1、1血清碱性磷酸酶活性测定血清碱性磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠法）（磷酸苯二钠法）三峡大学医学院生化教研室三峡大学医学院生化教研室2引言引言 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方法。酶测定约占目前临床生化总用的方法。酶测定约占目前临床生化总工作量的工作量的1/4到到1/2。用于诊断的酶类已超过用于诊断的酶类已超过100多种，常用的多种，常用的数十种数十种。3引言引言 一些酶在一些酶在不同器官、组织、细胞内的分布和定不同器官、组织、细胞内的分布和定位存在明显差异位存在明显差异，而且在细胞内外有明显浓度，而且在细胞内外有明显浓度梯度差。梯度差。正常情况下血清中酶活
2、性相对恒定。但一些正常情况下血清中酶活性相对恒定。但一些病病理情况理情况常导致常导致血清中酶活性的改变血清中酶活性的改变。性别、年。性别、年龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人血清中某些酶的血清中某些酶的生理性生理性变化。变化。所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性和灵敏度。和灵敏度。4诊断常用血清酶的来源诊断常用血清酶的来源血清酶血清酶 符号符号 来源来源鸟氨酸氨基甲酰转移酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝肝卵磷脂胆固醇酰基转移酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝肝 谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 GLDH 肝
3、肝山梨醇脱氢酶山梨醇脱氢酶 SDH 肝肝丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶 ALT 肝、肾、心肝、肾、心异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶 ICD 肝、胎盘、心肝、胎盘、心-谷氨酰转肽酶谷氨酰转肽酶 -GT 肝、胆、肾、小肠肝、胆、肾、小肠5-核苷酸酶核苷酸酶 5-NT 肝、胆道肝、胆道单胺氧化酶单胺氧化酶 MAO 肝、肾、脑肝、肾、脑 天门冬氨酸氨基转移酶天门冬氨酸氨基转移酶 AST 心、肝、骨骼肌心、肝、骨骼肌肌酸激酶肌酸激酶 CK 骨骼肌、心、脑骨骼肌、心、脑乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺心、肾、骨骼肌、肝、肺碱性磷酸酶碱性磷酸酶 ALP 骨骼、牙齿、肝、肾骨骼、牙齿、肝、
4、肾酸性磷酸酶酸性磷酸酶 ACP 前列腺、红细胞、血小板前列腺、红细胞、血小板淀粉酶淀粉酶 AMS 胰、唾液腺胰、唾液腺脂肪酶脂肪酶 LPS 胰胰5碱性磷酸酶碱性磷酸酶(Alkaline Alkaline phosphatase,ALPphosphatase,ALP or AKP)or AKP)ALP is a hydrolase enzyme responsible for removing phosphate groups from many types of molecules,including nucleotides and proteins.most effective in an
5、alkaline environment ALPALP几乎存在于机体各个组织，但以几乎存在于机体各个组织，但以骨骼、牙齿、肝骨骼、牙齿、肝脏和肾脏脏和肾脏中含量较多，儿童期含量尤其多。中含量较多，儿童期含量尤其多。临床上测定临床上测定ALPALP活性主要用于活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病肝脏疾病和骨骼疾病的的诊断。诊断。6碱性磷酸酶的临床意义碱性磷酸酶的临床意义1.生理性增加生理性增加：如：如儿童、妊娠期、进食高糖、高脂肪儿童、妊娠期、进食高糖、高脂肪食物食物等均可使血清等均可使血清ALP活性增高。活性增高。2.病理性改变：病理性改变：升高升高（1）肝胆疾病肝胆疾病。主要见于。主要见于阻塞性黄
6、疸阻塞性黄疸，急、慢性黄疸，急、慢性黄疸性肝炎，肝癌等均可引起血清性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升活力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明显。高，其中以癌性梗阻最明显。（2）各种骨骼疾病各种骨骼疾病。ALP主要由主要由成骨细胞成骨细胞产生，故骨产生，故骨骼病特别是有新生骨质生成时，血液内骼病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，活性增加，以促进磷酸盐的沉积。如以促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复愈合期不全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清等均引起血清ALP升高。升高。降低降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等
7、。：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。7 问题：问题：如何测定酶活性？如何测定酶活性？8酶活性的概念酶活性的概念 酶活性酶活性：酶催化某一化学反应的能力酶催化某一化学反应的能力 常用常用单位时间内底物的减少量或产物的生单位时间内底物的减少量或产物的生成量成量（即即酶促反应速度酶促反应速度）来表示酶活性大小来表示酶活性大小 注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。内产物的生成量为好。9酶活性的测定方法酶活性的测定方法 终止测定法（或定时法）：终止测定法（或定时法）：通常是酶作用一段时通常是酶作用一段时间后，间后，加入强酸、强碱、蛋
8、白沉淀剂等终止酶促加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量成量，计算酶促反应的，计算酶促反应的平均速度平均速度。连续监测法：连续监测法：连续监测法是指连续监测法是指每隔一定时间（每隔一定时间（2 260s60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应，连续多次测定酶反应过程中某一反应产物产物或底物量随时间变化的数据或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。间接计算酶活性浓度的方法。适用于适用于自动生化分析仪自动生化分析仪 目前已取代终止测定法而成为临床实验室测定酶活性浓目
9、前已取代终止测定法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法度最常用的方法10 问题：问题：测酶活性应注意哪些方面？测酶活性应注意哪些方面？11酶最适反应条件的选择酶最适反应条件的选择 合适的底物与最适底物浓度合适的底物与最适底物浓度 底物浓度远远高于酶浓度底物浓度远远高于酶浓度 理想的理想的缓冲液缓冲液与最适离子强度与最适离子强度 最适最适温度温度 如何控制？如何控制？最适最适pH 如何控制？如何控制？合适的辅因子、激活剂浓度合适的辅因子、激活剂浓度 合理的测定时间合理的测定时间对于对于终止测定法，终止测定法，需在酶作用一段时间后，需在酶作用一段时间后，加入合加入合适的终止剂终止酶促反应适的
10、终止剂终止酶促反应。尽量去除各种抑制剂尽量去除各种抑制剂12 问题：问题：如何表示酶活性大小？如何表示酶活性大小？13酶活性单位酶活性单位 定义：定义：在在一定条件一定条件下，下，一定时间一定时间内将内将一定量的底物一定量的底物转转化为产物（或得到化为产物（或得到一定量的产物一定量的产物）所需要的）所需要的酶酶量量。分类：分类：惯用单位：惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的酶活性测定方法的建立者所规定的单位。单位。国际单位国际单位(International unit,IU)(International unit,IU)：指在规：指在规定条件下，定条件下，每分钟转化每分钟转化1 1 mol
11、mol底物的酶量底物的酶量。KatKat单位：单位：指在规定条件下，指在规定条件下，每秒钟转化每秒钟转化1mol1mol底物底物的酶量，的酶量，1Kat=61Kat=610107 7IUIU。14实验目的实验目的 熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法（磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法）掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义15实验原理实验原理 测定测定ALPALP活性活性的方法主要分为的方法主要分为两两种种一是测定底物解离下的一是测定底物解离下的磷酸根磷酸根来计算酶活力，来计算酶活力，如如-甘油磷酸钠法甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根，但存在血
12、清本身有磷酸根的缺点；的缺点；二是测定底物解离磷酸根后的二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物羟基化合物，这，这种方法又可分为：种方法又可分为：酚化合物在酚化合物在显色剂显色剂的作用下显色比色测定的作用下显色比色测定（如（如本次实本次实验方法验方法）。生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如对对硝基硝基苯苯磷酸磷酸二钠（二钠（PNPPPNPP）法法。无色的对硝基苯磷酸二钠在无色的对硝基苯磷酸二钠在ALPALP的作用下，生成在的作用下，生成在405nm405nm处有处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测定在特异吸收的淡黄色对硝基苯酚。通过测定在405
13、nm405nm处吸光度处吸光度的变化速率来计算的变化速率来计算ALPALP的活性。的活性。16实验原理（磷酸苯二钠法）实验原理（磷酸苯二钠法）在在pH10pH10环境中，环境中，ALPALP催化催化磷酸苯二钠磷酸苯二钠水解生成水解生成苯酚苯酚和磷酸氢和磷酸氢二钠。二钠。苯酚苯酚在碱性溶液中与在碱性溶液中与4-4-氨基安替比林氨基安替比林作用，经作用，经铁氰化钾铁氰化钾氧化氧化生成生成醌衍生物醌衍生物。可根据可根据红色深浅红色深浅测定酶活性的大小。测定酶活性的大小。K3Fe(CN)617试剂试剂1、碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH10.0)：溶解无水碳：溶解无水碳酸钠酸钠6.36
14、g，碳酸氢钠，碳酸氢钠3.36g。4-氨基安替比林氨基安替比林1.5g于蒸馏水于蒸馏水800ml中，将此溶液转入中，将此溶液转入1L容量瓶内，容量瓶内，加蒸馏水到刻度。棕色瓶中贮存。加蒸馏水到刻度。棕色瓶中贮存。2、磷酸苯二钠底物液磷酸苯二钠底物液(20mmol/L)3、铁氰化钾溶液、铁氰化钾溶液：铁氰化钾，硼酸：铁氰化钾，硼酸 作用：作用：终止反应，显色终止反应，显色4、酚标准应用液、酚标准应用液：0.05mg/ml18实验操作实验操作TSBC血血 清清(ml)0.1酚标准液酚标准液(ml)0.1蒸馏水蒸馏水(ml)0.1pH10碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液(ml)1.01.01.01.0混匀。
15、混匀。37水浴保温水浴保温5分钟，同时将底物液预热分钟，同时将底物液预热底物液底物液(ml)1.01.01.01.0混匀。混匀。37水浴水浴准确准确保温保温15分钟分钟铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液(ml)3.03.03.03.0血血 清清(ml)0.1 立即混匀。用立即混匀。用510nm波长比色，以波长比色，以蒸馏水蒸馏水调零点，读取调零点，读取各管吸光度。各管吸光度。19计算计算 金氏单位（金氏单位（Kings）定义：）定义：每每100ml血清血清在在37与与底物作用底物作用15分钟分钟，产生，产生1mg酚酚为为1个金氏单位个金氏单位。参考值参考值 成人：成人：313金氏单位；金氏单位；儿童：儿
16、童：528金氏单位金氏单位10005.0BSCTAAAAALP活性（金氏单位）20【注意事项】1、铁氰化钾溶液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。、铁氰化钾溶液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。2、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色，、底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显红色，说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。3、加入铁氰化钾后加入铁氰化钾后必须迅速混匀必须迅速混匀，否则显色不充分。，否则显色不充分。4、一般血清标本可以共用对照管，、一般血清标本可以共用对照管，黄疸血清及溶血黄疸血清及溶血血清应分别作对照管血清应分别作对照管。21讨论讨论 结合参考值范围、临床意义等分析本小结合参考值范围、临床意义等分析本小组的实验结果组的实验结果 思考题思考题22下周实验下周实验口服葡萄糖耐量试验口服葡萄糖耐量试验，血糖测定（，血糖测定（GOD-POD法）法）书写预习报告书写预习报告制作制作ppt并发言并发言组长安排本次做清洁的同学组长安排本次做清洁的同学
