1、SMART脂肪酶产生菌脂肪酶产生菌Aspergillus sp.G55基因工程基因工程菌构建及菌构建及筛选筛选SMART2第一部分第一部分 引言引言 脂肪酶脂肪酶又称甘油酯水解酶（又称甘油酯水解酶（lipases，EC 3.1.1.3）是一种生物代谢产物，可以催化脂肪水解）是一种生物代谢产物，可以催化脂肪水解为甘油和脂肪酸的酶。主要来源有：为甘油和脂肪酸的酶。主要来源有：动物动物、植物植物和微生物和微生物来源来源的脂肪酶的脂肪酶，而工业上更多的是而工业上更多的是通过通过微生物微生物发酵制备发酵制备脂肪酶脂肪酶，本项目所涉及菌种为黑曲霉菌种（本项目所涉及菌种为黑曲霉菌种（Aspergillus
2、niger.）Lets Start!图图1 脂肪酶结构脂肪酶结构 (a)M933601；(b)PLRP2脂肪酶定义及来源脂肪酶定义及来源食品饲食品饲料添加料添加FDA认定认定GRAS国标国标GB/T23535生物修复生物修复石油和化工行业石油和化工行业洗涤添加酶制剂洗涤添加酶制剂“芭格美芭格美”产品产品制革脱脂，造制革脱脂，造纸脱墨纸脱墨干预脂肪代谢干预脂肪代谢深圳市科技计划深圳市科技计划资助合同资助合同 深圳技师学院自深圳技师学院自20132013年年1111月年承担深圳市科技计划资助项目，项目编号：月年承担深圳市科技计划资助项目，项目编号：CXZZ20130425111508558CXZZ
3、20130425111508558，获获得政府无偿资助得政府无偿资助100100万万元元 本本项目以项目以产学研合作方式产学研合作方式，通过我通过我院与院与深圳市绿微康生物工程有限公司合作完成深圳市绿微康生物工程有限公司合作完成 本项目本项目为我院深圳技师工作站为我院深圳技师工作站(绿微康绿微康)项目项目SMART项目项目研究研究内容及内容及预期目标预期目标摘自深圳市战略新兴产业发展专项资金项目合同书主要研究内容主要研究内容：（1）采用分子生物学方法）采用分子生物学方法构建构建黑曲霉黑曲霉基因工程菌种基因工程菌种（2）应用微生物育种技术获得高产、）应用微生物育种技术获得高产、稳定新稳定新菌种菌
4、种（3）优化发酵工艺，提高菌种产酶活性）优化发酵工艺，提高菌种产酶活性（4）运用发酵）运用发酵过程控制过程控制技术技术，完成，完成中试中试试验试验（5）新菌种工业化放大）新菌种工业化放大及及推广应用推广应用考核考核项项技术指标技术指标（1）模型建立及工业育种建立选育模型建立高通量筛选模型基因工程改造菌种构建新的工程菌株1-3株常规选育得到1-3株优良菌种（2）摇瓶技术指标摇瓶产酶量 18%（3）发酵罐技术指标发酵罐体积100 L自控罐放罐体积 75%发酵周期48-52小时发酵批数连续3批发酵罐产酶量20%（比较对照菌）脂肪酶活性 2300 U/ml（4）脂肪酶耐温性能最适温度 50 （5）发表
5、论文和申报专利发表论文3篇 申报专利*1项（6）人才建设带2名学生*：深发改：深发改 20131450号号 附件附件1 序号序号39要求申请专利要求申请专利1项项7第第二二部分部分 研究结果研究结果SMART1.基因工程菌株的构建基因工程菌株的构建1.1重组重组Aspergillus niger T6菌株构建菌株构建华根霉脂肪酶基因华根霉脂肪酶基因RCL 为为模板模板，构建构建表达载表达载体体；通过通过根根癌农癌农杆菌杆菌介导介导转化转化黑曲霉菌，黑曲霉菌，得得到黑到黑曲霉转化子曲霉转化子 以华根霉脂肪酶基因RCL 为模板，利用引物Pgpd-F/Pgpd-R扩增Pgpd；片段经Sal I/Pm
6、e I消化克隆至pCHAMBIA2302位点。以质粒pAN7-1为模板，以TtrpC-F/TtrpC-R为引物扩增；以pMD18-T:RCL为模板，以RCL-F/RCL-R为引物扩增RCL；然后以RCL-F/TtrpC-R为引物，利用重叠延伸PCR，构建出RCL-TtrpC；消化后克隆至pCHAMBIA2302；构建pCHAMBIA2302:Pgpd-RCL-TtrpC质粒质粒 黑曲霉受体菌株为CICC 2475，利用冻融法将表达载体转化根癌农杆菌EHA105，介导并转化黑曲霉菌，得到T6菌株酶活性71 U/mL 图图1 RCL超表达载体的构建超表达载体的构建图图2 黑曲霉转化子鉴定黑曲霉转化
7、子鉴定菌号菌号诱变方法诱变方法酶活性（酶活性（s，n=9）/U/mL变异系数变异系数（Cv）/%比较比较/%13-2-41（s）UV1655 113.26.845.413-5-349（s）NTG1624 131.78.113.413-18-46S2137 87.34.0936.114-1-3HeV2024 75.23.7228.914-2-783(s)UV+NTG2119 140.76.6434.914-13-57UV2250 96.84.3043.314-5-11S2387 76.33.2052.0G577S2417 51.02.1153.9G55（s）起始菌株1570 63.44.04-表
8、表1 G55菌株诱变选育结果菌株诱变选育结果2.高产脂肪酶高产脂肪酶菌株筛选菌株筛选研究研究2.1菌株选育研究菌株选育研究以以G55为出发菌种进行为出发菌种进行选育，得到两株选育，得到两株高产菌株高产菌株14-5-11和和G577，菌株产酶活，菌株产酶活性和遗传稳定性都显著提高性和遗传稳定性都显著提高 针对于Aspergillus niger G55菌株，运用微生物诱变筛选的等经过诱变，使菌株发生变异，菌落形态显著变小，发酵液颜色趋向浅黄色SMART3.高产脂肪酶高产脂肪酶菌株菌株摇瓶摇瓶发酵工艺研究发酵工艺研究3.1菌株摇瓶发酵培养基研究菌株摇瓶发酵培养基研究主要考察了碳源主要考察了碳源成分
9、、氮源成分、油脂和无成分、氮源成分、油脂和无机盐等影响脂肪酶发酵的主要因素，并采用机盐等影响脂肪酶发酵的主要因素，并采用RSM之之BBD方法方法优化优化3.2菌株摇瓶发酵菌株摇瓶发酵培养培养条件条件研究研究主要考察了接种量、摇瓶装量、发酵培养温主要考察了接种量、摇瓶装量、发酵培养温度和发酵培养时间等，并采用度和发酵培养时间等，并采用RSM之之BBD方法方法优化优化采用采用Design-Expert软件的软件的Box-Behnken Design(BBD)模型拟合和数模型拟合和数据分析，进行据分析，进行3因素因素3水平共水平共17组的试验设计组的试验设计，通过试验数据拟合通过试验数据拟合响应面模
10、型，响应面模型，通过通过ANOVA分析分析得到二次多项式得到二次多项式Ycoded=2071.8+97.00A+114.25B+76.50C-103.75AB-43.25AC+16.25BC-A2-227.03B2-76.02C2采用采用BBD模型，得到模型，得到4因素因素3水平共水平共29组的试验设计。试验得到的数组的试验设计。试验得到的数据在据在，对数据进行拟合和分析，通过，对数据进行拟合和分析，通过ANOVA分析得到二次多项式分析得到二次多项式Ycoded=2085.8+70.67 A+33.75 B+63.92 C+83.33 D-43.25 AB+10.5 AC-77.25 AD-5
11、4.75BC-19.75 BD-54.5 CD-100.15 A2-26.53 B2-75.02 C2-77.9 D2培养基优化培养基优化培养条件优化培养条件优化培养基培养基脂肪酶活性（脂肪酶活性（s s）/U/mL/U/mL 1 12 23 3平均值平均值RSM2174 462161 542177 392171 41（+16.4%）*基础1863 271835 301896 621865 45 表表3 验证性试验验证性试验结果结果*：t-test检验差异显著；P 0.01培养条件培养条件脂肪酶活性（脂肪酶活性（s s）/U/mL /U/mL 1 12 23 3平均值平均值RSM2160 28
12、.32116 40.02112 42.82129 39.9（+16.7%）*基础1842 62.01844 24.71788 22.31828 44.8 表表4 验证性试验结果验证性试验结果*：t-test检验差异显著；P 0.01图图3 因素因素交互作用对于脂肪酶活性的响应面交互作用对于脂肪酶活性的响应面分析分析图图4 因素因素交互作用对于脂肪酶活性的响应面交互作用对于脂肪酶活性的响应面分析分析SMART4.新菌种新菌种500 L发酵罐发酵罐中试中试研究研究4.1发酵罐发酵罐技术参数技术参数本研究在深圳绿微本研究在深圳绿微康中试车间（深圳市康中试车间（深圳市南山南山区高新南一道区高新南一道0
13、09号中科研发园孵化楼号中科研发园孵化楼1楼楼）500 L发酵罐实施发酵罐实施 公称容积：500 L 筒体直径 筒体高度：600 1650 材料：磨光罐体 材质：SUS316L 采用电抛光 搅拌：驱动 DC 电机/AC齿轮电机 顶部驱动（机械密封）电机功率：1.5 KW 搅拌转速：280 1000 RPM 压力控制：自动控制背压 控制单元：控制板 15 英寸的彩色LCD 控制面板：Bioradar可以实现数据收集和功能再现 电源：220V 50/60 Hz 单相 数据储存：pH，DO，压力，温度和转速图图5 500 5 500 L L发酵罐发酵罐冷冻管冷冻管斜面种子斜面种子种子瓶种子瓶500
14、L发酵罐发酵罐发酵液发酵液30，3 d30，32 h静置培静置培养养220 RPM0.5%接种量接种量500 RPM30，60 h图图6 6 脂肪酶脂肪酶发酵过程示意图发酵过程示意图SMART4.2菌株发酵中试研究菌株发酵中试研究结果结果采用长周期采用长周期，大体积待放新工艺，显著提高了发酵指数，降，大体积待放新工艺，显著提高了发酵指数，降低发酵成本低发酵成本 菌株号菌株号N N发酵周期发酵周期/h/h发酵液体积发酵液体积/L/L酶活性酶活性（s s）/U/mL/U/mL总酶活量总酶活量/M U/M U发酵发酵指数指数 */M U/h.m/M U/h.m3 3G577（s）5524302421
15、 61.41154.1844.39G577（s)352433+90（待待放放18%）2450 57.4 1249.5648.0613-5-213524301794 148.8750.9128.88比较比较/%-+34.9+35.5+53.7+66.4+53.7+66.4表表5 5 不同不同菌株中试菌株中试对比分析对比分析图图6 13-5-216 13-5-21菌株发酵菌株发酵代谢曲线代谢曲线图图7 7 G577G577（s s）菌株发酵代谢）菌株发酵代谢曲线曲线根据根据合同合同技术技术考核考核指标指标3.发酵罐技术指标发酵罐技术指标之中之中试指标要求试指标要求，总酶活比对照提高总酶活比对照提高
16、66.4%，脂肪酶，脂肪酶活性为活性为2450 U/mL，发酵指数为，发酵指数为48.06 MU/h.m3，完成完成了该项技术指标并有了该项技术指标并有超额和超额和增项完成增项完成指标指标*：发酵指数=酶活性发酵液体积/（发酵周期发酵罐体积）SMART5.新菌种新菌种20T发酵罐发酵工艺研究发酵罐发酵工艺研究（增项指标）增项指标）5.1发酵罐发酵罐技术参数技术参数在宁夏乙征生物工程有限公司发酵车间在宁夏乙征生物工程有限公司发酵车间20T发发酵罐酵罐实施实施 公称容积：20 T 筒体直径 筒体高度：2200 5700 材料：磨光罐体 材质：SUS316L 采用电抛光 搅拌：驱动 DC 电机/AC
17、齿轮电机 顶部驱动（机械密封）电机功率：30 KW 通风：底部气体分布器 环型气体分布器 压力控制：自动控制背压 电源：220V 50/60 Hz 单相 数据储存：pH，DO，压力，温度和转速图图8 20T8 20T发酵罐系列发酵罐系列SMART155.2菌株发酵菌株发酵工业放大工业放大研究结果研究结果罐批数罐批数发酵周期发酵周期/h发酵液发酵液体积体积/m3酶活性酶活性/U/mL待放体积待放体积/m3待放酶活待放酶活/U/mL总酶活总酶活量量/M U发酵指数发酵指数/M U/h.m33654.616.12244 163.0-4415339.956*56.016.32318 59.44.821
18、004790342.77352.616.62353 66.3003907037.09比较比较/%+6.8（3.4 h）-1.8-1.4-+22.6+15.3表表6 G201s6 G201s菌株菌株20 T20 T发酵罐上罐结果发酵罐上罐结果分析分析结果表明：结果表明：根据根据合同合同技术考核指标技术考核指标7.工业放大指标工业放大指标，脂肪脂肪酶活性酶活性2318 U/mL，发酵，发酵指数指数42.77 MU/h.m3，为为项目新增指标，完成了该项技术项目新增指标，完成了该项技术指标指标G201s菌株在菌株在20吨吨发酵罐试验发酵罐试验41批次，扣除染菌罐和异常罐批批次，扣除染菌罐和异常罐批5
19、批，有效罐批批，有效罐批36批批*：新菌种：新菌种 +待放待放16第第三三部分部分 项目评价项目评价SMART考核考核项项技术指标技术指标对标结果对标结果（7 7）工业放大指标（增项）工业放大指标（增项）不要求不要求发酵罐体积发酵罐体积 20 T20 T自控罐自控罐 放罐体积放罐体积 81.5%+81.5%+待放体积待放体积24%24%发酵周期发酵周期 5656小时小时发酵批数发酵批数 连续连续6 6批批脂肪酶活性脂肪酶活性 2318 U/mL 2318 U/mL 发酵指数发酵指数 42.77 MU/h.m42.77 MU/h.m3 3（8 8）经济效益（增项）经济效益（增项）不要求不要求 工
20、业产值工业产值 397.19397.19万元万元 净利润净利润 114.51114.51万元万元 利税额利税额 203.09203.09万元万元 表表7 7 项目项目技术指标与实际完成情况对技术指标与实际完成情况对标标 摘自摘自项目验收报告项目验收报告考核考核项项技术指标技术指标对标结果对标结果（1 1）模型建立及工业育种）模型建立及工业育种建立选育模型建立选育模型建立高通量筛选模型建立高通量筛选模型完成完成基因工程改造菌种基因工程改造菌种构建新的工程菌株构建新的工程菌株1-31-3株株得到得到1 1株株常规选育常规选育得到得到1-31-3株优良菌种株优良菌种得到得到2 2株株（2 2）摇瓶技
21、术指标）摇瓶技术指标摇瓶产酶量摇瓶产酶量 18%18%50%50%（3 3）发酵罐技术指标）发酵罐技术指标 发酵罐体积发酵罐体积100L100L自控罐自控罐500 L500 L自控罐自控罐放罐体积放罐体积75%75%86.0%+86.0%+待放体积待放体积18%18%发酵周期发酵周期48-5248-52小时小时5252小时小时发酵批数发酵批数连续连续3 3批批连续连续3 3批批发酵罐产酶量发酵罐产酶量20%20%（比较对照菌）（比较对照菌）+66.4%+66.4%脂肪酶活性脂肪酶活性2300U/ml2300U/ml2450 U/mL2450 U/mL发酵指数（增项）发酵指数（增项）不要求不要求
22、48.06 M U/h.m48.06 M U/h.m3 3（+66.4%+66.4%）（4 4）脂肪酶耐温性能）脂肪酶耐温性能最适温度最适温度 50 50 50 50 （5 5）发表论文和申报）发表论文和申报专利专利发表论文发表论文3 3篇篇 发表论文发表论文4 4篇篇 申报专利申报专利1 1项项 申请发明专利申请发明专利1 1项项 获得实用新型专利获得实用新型专利1 1项项 （6 6）人才建设）人才建设带带2 2名学生名学生 完成完成表表8 8 项目技术项目技术指标指标新增项新增项对对标标 1.1.项目项目技术指标对技术指标对标标SMART.发表发表研究论文研究论文5篇篇，中文核心期刊，中文
23、核心期刊4篇，篇，SCI论文论文1篇。篇。申请发明专利申请发明专利1项，获得实用项，获得实用新型专利新型专利1项项张张谦谦,王剑英王剑英,林智林智,等等.生物技术通报生物技术通报,2015,31(3):165-170(核心期刊核心期刊)张谦张谦,贾佳贾佳,林智林智,等等.中国中国饲料饲料,2014,16:28-32(核心期刊核心期刊)张谦张谦,贾佳贾佳,林智林智,等等.生物技术生物技术通报通报,2015,31(12):227-233(核核心期刊心期刊)贾佳贾佳,林智林智,曾慧曾慧,等等.中国中国饲料饲料,2016 8:9-12,5(核心期刊核心期刊)Jia Jia,Xiaofeng Yang,
24、et al.BioMed Research International,Volume 2015,1-8（SCI：1.579）发明专利发明专利 20140276599.1（实质审查中）（实质审查中）实用新型专利实用新型专利 ZL 201520339973.8（已经授权）（已经授权）2 2.发表发表论文、专利论文、专利SMART 3.3.脂肪酶脂肪酶新新菌种产业化效益菌种产业化效益分析分析新菌种在自新菌种在自2014年年9月在宁夏乙征公司的月在宁夏乙征公司的20吨发吨发酵罐实施工业放大。酵罐实施工业放大。有效有效罐批罐批36批，生产脂肪酶批，生产脂肪酶8.97吨（折纯酶），吨（折纯酶），实现实现产
25、值产值397.19万元，净利万元，净利润润114.51万元，利税万元，利税203.09万万元元三、合同中各项财务经济指标的执行情况三、合同中各项财务经济指标的执行情况 项目项目于于2013年年11月在深圳技师学院单位实施月在深圳技师学院单位实施。该该项目研发成果主要用于深圳市绿微康生物工程项目研发成果主要用于深圳市绿微康生物工程有限公司的脂肪酶工业化菌株改造，目标产品为有限公司的脂肪酶工业化菌株改造，目标产品为工业用脂肪酶生产，产品于工业用脂肪酶生产，产品于2014年年9月新菌种进行月新菌种进行推广应用并形成销售推广应用并形成销售 摘自摘自审计审计报告报告 深中深中瑞华正专审字瑞华正专审字20
26、16第第048号号表表9 9 脂肪酶新种工业放大效益脂肪酶新种工业放大效益分析分析SMART 4.4.深圳技师工作站深圳技师工作站深圳技师工作站（绿深圳技师工作站（绿微康站）课题：微康站）课题：（1）产脂肪酶发酵液）产脂肪酶发酵液成分分析及酶活性成分分析及酶活性检测检测（2）复）复合酶中脂肪酶合酶中脂肪酶定量分析定量分析（3）产脂肪酶黑曲霉高产菌种特性研究）产脂肪酶黑曲霉高产菌种特性研究（4）产脂肪酶黑曲霉原生质体制备研究）产脂肪酶黑曲霉原生质体制备研究（5）产脂肪酶黑曲霉）产脂肪酶黑曲霉500L罐发酵工艺研究罐发酵工艺研究 经过经过与深圳市科技计划资助项目中所列的技术指标项与深圳市科技计划资
27、助项目中所列的技术指标项进行认真的、全面的对标，所列进行认真的、全面的对标，所列6项指标全部完成，部分指项指标全部完成，部分指标超额完成标超额完成。经过。经过查查新：新：项目的菌种、发酵指数水平和产项目的菌种、发酵指数水平和产业化水平等都具有业化水平等都具有先进性先进性 摘自摘自项目验收报告项目验收报告项目实施过程中曾经得到项目实施过程中曾经得到上海交通大学上海交通大学 生命科学技术生命科学技术学院学院唐克轩唐克轩教授、张田教授、张田博士构建博士构建黑黑曲霉曲霉脂肪脂肪酶工程菌株方面酶工程菌株方面给予帮助给予帮助和和支持！支持！宁夏乙征生物工程公司宁夏乙征生物工程公司陈龙总经理陈龙总经理、牛世
28、峰、牛世峰副总经理等副总经理等在项目中试过程给予在项目中试过程给予的帮助的帮助和和支持！支持！香港城市大学香港城市大学 能源与环境能源与环境学院学院 Carol Sze Ki Lin 教授教授杨晓锋博士数据处理杨晓锋博士数据处理、论文、论文撰写的帮助撰写的帮助和和支持！支持！深圳绿微康生物工程有限公司真诚合作及帮助深圳绿微康生物工程有限公司真诚合作及帮助深圳技师学院孔宁院长助理深圳技师学院孔宁院长助理、王晓沛、王晓沛处长处长、文平文平副处长、刘凯新老师副处长、刘凯新老师、邱晓静、邱晓静老师老师、宋淑珍老师、宋淑珍老师、曾艳、曾艳老师等帮助老师等帮助和和支持！支持！项目项目负责人负责人致谢！致谢！End
