个）。2.试剂配制食品酶学综合性实验4/114（1）盐析粗提液 0.1mo1/L pH 7.8 磷酸缓冲液配制（PBS）（配 4 000mL）：称取 65.166g Na2HPO42H2O（或 131.108g Na2HPO412 H2O）5.305g NaH2PO4 2H2O，加蒸馏水溶解，定容至4000mL。0.01mo1/L pH 7.8 磷酸缓冲液配制（PBS）（配 4 000mL）：称取 6.517g Na2HPO42H2O（或 13.111g Na2HP
9、O4 12 H2O）0.531g NaH2PO42H2O，加蒸馏水溶解，定容至 4000mL。（2）酶活力测定试剂1酪蛋白（进口分装）（配 100mL）:称 1g 酪蛋白，溶于 100ml0.1mol/L PBS（PH7.8），于 40-50oC 水浴溶解，不停搅拌，约需 1-2 h 才能完全溶解。激活剂含 20mmo1L 半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)：用 0.1mo1/L pH 7.8 磷酸缓冲液配制，配制 100mL，现配现用。10三氯乙酸(TCA)：称 20g 三氯乙酸，用蒸馏水溶解并定容至 200mL。（3）透析袋的处理新买的透析袋，裁剪成所需
10、大小，在蒸馏水中煮沸 30min，取出用蒸馏水漂洗干净，即可使用。【实验步骤】1.菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料 30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约 60mL 预冷的 0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌 1015min 至粉碎，搅拌完成后用 4 层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于 4C 3000rpm 离心 6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。2.盐析根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按 30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量
11、分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为 30%，放置于冰食品酶学综合性实验5/115水混合物（4）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4C 4000rpm 离心 10min，收集沉淀，加入 0.1mo1/L pH 7.8 PBS 约 15mL 至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。3.透析将溶解液装入 2.5 cm8cm 透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸 30min）中，于500mL 烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min 换水一次，换水 34 次后，检查 SO42-是否已被除净（检查的方法是：取 2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加 23滴透析
12、外液至试管中，若出现白色沉淀，表示 SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。4酶活力测定方法取 2 支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。取 0.1mL 酶液，加入 0.9mL激活剂，加入 37预热的 1%酪蛋白溶液 1mL，准确反应 10min，加入 10%三氯乙酸3mL 反应终止酶反应。对照管先加入 10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。离心（3000r/min，5min）或过滤，清液于 280nm 波长下测定光吸收值。酶活单位定义：在上述条件下，每 10min 增加 0.001 个光吸
13、收值为 1 个酶单位（U）。实验步骤按照表格中完成。试剂(ml)对照组平行样品 1平行样品 2平行样品 3TCA3酶液0.10.10.10.1激活剂0.90.90.90.9酪蛋白111137C 准确反应 10minTCA333A280nm OD值5.蛋白质含量测定方法食品酶学综合性实验6/116将酶液稀释至一定程度，采用考马斯亮兰 G-250 法测定溶液中可溶性蛋白的含量（参照附录 1）。【结果计算】1.蛋白质含量计算参照附录 1。2.酶活力计算最后酶活结果取 3 次重复实验的平均值。酶液活力（U/mL）=稀释倍数3.酶比活的计算酶比活（U/mg 蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量4.酶纯化过程中回
14、收率计算回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）100=（纯化酶活力纯化酶液体积）/（粗酶活力粗酶体积）1005.酶纯化倍数的计算纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力6.分析及讨论将测定的数据整理计算分别填入下表，并菠萝蛋白酶的分离纯化效果进行分析和讨论。菠萝蛋白酶分离纯化表步骤步骤总体积总体积（mL）总蛋白质含总蛋白质含量（量（mg）总活力总活力（U）比活力比活力（U/mg 蛋蛋白）白）回收率回收率（%）纯化倍数纯化倍数粗提取盐析A280nm0.0010.1食品酶学综合性实验7/117透析【注意事项】1.酶活性测定时的反应时间一定要准确，并严格控制好反应时的温度。2.高速离心前一定要平衡好
15、离心管。3.注意透析袋是否破裂，透析时间长时要置于 4下进行。【思考题】1.如何防止酶在分离纯化过程中发生变性失活。2.常见的酶活性表示方法有那些（如：U/mL 酶液；U/mg 蛋白质;U/g 干重或鲜重；U/g 酶粉 等）？它们各有什么含义，适用哪些场合？3.蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？哪些变性了？哪些没有变性？4.实验中硫酸铵盐析为什么要选择0%30%饱和度？【参考书目】1.李建武，萧能，余瑞元等，生物化学实验原理和方法，北京，北京大学出版社，19942.余冰宾生物化学实验指导北京：清华大学出版社，20033.赵亚华，高向阳 生物化学与分子生物学实验技术教程 北京：高等教育出版社，200
16、5附录附录 1 1实验实验考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G250G250 染色法测定蛋白质含量染色法测定蛋白质含量【目的和要求】掌握考马斯亮蓝 G250 法测定蛋白质含量的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内（01000g/mL），蛋白质-色素结合物在波长595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质和考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定
17、。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量。大量的去污剂对测定有严重的食品酶学综合性实验8/118干扰，少量可通过对照消除。由于此法简便迅速、干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。【实验器材】分光光度计、离心机、分析天平（万分之一）、药物天平、研钵、烧杯、量筒（10mL1）、容量瓶（100mL1）、刻度吸管（lmL1，0.lmL1）、具塞刻度试管（10mL1）、漏斗、漏斗架、剪刀。【实验材料及试剂】（1）样品溶液。（2）标准溶液：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000g/mL的原液。（3）染液：称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50mL90乙醇溶液中，再
18、加入100mL 85的磷酸，最后用蒸馏水定容至1000mL。此溶液在室温下可放置一个月。【实验步骤】1.标准曲线的绘制(1)01000g/mL标准曲线的绘制：另取6支试管编号，按下表加入试剂。管号管号1234561000g/mL牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（g/mL）01.000.20.82000.40.64000.60.81.00.40.206008001000得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000g/mL，准确吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min，测定595nm吸光值，绘制0-1000g/mL
19、标准曲线。2.样品的测定准确吸取样品溶液0.1mL放入具塞刻度试管中，与步骤（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm。【结果计算】食品酶学综合性实验9/119由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（g/mL），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。查出的蛋白提取液浓度（g/mL）定容体积(mL)样品蛋白含量(g g 鲜重)样品重量(g)【注意事项】1.比色应在出现蓝色 2min1h 内完成。2.测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇浸泡将比色杯上的蓝色清洗干净。【思考题】1.考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理是什么？2.比较双缩脲法、Folin-酚法、紫外吸收
20、法、考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的优缺点。【参考书目】1.Bradford，M.M.，Anal.biochem：1976，248-2542.李建武，萧能，余瑞元等.生物化学实验原理和方法.北京：北京大学出版社，1994食品酶学综合性实验10/1110附录 2 硫酸铵饱和度计算表（1）调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25C）硫酸铵终浓度，%饱和度1470758090100硫酸铵初浓度，饱和度每1L溶液加固体硫酸铵的g数61962251656166276711288326365469423235206192533583371621982352733143564495463312437412
21、52292333426522353163941291642411506437546945326599033943152553367135362273146534701071902757753611519880771579079*在 25C 下，硫酸氨溶液由粗浓度调到终浓度时，每 L 溶液所加固体硫酸铵的 g 数食品酶学综合性实验11/1111（2）调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0C）在0C硫酸铵终浓度，%饱和度2硫酸铵初浓度，%饱和度010.613.416.457.910.813.7105.38.110.9152.65.48.22002.75.52502.730035404550556065707580859095100*在 0下，硫酸铵溶液由初浓度到终浓度时，每 100mL 溶液所加固体硫酸铵的 g 数。
