1、PCRPCR技术原理及技术原理及PCRPCR仪的应用仪的应用1 PCR技术原理2 PCR仪的技术应用一、PCR技术简史19711971年，年，KhoranaKhorana提出：经过提出：经过DNADNA变性，变性，与合适引物杂交，用与合适引物杂交，用DNADNA聚合酶延伸引物，聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆并不断重复该过程便可克隆tRNAtRNA基因。基因。但由于测序和引物合成的困难，以及但由于测序和引物合成的困难，以及7070年代基因工程技术的发明使克隆基因成年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，为可能，所以，KhoranaKhorana的设想被人们遗的设想被人们遗忘了忘
2、了19851985年，美国年，美国PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等人发明了聚合等人发明了聚合酶链式反应（酶链式反应（PCRPCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNADNA复制复制最初采用最初采用E-coli DNAE-coli DNA聚合酶进行聚合酶进行PCRPCR，由于该酶不耐热，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错使这一过程耗时，费力，且易出错耐热耐热DNADNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCRPCR能高效率的进行，随后能高效率的进行，随后PE-CetusPE-Cetus公司推出了第一台公司推出了第一台P
3、CRPCR自动化热循环仪自动化热循环仪一、PCR技术简史 二、PCR的基本原理DNA的复制又称为聚合酶链式反应ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶 解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长变成两条单链变成两条单链DNA二、PCR的基本原理DNA的复制聚合酶链式反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCGAUCGCG引物酶引物酶RNA引物RNA引物二、PCR的基本原理DNA的复制聚合酶链反应的
4、发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶二、PCR的基本原理类似于类似于DNADNA的体内复制的体内复制DNA的复制又称为聚合酶链式反应首先待扩增DNA模板加热变性解链将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环
5、的不断重复。降温升温PCR Cycle-Step 1PCR Cycle-Step 1-Denaturation Template -Denaturation Template DNA by Heat(95DNA by Heat(95o oC)C)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图原理示意图模板模板DNA的的变性变性：模板：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；反应作准备；PCR Cycle-Step 2
6、PCR Cycle-Step 2 Temperature is lowered(TTemperature is lowered(Tm m)and primers anneal to)and primers anneal to target sequencestarget sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板模板DNA与引物的与引物的退火退火(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单链后，温经加热变性成单链后，温度降至度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的碱基序列配对结合；单链的碱基序
7、列配对结合；PCR Cycle-Step 3-PCR Cycle-Step 3-At 72 At 72 o o C C TaqTaq DNA polymerase catalyses primer DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are extension as complementary nucleotides are incorporatedincorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq D
8、NAPolymerase引物的引物的延伸延伸：DNA模板模板-引物结引物结合物在合物在TaqDNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTP（各种核苷（各种核苷酸）为反应原料，酸）为反应原料，靶序列为模板，按靶序列为模板，按碱基配对与半保留碱基配对与半保留复制原理，合成一复制原理，合成一条新的条新的DNA 链。链。End of the 1st PCR Cycle End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceResults in two copies of target sequenceTarget Sequ
9、enceTarget Sequence每完成一个每完成一个循环需循环需24分钟，分钟，23小时就能将小时就能将待扩目的基待扩目的基因放大几百因放大几百万倍。万倍。No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Amplicon高效的高效的DN
10、A分析技分析技术术PCR仪三、普通PCR反应1234522557294时间（min）温度（）普通PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍模板DNA95PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点50引物1引物2DNA引物PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCRPCR的
11、基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点72第1轮结束第2轮开始PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点955072TaqTaqTaqTaqPCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点72第2轮结束PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增理想拷
12、贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20普通PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12)量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10(ug=10-6-6)水平水平2.2.能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3.3.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU4.4.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速1.1.
13、一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增2.2.扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提的粗提DNADNA标准的PCR反应体系：反应体积：反应体积：5010050100l l10X10X缓冲液缓冲液 10 10 L L4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12 2 g gTaq DNATaq DNA
14、聚合酶聚合酶 2.5U2.5UMgMg2+2+1.5mmol/L1.5mmol/L普通PCR反应（一）普通PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可（cDNA，逆转录而来，自行得到)。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率。直接提交模板序列到特定网页。直接提交模板序列到特定网页。如：如：http:/genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/w
15、eb-primer;http:/frodo.wi.mit.edu/引物设计软件，其中以引物设计软件，其中以“Oligo 6”和和“Premier5.0”最最为优秀。为优秀。首先是引物分析评价功能，其次是引物的自动搜索功能，首先是引物分析评价功能，其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同。各种软件在这方面的侧重点不同。（一）引物设计的方法（一）引物设计的方法PCR引物的设计（二）（二）引物长度在引物长度在15153030碱基。引物过短，会使特碱基。引物过短，会使特异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合异性降低。过长会提高相应的退火温度，且合成引物的成本增加。成引物的成本增加。引物
16、中碱基的分布是随机的，避免引物中碱基的分布是随机的，避免4 4个以上的个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列，嘌呤或嘧啶的连续排列，G+CG+C含量宜在含量宜在 45 455555左右。左右。PCR引物的设计引物的引物的3 3 端不能有任何修饰，也不能有形成任端不能有任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。何二级结构的可能。引物的引物的5 5 端限定着端限定着PCRPCR产物的长度，可根据产产物的长度，可根据产物的要求不同，物的要求不同，可以选用不同的引物修饰法。可以选用不同的引物修饰法。引物与非扩增序列的同源性不应超过引物与非扩增序列的同源性不应超过7070。（3）Taq DNA聚合酶（thermu
17、s aquaticus)0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP(四种核苷酸，提供碱基）20200mol/L dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量，但特异性增加 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的
18、浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。1050mmol/L Tris-Cl 缓冲液，72 时pH 7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50 mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。（6）PCR反应的缓冲液（二）普通PCR的循环参数：（1）变性 94oC95oC，30-60 s 且最初在加Taq酶之前先于97oC充分变性510min（2）退火 50oC55oC，60-90 s 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）（4）（三）P
19、CR产物 在在PCR反应中，反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学扩增过程遵循酶的催化动力学原理。原理。反应初期，反应初期，目的目的DNA片段片段呈指数扩增。随着目的呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，扩增产物逐渐积累，扩增DNA片段的增加减慢进入相对片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现稳定状态，即出现“停滞效应停滞效应”，又称，又称“平台期平台期”。到。到达平台期所需达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，物的竞争等因
20、素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般聚合酶一般要进行要进行25次以上次以上PCR循环。循环。多数情况下，平台期在多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。反应中不可避免。PCR产物的积累规律示意图30个循环最适宜 （四）普通PCR的产物的检测琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 是是PCRPCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。其分辨率很高，可测出其分辨率很高，可测出1ng DNA1ng DNA。一般一般800bp800bp以上的片段以上的片段用用0.8%0.8%的胶，的胶，800bp800bp以下的片段用以下的片段用1.0%1.0%2.0%2.0%的
21、胶。的胶。为了确定为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段，产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和包括点杂交和Southern印迹杂交。点杂交灵敏度较高，印迹杂交。点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析。扩增产物分析。Southern印迹杂交可鉴定印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异产物的大小和特异性，检测灵敏度可达性，检测灵敏度可达10ng。基本过程是。基本过程是PCR产物进行产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，印迹转移到尼龙膜上，常规的琼脂糖凝胶电泳，
22、然后，印迹转移到尼龙膜上，再用标记的探针进行杂交检测。再用标记的探针进行杂交检测。分子杂交分子杂交（五）普通（五）普通PCRPCR反应中应注意的事项反应中应注意的事项（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及Ep管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照二）设立对照：阳性对照：阳性模板阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分试剂对照：除模板外的所有组分（六）（六）普通PCR反应中常见问题无扩增产物无扩增产物非特异性扩增非特异性扩增拖尾拖尾假阳性假阳性（七）（七）普通PCR反应
23、缺点a.a.只能对终产物进行分析，无法只能对终产物进行分析，无法对起始模版准确定量对起始模版准确定量b.b.必须在扩增反应结束后借助电必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事泳方法分析，费时费事c.c.无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测d.EB(d.EB(核酸染料，在电泳时使用）核酸染料，在电泳时使用）有毒有毒real-time PCRreal-time PCR，FQ-PCR FQ-PCR，美国美国PE（Perkin Elmer）公司）公司1995年研制出来的一种新的核年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在酸定量技术，该技术是在普通普通PCR基础上加基础上加入荧光标记探针
24、入荧光标记探针来实现其定量功能的，与普来实现其定量功能的，与普通通PCR相比，实时定量相比，实时定量PCR具有许多优点。具有许多优点。四、实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR：利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循每一个循环扩增产物量的变化环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值（循环数）值（循环数）和标准曲线和标准曲线实现对实现对起始模板进的起始模板进的定量分析。定量分析。PCRPCR扩增时在加入一对引物的同时加入扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸探针，该探针为一寡核苷酸，探针的，探针的
25、5 5端端标以荧光发射标以荧光发射基团基团FAMFAM（荧光发射峰值在（荧光发射峰值在518nm518nm处），处），靠近靠近3 3端端标以荧光淬灭基标以荧光淬灭基团团TAMRATAMRA（荧光发射峰值在（荧光发射峰值在582nm582nm处）处）。探针完整时，报告基团发。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR;PCR扩增时扩增时TaqTaq酶的酶的5-35-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号
26、，即每扩增一条增一条DNADNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与的累积与PCRPCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。（一）实时荧光定量PCR原理和方法荧光发射基团荧光淬灭基团Taq酶每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号与基因拷贝数成正比IQ5 Real-time PCR仪循环数，ct值荧光强度 随着随着PCRPCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩
27、增曲线图线图 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR三个关键词：三个关键词：实时，荧光，定量实时，荧光，定量 如何如何实时实时检测？检测？借助借助荧光荧光物质示踪扩增产物量的变化物质示踪扩增产物量的变化 如何对起始模板如何对起始模板定量定量？通过通过CtCt值值和和标准曲线标准曲线实现对实现对起始模板起始模板的的定量分定量分析析 引入两个概念：引入两个概念：荧光阈值、荧光阈值、CtCt值值荧光阈值荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即即PCRPCR扩增产物量的扩增产物量的标准标准)阈值线阈值线荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值
28、，它可以设定在指数扩增阶段任荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，默认设置一般是意位置上，默认设置一般是3-153-15个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010倍。倍。但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑 CtCt值的概念值的概念CtCt值的定义是值的定义是PCRPCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数扩增循环次数C(t)值值C(t)值值18.12+/0.04-阈值线阈值线模板起
29、始浓度越高，Ct值越小CTCT值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系哪个样品浓度高？哪个样品浓度高？普通普通PCRPCR终点处检测产物量不恒定；终点处检测产物量不恒定；Real-time PCRReal-time PCR利用利用CtCt的概念，在指数扩的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该CtCt值具有值具有极好的重复性极好的重复性。定量原理定量原理 理想的理想的PCRPCR反应：反应：X=XX=X0 0*2 2n n 非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：X=XX=X0 0(1+Ex)(1+
30、Ex)n n n n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数 X X：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量 X X0 0：初始模板量：初始模板量 ExEx：扩增效率：扩增效率Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq DNA多聚酶多聚酶引物引物模板模板DNA或或缓冲液缓冲液荧光物质荧光物质（二）实时荧光定量PCR反应体系SYBR Green 1染料 TaqMan探针荧光化学荧光化学（三）SYBR Green I 工作原理l SYBR Green 1 SYBR Green 1 结合到双链结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位l在游离状态下，在游离状态下，SYBR Gree
31、n ISYBR Green I发出微弱的荧发出微弱的荧光，但一旦与双链光，但一旦与双链DNADNA结合后，荧光大大结合后，荧光大大增强。因此，增强。因此，SYBR Green ISYBR Green I的的荧光信号强度荧光信号强度与双链与双链DNADNA的数量相关，的数量相关，可以根据荧光信可以根据荧光信号检测出号检测出PCRPCR体系存在的双链体系存在的双链DNADNA数量数量GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAExtension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTa
32、q353TaqTaq55RepeatBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllllSYBR Premix Ex TaqTM（2）12.5 lPCR Forward Primer（10 M）0.5 lPCR Reverse Primer（10 M）0.5 l模板2 ldH2O2（灭菌蒸馏水）9.5 l以检测以检测c-fosc-fos基因为例：基因为例：引物：引物：c-fos-forward 5-TGATACACTCCAAGCGGAGAC-3c-fos-reverse 5-CCCAGTCTGCTGCATAGAAGG-3GAPDH-forward 5-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3
33、GAPDH-reverse 5-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3循环参数：循环参数：95 10s 预变性，然后94 40s，60 40s，72 40s 共60个循环。c-fos real-time PCR 扩增曲线扩增曲线标准曲线标准曲线融解曲线融解曲线SYBR Green 1这种非特异性结合 dsDNA 的染料，也可能和反应中的引物二聚体非特异性结合，而释放荧光信号，会导致仪器检测的信号不仅仅是目的基因的，所以需要在反应结束后设定一个升温过程，然后慢慢把温度降下来，因为不同DNA片段的解链温度不同，这时若PCR产物纯，则只会出现一个荧光峰，因为只有一个温度值，若有杂质，则会出现其
34、他峰值，这是一个特异性检测方法。融解曲线融解曲线参数参数(dsDNA的解链温度的解链温度Tm值）值）：72-95,第一步持续时间为45s,接下来每步持续时间为5s。评价产物是否纯评价产物是否纯 在qPCR循环反应结束之后，系统会进行测定融解曲线，通常的方式就是从70度加热到90度，然后每隔一定时间（1s或者少于1s）测定系统荧光强度，随着温度的升高，dsDNA都解开双链，SYBR Green都游离之后不发荧光，荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线融解曲线融解曲线c-fos real-time PCR 随着温度上升，达到图中Tm点时，大部分扩增出来的双链DNA解开，荧光值下降非常快
35、。如果qPCR产物非常特异那么，融解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR产物长度以及GC含量相关）温度dR/dT荧光强度对温度求导评价产物特异性：评价产物特异性：使用融解曲线分析（使用融解曲线分析（Melt Curve AnalysisMelt Curve Analysis）评价引物对扩增效率：评价引物对扩增效率：将模板进行梯度稀释将模板进行梯度稀释进行绝对定量：进行绝对定量：使用扩增曲线和标准曲线使用扩增曲线和标准曲线l 使用方便使用方便 -不必设计复杂的不必设计复杂的荧光探针荧光探针 l 没有序列特异性没有序列特异性 -可以用于不同的模板可以用于不同的模板 l 便宜便宜 l
36、灵敏灵敏（四）SYBR Green I优点l与非特异性产物结合与非特异性产物结合l无法实现多个目的基因的检测无法实现多个目的基因的检测（五）SYBR Green I缺点TaqManTaqMan探针探针荧光素荧光素淬灭剂淬灭剂（六）TaqMan探针的工作原理TaqManTaqManl水解型、具有水解型、具有目标特异性目标特异性的的探针探针l 55为荧光素，为荧光素，3 3为淬灭剂为淬灭剂5 荧光素3淬灭剂与目标序列互补与目标序列互补5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and Sa
37、mpleDenaturation（变性）（变性）535353535353Annealing（退火）（退火）Reaction TubeTaql53RQProbe53RQTaqManTaqMan工作原理工作原理535353RQExtension Step531.Strand DisplacementTaq5533QTaqR52.Cleavage3.PolymerizationComplete53QTaqR354.Detection533QTaqR5lTaqManTaqMan工作原理工作原理R3Ql 对目标序列有很高的特异性对目标序列有很高的特异性 -特别适合于特别适合于SNPSNP检测检测l可以实
38、现可以实现多通道检测多通道检测 l设计设计相对简单相对简单（七）TaqManTaqMan探针优点探针优点 价格较高价格较高 只适合于一个特定的目标只适合于一个特定的目标 不能进行融解曲线分析不能进行融解曲线分析 背景高背景高（八）TaqManTaqMan探针缺点探针缺点（九）荧光探针设计遵循原则（九）荧光探针设计遵循原则探针长度应在探针长度应在20204040个碱基左右，保证结合特异性。个碱基左右，保证结合特异性。GCGC碱基含量在碱基含量在40%40%60%60%，避免单核苷酸序列的重复。，避免单核苷酸序列的重复。避免与引物发生杂交或重叠。避免与引物发生杂交或重叠。探针与模板结合稳定程度要大
39、于引物与模板结合的稳定探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的程度，因此探针的TmTm值（值（DNA DNA熔解温度）要比引物的熔解温度）要比引物的TmTm值至少高出值至少高出55。另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。引物的距离都对实验结果有影响。FQ-PCRFQ-PCR不仅具有普通不仅具有普通PCRPCR的的高灵敏性高灵敏性，而且由于荧，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCRPCR扩扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结
40、果，所以还具有增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNADNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常，克服了常规规PCRPCR的许多缺点。的许多缺点。FQ-PCRFQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要其后的过程完全是闭管操作，不需要PCRPCR后处理，避免后处理，避免了普通了普通PCRPCR操作中的诸多弊端。操作中的诸多弊端。五、实时荧光定量PCR的特点六、PCR技术应用 研究基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表
41、达图谱 法医犯罪现场标本分析 肿瘤各种肿瘤检测 其他 1 病原体测定由于由于PCRPCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，有微量病原体存在，PCRPCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规板定量显得特别重要。常规PCRPCR由于不能
42、定量而限制了其应用，然由于不能定量而限制了其应用，然而而PEPE公司研制的公司研制的FQ-PCRFQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。大肠杆菌等许多病原体的检测研究。MorrisMorris等用等用FQ-PCRFQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（者血清中丙肝病毒（HCVHCV）进行了研究）进行了研究。FQ-PCRFQ-PCR技术在保持
43、巢式技术在保持巢式PCRPCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCVHCV的的有效方法。同时，由于有效方法。同时，由于FQ-PCRFQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。给药物治疗及疗效观察提供参考依据。以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大量的量的PCRPCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国国WithamWitham等等19961996年将年将FQ-PCRFQ-
44、PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。异性。2.肿瘤研究意大利意大利GelminiGelmini等用等用FQ-PCRFQ-PCR技术检测乳腺癌标本技术检测乳腺癌标本c-erbB-2c-erbB-2基因拷基因拷贝数目变异情况。贝数目变异情况。他们以他们以-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在件，当扩增循环数在28283131之间时，之间时，
45、RQRQ与模板与模板DNADNA有着较好的剂有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB-2c-erbB-2基因和基因和-球蛋白基球蛋白基因，发现因，发现RQRQ都与各自的模板都与各自的模板DNADNA浓度存在着线性关系，虽然二者浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的斜率不同，但是各个实验浓度下二者的RQRQ之比却是恒定的。说之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。他们将实验数据明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。他们将实验数据与与SouthernSouthern印迹结果和已报告的竞争性印迹结果和已报
46、告的竞争性PCRPCR结果比较都显示高度相结果比较都显示高度相关性（关性（n=25n=25，r=0.94r=0.94，P P0.010.01）。）。3.基因表达研究由于由于TaqManTaqMan系统及荧光探针的应用，对系统及荧光探针的应用，对mRNAmRNA的检测显得较以前常的检测显得较以前常用的方法如用的方法如NorthernNorthern印迹、印迹、RT-PCRRT-PCR定量法要方便、快速、准确得定量法要方便、快速、准确得多。为了探测骨髓基质血小板生成因子（多。为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPOTPO）在巨核细胞生成过）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减
47、少性紫瘢程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（ITPITP）、再生障碍性贫血（）、再生障碍性贫血（AAAA）和特发性血小板多症（）和特发性血小板多症（ETET）等疾）等疾病过程中的病理生理意义，日本病过程中的病理生理意义，日本HirayamaHirayama等用等用TaqMan EZ RT-PCRTaqMan EZ RT-PCR试剂盒在试剂盒在ABI7700ABI7700反应系统测定了正常人和反应系统测定了正常人和ITPITP、AAAA、ETET病人的骨病人的骨髓基质细胞髓基质细胞TPO mRNATPO mRNA水平，又用水平，又用ELISAELISA方法测定了骨髓和末梢血的方
48、法测定了骨髓和末梢血的TPOTPO浓度。结果显示浓度。结果显示ITPITP和和AAAA病人病人TPO mRNATPO mRNA水平明显升高，而水平明显升高，而ETET病病人的人的TPO mRNATPO mRNA水平则正常，经类固醇治疗后水平则正常，经类固醇治疗后ITPITP病人病人TPO mRNATPO mRNA水水平下降；骨髓平下降；骨髓TPOTPO的浓度与其的浓度与其 mRNAmRNA水平有相关性；在正常人和水平有相关性；在正常人和ITPITP病人，病人，TPO mRNATPO mRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明对阐明TPO
49、TPO 的作用提供了依据。的作用提供了依据。4.免疫组份分析 对免疫T细胞群体V-组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。5.基因突变及多态性的研究美国美国IbrahimIbrahim等等19971997年用年用FQ-PCRFQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了技术对正常痘病毒多态性进行了研究研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素
50、基因的某一。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNADNA片段结片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNADNA疫苗的单核苷酸变异多态疫苗的单核苷酸变异多态的研究。的研究。6.其他方面 日本日本IsonoIsono利用利用FQ-PCRFQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因拷贝数
