1、生化教研室生化教研室 肖建英肖建英第一节第一节 核酸是遗传物质核酸是遗传物质第二节第二节 核酸的结构核酸的结构第三节第三节 核酸的功能核酸的功能第四节第四节 核酸的变性、复性和杂交核酸的变性、复性和杂交第五节第五节 病毒核酸病毒核酸第六节第六节 反义核酸反义核酸 第一节第一节 核酸是遗传物质核酸是遗传物质一、核酸的种类和分布一、核酸的种类和分布核酸（核酸（nucleic acid）脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸（deoxyribonucleic acid）（ribonucleic acid）1868年年核素核素核酸的分类及分布核酸的分类及分布 90%90%以上分布于细胞核，其余分布
2、于以上分布于细胞核，其余分布于核外核外如线粒体，叶绿体，质粒等。如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid,DNA)(ribonucleic acid,RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型体的基因型(genotype)。参与细胞内参与细胞内DNA遗传信息的表遗传信息的表达。某些病毒达。某些病毒RNA也可作为遗也可作为遗传信息的载体。传信息的载体。（一）遗传信息储存在（一）遗传信息储存在DNA的一级结构中的一级结构中1、“转化转化”现象的发现：现象的发现：1
3、928年，英国医生发现非致病的年，英国医生发现非致病的R型肺炎型肺炎球菌可以转变为致病的球菌可以转变为致病的S型肺炎球菌。型肺炎球菌。1931年，年，Dawson、Sia、Alloway在体外重在体外重复了这个转化实验。复了这个转化实验。二、核酸是遗传物质二、核酸是遗传物质19世纪中叶世纪中叶20世纪初，认为遗传物质是蛋白质。世纪初，认为遗传物质是蛋白质。2、“转化因子转化因子”的化学本质：的化学本质：1944年，年，Avery等发表他们历经等发表他们历经10年的年的研究结果，研究结果，DNA就是将就是将S型肺炎球菌的型肺炎球菌的致病性转移给致病性转移给R型肺炎球菌的化学物质型肺炎球菌的化学物
4、质u DNADNA是细菌的遗传物质是细菌的遗传物质。结论依据：结论依据：这种化学物质符合这种化学物质符合DNA的性质；的性质；这种物质的光学特性、电泳特性及超速离心均符这种物质的光学特性、电泳特性及超速离心均符 合合DNA的特征。的特征。将蛋白质和磷脂去除不影响转化作用。将蛋白质和磷脂去除不影响转化作用。用胰蛋白酶和糜蛋白酶处理不影响转化作用。用胰蛋白酶和糜蛋白酶处理不影响转化作用。用用RNA酶处理也不影响转化作用。酶处理也不影响转化作用。用未被加热的血清处理则丧失转化能力，而已知用未被加热的血清处理则丧失转化能力，而已知血清中含有能降解血清中含有能降解DNA的酶。的酶。uDNADNA是病毒的
5、遗传物质是病毒的遗传物质噬菌体感染试验证明噬菌体感染试验证明DNA是病毒的遗传物质。是病毒的遗传物质。uDNADNA是动物细胞的遗传物质是动物细胞的遗传物质外加外加DNA转染的结果使真核细胞获得新的表型。转染的结果使真核细胞获得新的表型。第二节第二节 核酸的结构核酸的结构（Structure of Nucleic Acid）一、一、DNA的结构的结构核酸中核苷酸的排列顺序即称核酸中核苷酸的排列顺序即称碱基序列碱基序列。（一）一）DNA的一级结构的一级结构核酸的组成核酸的组成分子分子 分子组成分子组成 碱基碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱：嘌呤碱，嘧啶碱 戊糖戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖
6、：核糖，脱氧核糖 磷酸磷酸(phosphate)碱基碱基戊糖戊糖 磷酸磷酸核酸酶核酸核酸DNARNA核苷酸核苷酸(ribonucleoside)嘌呤嘌呤(purine)NNN HN123456789NNNHNNH2腺嘌呤腺嘌呤(adenine,A)NNHNHNNH2O鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,G)1、碱、碱 基基(base)NNH132456嘧啶嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine,C)NNHNH2O尿嘧啶尿嘧啶(uracil,U)NHNHOO胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine,T)NHNHOOCH32.2.戊戊 糖糖(ribose)：（构成（构成RNA）1 2 3 4
7、 5 OHOCH2OHOHOH核糖核糖(ribose)（构成（构成DNA）OHOCH2OHOH脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)POOOHOHOCH2OHOHNNNH2OOHOCH2OHOHNNNH2O核苷酸核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧脱氧核苷酸：核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP 3.核苷酸核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名的结构与命名核苷（脱氧核苷）和磷酸以核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。55端端3端端CGA4 4、核苷酸的连接核苷酸的连接 核苷酸之间以核苷酸之间以磷酸二酯
8、键磷酸二酯键连接形连接形成多核苷酸链，即成多核苷酸链，即核酸。核酸。A G P5 P T PG PC PT P OH 3 书写方法书写方法5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 （二）（二）DNA的一级结构与种属的差异的一级结构与种属的差异u DNA一级结构的不同是物种差异的根本原因。一级结构的不同是物种差异的根本原因。1、基因组的概念：基因组的概念：一个细胞中的全部一个细胞中的全部DNA或一个物种的单倍体染色体中的全部或一个物种的单倍体染色体中的全部DNA，称为该物种的基因组称为该物种的基因组(genome)。2、C值的概念：值的概念：一个单倍体基因组的一个单
9、倍体基因组的DNA含量总是恒定的，它通常称为该物种含量总是恒定的，它通常称为该物种DNA的的C值值(C value)。u 随着生物的进化，生物体的结构随着生物的进化，生物体的结构与功能越来越复杂，需要的基因产与功能越来越复杂，需要的基因产物种类也越来越多，即物种类也越来越多，即C值就越大。值就越大。3、C值矛盾：值矛盾：在真核生物中，物种进化的在真核生物中，物种进化的复杂程度与复杂程度与DNA含量含量C值并不完全一致，值并不完全一致，称之为称之为C值矛盾值矛盾(C value paradox)。（三）（三）DNA的二级结构的二级结构 双螺旋模型双螺旋模型u DNA的二级结构是的二级结构是指两条
10、脱氧多核苷酸链指两条脱氧多核苷酸链反向平行盘绕所形成的反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。双螺旋结构。1、DNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）uDNADNA分子由两条分子由两条反向平行的反向平行的右手双螺旋右手双螺旋的脱氧多核苷酸的脱氧多核苷酸链组成，两链以链组成，两链以-脱氧核糖脱氧核糖-磷酸磷酸-为骨架排列在外侧，为骨架排列在外侧，绕同一公共轴盘旋。螺旋直绕同一公共轴盘旋。螺旋直径为径为2nm2nm，形成，形成了相间的了相间的大大沟沟(major groove)(major groove)及小沟及小沟(minor groove)。DNA双螺旋结构模型
11、要点双螺旋结构模型要点 （Watson,Crick,1953）u碱基垂直螺旋轴居双螺旋内碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成側，与对側碱基形成氢键氢键互互补补配对配对（A=T;G C）。u相邻碱基平面距离相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距螺旋一圈螺距3.4nm，一圈，一圈10对碱基。对碱基。DNA双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点 （Watson,Crick,1953）u氢键氢键维持双链维持双链横向稳定性横向稳定性.u碱基堆积力碱基堆积力维持双链维持双链纵向纵向稳定性稳定性。对双螺旋的稳定。对双螺旋的稳定由为重要由为重要.2、DNA双螺旋结构的多样性双螺旋结构的多样性v DNA
12、双螺旋结构不同构型的意义：双螺旋结构不同构型的意义：由于双螺旋结构的不同构型，引起螺旋表面由于双螺旋结构的不同构型，引起螺旋表面结构的改变，进而影响其生物学功能。如：结构的改变，进而影响其生物学功能。如：B型型DNA表面有大沟和小沟；表面有大沟和小沟；A型型DNA也有两个沟；也有两个沟；Z型型DNA仅有一个很深很窄的沟。仅有一个很深很窄的沟。DNA双螺旋的这种表面结构有助于双螺旋的这种表面结构有助于DNA结合结合 蛋白识别并结合特定的蛋白识别并结合特定的DNA序列。序列。而这种表面构型的变化对于基因组而这种表面构型的变化对于基因组DNA与其与其DNA结合蛋白的特异性相互作用具有重要的意义。结合
13、蛋白的特异性相互作用具有重要的意义。（四）（四）DNA的三级结构的三级结构u DNA的三级结构是指的三级结构是指DNA中单链与双链、中单链与双链、双链之间的相互作用形成的双链之间的相互作用形成的三链或四链结构三链或四链结构。u 三股螺旋三股螺旋DNA即三链即三链DNA：（triple strand DNA，tsDNA）三条链均为同型嘌呤三条链均为同型嘌呤(Hpu)或同型嘧啶或同型嘧啶(Hpy)，即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶。即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶。u 两种基本类型两种基本类型四种同分异构体：四种同分异构体：嘌呤嘌呤-嘌呤嘌呤-嘧啶型（嘧啶型（Pu-Pu-Py型）型）即即：AAT；GG C 嘧
14、啶嘧啶-嘌呤嘌呤-嘧啶型（嘧啶型（Py-Pu-Py型）型）即：即：TAT；C G C（五）（五）DNA的的拓扑拓扑结构结构DNA的的拓扑拓扑结构结构超螺旋结构超螺旋结构(superhelix 或或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。主要指主要指正超螺旋正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方同相同双螺旋方同相同 负超螺旋负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与盘绕方向与DNA双螺旋方向相反双螺旋方向相反 超螺旋超螺旋DNA比松弛型比松弛型DNA更紧密，使更紧密，使DNA分子分子体积
15、变得更小，对其在细胞的包装过程更为有利。体积变得更小，对其在细胞的包装过程更为有利。人每条染色体的平均长度约人每条染色体的平均长度约5cm5cm，而细胞核的，而细胞核的直径仅约直径仅约5 5m m，所以，所以DNADNA分子压缩近万倍。分子压缩近万倍。超螺旋能影响双螺旋的解链程序，因而影响超螺旋能影响双螺旋的解链程序，因而影响DNA分子与其它分子（如酶、蛋白质）之间的相互作用。分子与其它分子（如酶、蛋白质）之间的相互作用。对基因表达的调控有重要意义。对基因表达的调控有重要意义。u 超螺旋结构的生物学意义：超螺旋结构的生物学意义：l DNA拓扑异构体的相互转化由拓扑异构体的相互转化由拓扑异构酶拓
16、扑异构酶（型和型和型）催化完成。型）催化完成。（六）（六）DNA的四级结构的四级结构真核生物中核酸与蛋白质相互作用真核生物中核酸与蛋白质相互作用形成的核糖体、剪接体，即可看成核酸形成的核糖体、剪接体，即可看成核酸的四级结构。的四级结构。另外另外DNADNA缠绕组蛋白构成核小体。缠绕组蛋白构成核小体。二、二、RNA的结构的结构 （Structure of RNA）RNA的种类、分布、功能的种类、分布、功能核蛋白体核蛋白体RNA信使信使RNA转运转运RNA核内不均一核内不均一RNA核内小核内小RNA胞浆小胞浆小RNA 细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能rRNAmRNA mt rRNAtR
17、NAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白体组分核蛋白体组分蛋白质合成模板蛋白质合成模板转运氨基酸转运氨基酸成熟成熟mRNA的前体的前体参与参与hnRNA的剪接、转运的剪接、转运rRNA的加工、修饰的加工、修饰蛋白质内质网定位合成蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分的信号识别体的组分核仁小核仁小RNA核蛋白体核蛋白体RNA信使信使RNA转运转运RNA核内不均一核内不均一RNA核内小核内小RNA胞浆小胞浆小RNA 细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASn
18、RNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核蛋白体组分核蛋白体组分蛋白质合成模板蛋白质合成模板转运氨基酸转运氨基酸成熟成熟mRNA的前体的前体参与参与hnRNA的剪接、转运的剪接、转运rRNA的加工、修饰的加工、修饰蛋白质内质网定位合成蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分的信号识别体的组分核仁小核仁小RNARNA单链结构单链结构环状结构（环状结构（loop）局部双螺旋结构局部双螺旋结构三级结构三级结构折叠折叠分子伴侣分子伴侣 生物活性分子生物活性分子具有催化活性的具有催化活性的RNA称为称为核酶。核酶。1、DNA的基本功能：的基本功能：是以是以基因基因的形式荷载遗传信息，并作为基的形式荷
19、载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。基础，也是个体生命活动的信息基础。第三节第三节 核酸的功能核酸的功能一、一、DNA的功能及基因治疗的功能及基因治疗v 基因的分子定义：基因的分子定义：基因就是贮存基因就是贮存RNA序列信息及表达这些序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。信息所必需的全部核苷酸序列。v 大多数生物的大多数生物的遗传信息以特定的核苷酸遗传信息以特定的核苷酸 排列顺序储存在排列顺序储存在DNA分子中。分子中。u DNA分子携带两类遗传信息：分子携带两类遗传信息：编码信息：编码编码信
20、息：编码RNA（mRNA、tRNA、rRNA）或蛋白质的遗传信息，为有功能活性）或蛋白质的遗传信息，为有功能活性的的DNA序列所携带。序列所携带。调控信息，是一些特定的调控信息，是一些特定的DNA区段。决定区段。决定有关基因选择性表达的信息。有关基因选择性表达的信息。2、基因治疗：、基因治疗：定义：定义：早期早期是指用正常的基因整合入细胞是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。治疗方法。目前目前广义上来讲是指将某种遗传物广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾
21、病目的的方法。作用，以达到治疗疾病目的的方法。u 基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序治疗性基因的选择和制备治疗性基因的选择和制备基因载体的选择基因载体的选择靶细胞的选择靶细胞的选择基因导入方式选择基因导入方式选择外源基因表达的筛选外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因利用在体中的标记基因病毒载体（逆转录病毒、腺病毒）病毒载体（逆转录病毒、腺病毒）非病毒载体（脂非病毒载体（脂质质体、直接注射等）体、直接注射等）体细胞（造血体细胞（造血c c、肝、肝c c、淋巴、淋巴c c等）等）生殖细胞（国际上严禁使用）生殖细胞（国际上严禁使用）间接体内疗法（回输法）间接体内疗法（回输法）体外途径体外途径直
22、接体内疗法直接体内疗法体内途径体内途径u 基因治疗的主要策略基因治疗的主要策略基因矫正基因矫正 (gene correction)基因置换基因置换 (gene replacement)基因增补基因增补 (gene augmentation)基因失活基因失活 (gene inactivation)反义核酸技术反义核酸技术核酶技术核酶技术三链技术三链技术RNA干扰干扰技术技术u 基因失活技术基因失活技术 肿瘤的基因治疗（肿瘤的基因治疗（61%61%病例病例）感染性疾病的基因治疗感染性疾病的基因治疗 艾滋病（艾滋病（24%24%病例病例）乙型肝炎乙型肝炎 遗传病的基因治疗遗传病的基因治疗 心血管疾病
23、的基因治疗心血管疾病的基因治疗 神经系统疾病的基因治疗神经系统疾病的基因治疗l 全球临床方案数达全球临床方案数达300多项，病例数超过多项，病例数超过 3500人，其中人，其中美国病例占美国病例占80%。二、二、RNA的功能的功能hnRNA mRNA （一）（一）hnRNA和和mRNA的功能的功能内含子内含子(intron)外显外显子子(exon)断裂基因断裂基因 (DNA)u mRNA的功能的功能 把把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则抄录对原则抄录下来下来，以，以三联体密码的形式三联体密码的形式决定蛋决定蛋白质的氨基酸排列顺序。白质的氨基酸排列顺序。D
24、NAmRNA蛋白蛋白转录转录翻译翻译原核细胞原核细胞 细胞质细胞质细胞核细胞核DNA内含子内含子外显子外显子转录转录转录后剪接转录后剪接转运转运mRNAhnRNA翻译翻译蛋白蛋白真核细胞真核细胞 u tRNA的一级结构特点：的一级结构特点：1.含有稀有碱基，如含有稀有碱基，如 DHU 甲基化嘌呤甲基化嘌呤 假尿假尿嘧啶嘧啶2.含有茎环结构含有茎环结构3 末端为末端为 CCA-OH4.tRNA序列中有反密码子序列中有反密码子（二）（二）tRNA的功能的功能u tRNA的二级结构的二级结构三叶草形三叶草形氨基酸臂氨基酸臂DHU环环反密码环反密码环额外环额外环TC环环氨基酸氨基酸臂臂额外环额外环u
25、tRNA的三级结构的三级结构 倒倒L形形u tRNA tRNA的功能：的功能：2.2.活化氨基酸；活化氨基酸；1.1.搬运氨基酸；搬运氨基酸；3.3.在在密码子密码子与对应与对应氨基酸氨基酸之间起接合体之间起接合体 (adaptoradaptor)的作用。的作用。如：如：密码子密码子GGUGGU-携带反密码子携带反密码子ACCACC的的tRNA-tRNA-GlyGly密码子密码子tRNAtRNA反密码子反密码子氨基酸是对号入座的。氨基酸是对号入座的。u rRNA的结构的结构（三）（三）rRNA的功能的功能u rRNA的功能的功能：参与组成核蛋白参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物体，作为蛋白质生物
26、合成的场所。合成的场所。u rRNA的种类的种类（根据沉降系数）（根据沉降系数）真核生物真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA原核生物原核生物16S21种种 23S 5S31种种真核生物真核生物49种种28S 5.85S 5S18S33种种rRNA蛋白质蛋白质小亚基小亚基大亚基大亚基 (50S)(30S)(40S)(60S)小亚基小亚基大亚基大亚基（四（四）其他小分子）其他小分子RNA除了上述三种除了上述三种RNA外，细胞的不同部位外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子存在的许多其他种类的小分
27、子RNA，统称为，统称为非非mRNA小小RNA(small non-messenger RNAs,snmRNAs)。u snmRNAs:u snmRNAs的种类的种类:核内小核内小RNA(small nuclear RNA,snRNA)核仁小核仁小RNARNARNA(small nucleolar RNA,snoRNA)胞质小胞质小RNA RNA(small cytoplasmic RNA,scRNA)催化性小催化性小RNA RNA(small catalytic RNA)小片段干涉小片段干涉 RNARNA (small interfering RNA,siRNA)起始起始RNARNA (in
28、itiator RNA，iRNA)微小微小RNA（micro RNA,miRNA）u snmRNAs的功能：的功能：U系列系列snRNA与蛋白质结合构成与蛋白质结合构成snRNP，参与参与hnRNA和和rRNA的加工和转运。的加工和转运。如如U1、U2、U3、U4、U5、U6等。等。多种多样多种多样 siRNA和和miRNA参与某些基因表达调控。参与某些基因表达调控。iRNA作为作为DNA合成的引物。合成的引物。（五）端粒酶（五）端粒酶RNARNA与核酶与核酶1、端粒、端粒（telomere）：）：是真核生物染色体末端的是真核生物染色体末端的一种特殊结构一种特殊结构 由端粒由端粒DNA和端粒蛋
29、白质构成和端粒蛋白质构成 作用：稳定染色体结构作用：稳定染色体结构 防止染色体末端融合防止染色体末端融合 保护染色体结构基因保护染色体结构基因 避免遗传信息在复制过程中丢失避免遗传信息在复制过程中丢失 1930，著名的遗传学家，著名的遗传学家 B.Mcclintock 和和HJ.Mller发现：染色体的末端可维持染色体的发现：染色体的末端可维持染色体的稳定性稳定性 Mller将它定义为将它定义为“telomere”，这是由希腊语，这是由希腊语“末端末端”（telos）及）及“部分部分”（meros）组成的）组成的 染色体失去了这些片段，就会互相粘连到一块，染色体失去了这些片段，就会互相粘连到一
30、块，发生结构及功能上的改变，从而影响到细胞的分发生结构及功能上的改变，从而影响到细胞的分裂与生长裂与生长u 端粒的发现端粒的发现 19701970，EH.Blackburn EH.Blackburn 利用四膜虫揭示利用四膜虫揭示 了端粒了端粒DNADNA的初步结构：的初步结构：由非常短且数目精确的串联重复由非常短且数目精确的串联重复 DNA 片段片段 组成，富含嘌呤组成，富含嘌呤G。结构：结构：一条链一条链Gn（T/A)m，互补链，互补链Cn（A/T)m。n1，m为为14。重复次数由几十到数千不等重复次数由几十到数千不等u 端粒端粒DNA结构结构u 不同生物端粒不同生物端粒DNADNA序列序列
31、 人：（人：（TTAGGG）n，联重复，联重复，515kb 酵母：酵母：（TTTGGG），），200 400 bp 尖毛虫：尖毛虫：TTTTGGGG，20 bp 小鼠：小鼠：5 80 kb 大鼠：大鼠：150 kb2 2、端粒酶、端粒酶 (telomerase)是端粒复制所必须的一种特殊的是端粒复制所必须的一种特殊的DNA聚合酶。聚合酶。具有逆转录酶活性。具有逆转录酶活性。能以能以hTR为模板，向染色体末端添加为模板，向染色体末端添加TTAGGG序列。序列。u 端粒酶组成端粒酶组成 端粒酶端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human
32、telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)端粒酶端粒酶RNA的一级结构缺乏保守性，的一级结构缺乏保守性，但都有保守的二级结构。但都有保守的二级结构。u 端粒酶的结构端粒酶的结构具有酶促活性的具有酶促活性的RNA称为核酶。称为核酶。3、核酶、核酶(ribozyme)u 催化性催化性RNA(RNAzyme)作为序列特异性的作为序列特异性的核酸内切酶降解核酸内切酶降解mRNA核酶核酶。u 催化性催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧人工合成的
33、寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。四膜虫四膜虫rRNA的剪接采用的剪接采用自我剪接自我剪接方式方式最简单的核酶二级结构最简单的核酶二级结构槌头状结构槌头状结构(hammerhead structure)底物部分底物部分通常为通常为60个核苷酸左右个核苷酸左右同一分子上包括有同一分子上包括有催化催化部份部份和和底物部份底物部份 催化部份和底物部份组催化部份和底物部份组成锤头结构成锤头结构 除除rRNA外，外，tRNA、mRNA的加工也可采用的加工也可采用自我剪接方式。自我剪接方式。u 核酶研究的意义核酶研究的意义 核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶
34、的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶利用核酶的结构设计合成人工核酶 。核核 酸酸 的的 变性、复性和杂交变性、复性和杂交denaturation，renaturation and hybridization of nucleic acid第第 四四 节节一、一、核酸核酸的变性的变性(denaturation)定义定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解开双链解开成两条单链的过程。成两条单链的过程。方法：方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些
35、有机溶剂如乙醇、丙酮等。酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后理化性质发生变化：变性后理化性质发生变化：260nm260nm的紫外吸收值增加的紫外吸收值增加粘度降低，浮力密度升高粘度降低，浮力密度升高二级结构的改变等。二级结构的改变等。例：变性引起紫外吸收值的改变例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液OD260增高的现象。增高的现象。热变性热变性解链曲线：解链曲线：如果在连续加热如果在连续加热DNADNA的过程中以的过程中以温度对温度对A260A260（absorbanceabsorbance，A A，A260A26
36、0代表溶液在代表溶液在260nm260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线链曲线。Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为时的温度称为DNA的解链温度，又称融解的解链温度，又称融解温度温度(melting temperature,Tm)。其大小与其大小与 DNA分子分子G+C含量成正比。一般含量成正比。一般7085.1.DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于50 g/ml双链双链DNA40g/ml单
37、链单链DNA（或（或RNA）20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度DNA纯品纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品纯品:OD260/OD280=2.0OD260的应用的应用二、核酸的复性二、核酸的复性(renaturation)定义定义:在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。复性。减色效应减色效应DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低。降低。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退
38、火(annealing)。复性条件复性条件：有足够的盐浓度。有足够的盐浓度。有足够高的温度，比有足够高的温度，比Tm低低2025。在在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种变性后的复性过程中，如果将不同种类的类的DNA单链分子或单链分子或RNA分子放在同一溶液中，分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就 可 以 在 不 同 的 分 子 间 形 成就 可 以 在 不 同 的 分 子 间 形 成 杂 化 双 链杂 化 双 链(heteroduplex
39、)。三、核酸的杂交三、核酸的杂交(hybridization)与应用与应用 这种杂化双链可以在不同的这种杂化双链可以在不同的DNA与与DNA之间之间形成，也可以在形成，也可以在DNA和和RNA分子间或者分子间或者RNA与与RNA分子间形成。这种现象称为分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交核酸分子杂交。探针探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标记一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸分子存在。u 探针技术探针
40、技术探针种类：探针种类：DNA探针探针单链或双链单链或双链 RNA探针探针单链单链u 印迹技术印迹技术 印迹技术（印迹技术（blotting）是指将存在）是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。定化介质上并加以检测分析的技术。目前，这种技术已被广泛用于目前，这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质和蛋白质的检测。的检测。u 印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体、重组质粒和噬菌体的分析。的分析。（二）（
41、二）RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。也称为也称为免疫印迹技术免疫印迹技术（immunoblotting)其他其他斑点印斑点印迹迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验分子杂交实验放放射射自自显显影影照
42、照片片u 核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用研究研究DNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置定两种核酸分子间的序列相似性定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 四、生物芯片四、生物芯片基因芯片基因芯片 生物芯片主要指通过平面微细加工生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。大信
43、息量的检测。u 何为生物芯片（何为生物芯片（biochip）?它是继大规模集成电路之后的又一次具它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。有深远意义的科学技术革命。u 生物芯片分类生物芯片分类D N A C h ip sP ro tein C h ip sL ab C h ip sB io ch ip s 基因芯片基因芯片技术是指通过微阵列技术将高密度技术是指通过微阵列技术将高密度DNADNA片段阵列（探针）通过高速机器人或原位片段阵列（探针）通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如硅胶片等固相表面如硅胶片等固相表
44、面(400400/cm2），用荧光，用荧光标记的标记的DNADNA序列或样品与芯片上的探针序列或样品与芯片上的探针进行杂进行杂交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，交，通过检测每个探针分子杂交信号的强度，获取样品分子的数量和序列信息获取样品分子的数量和序列信息。（一）基因芯片（一）基因芯片（Gene chip）（二）基因芯片的主要类型（二）基因芯片的主要类型Expression ChipsGenomic ChipsSequencing ChipsDNA Chips芯片固相载体支持物有：芯片固相载体支持物有：硅胶片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、硅胶片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。尼龙膜等。（
45、三）基因芯片的杂交及检测（三）基因芯片的杂交及检测（四）基因芯片的应用（四）基因芯片的应用1、基因表达方法的检测、基因表达方法的检测2、用于定位克隆，寻找新基因、用于定位克隆，寻找新基因3、在基因组文库中确定重叠样的排列、在基因组文库中确定重叠样的排列4、基因的测序、基因的测序5、测定基因突变的多态性、测定基因突变的多态性DNA点阵点阵第五节第五节 病毒核酸病毒核酸 按照细胞的特征按照细胞的特征(自我装配、自我调节、自我自我装配、自我调节、自我复制复制)l 病毒既不是真核细胞，也不是原核细胞，病毒既不是真核细胞，也不是原核细胞，l 它只是具有部分生命特征的感染物。它只是具有部分生命特征的感染物
46、。l 是一类亚显微专属性的细胞内寄生物。是一类亚显微专属性的细胞内寄生物。一、病毒的基本概念一、病毒的基本概念：病毒必须依赖宿主细胞进行繁殖，病毒必须依赖宿主细胞进行繁殖，它在细胞中它在细胞中复制和装配是靠细胞的代谢活动来完成的复制和装配是靠细胞的代谢活动来完成的。在细胞内组装成熟后释放到细胞外，感染其它细胞。在细胞内组装成熟后释放到细胞外，感染其它细胞。u 病毒概念的限定：病毒概念的限定：病毒粒子由蛋白质外壳与内部核酸构成；病毒粒子由蛋白质外壳与内部核酸构成；病毒粒子是由预先形成的组分装配而成的；病毒粒子是由预先形成的组分装配而成的；病毒自身不具备能量代谢的遗传信息；病毒自身不具备能量代谢的
47、遗传信息；病毒自身不具备物质代谢的遗传信息。病毒自身不具备物质代谢的遗传信息。病毒外壳蛋白质的作用：病毒外壳蛋白质的作用：一是保护核酸，防止被核酸酶破坏；一是保护核酸，防止被核酸酶破坏；二是识别宿主细胞，帮助病毒感染细胞。二是识别宿主细胞，帮助病毒感染细胞。根据病毒所含核酸的性质和状态不同分六类：根据病毒所含核酸的性质和状态不同分六类：双链双链DNAmRNA蛋白质蛋白质单链单链DNADNAmRNA蛋白质蛋白质双链双链RNAmRNA蛋白质蛋白质单链单链RNARNAmRNA蛋白质蛋白质单链单链RNAmRNA蛋白质蛋白质单链单链RNADNADNAmRNA蛋白质蛋白质u 病毒的分类：病毒的分类：根据寄
48、生的宿主不同分三类：根据寄生的宿主不同分三类：动物病毒、植物病毒、细菌病毒（动物病毒、植物病毒、细菌病毒（噬菌体）噬菌体）。v 无外壳蛋白，仅有传染性的环状无外壳蛋白，仅有传染性的环状RNA分子称为分子称为类病毒类病毒(viroid)。类病毒主要在植物中引起一些疾病。类病毒主要在植物中引起一些疾病。v 无基因组，而仅由蛋白质组成的传染因子称为无基因组，而仅由蛋白质组成的传染因子称为朊病毒朊病毒(prions)。也称也称侵染性蛋白质侵染性蛋白质或或蛋白质感染因子蛋白质感染因子。如疯牛病、脑软化病、如疯牛病、脑软化病、人纹状体脊髓变性病的感染因子。人纹状体脊髓变性病的感染因子。u 两类特殊的病毒两
49、类特殊的病毒：病毒核酸分子大小差别很大病毒核酸分子大小差别很大，一般在，一般在1030nm之间，之间，3kb300kb不等。不等。二、病毒核酸的一般特征二、病毒核酸的一般特征病毒核酸存在形式多样病毒核酸存在形式多样：如单链如单链RNARNA，双链，双链RNARNA，单链，单链DNADNA，双链，双链DNADNA。病毒核酸病毒核酸形状有线状和环状两种。形状有线状和环状两种。病毒基因组病毒基因组具有操纵子结构具有操纵子结构,。噬菌体基因组中无内含子，但动物病毒噬菌体基因组中无内含子，但动物病毒的基因组中具有内含子。的基因组中具有内含子。病毒基因组织病毒基因组织有重叠基因有重叠基因的存在。的存在。病
50、毒核酸分正、负链病毒核酸分正、负链：正链病毒（能起正链病毒（能起mRNA作用）作用）负链病毒（互补链作为负链病毒（互补链作为mRNA）三、三、DNA病毒的核酸结构病毒的核酸结构线形双链线形双链DNA病毒的特殊结构：多在末端病毒的特殊结构：多在末端1、粘性末端、粘性末端2、末端重复序列、末端重复序列3、末端回文结构、末端回文结构4、痘苗病毒：其两条多核苷酸链在末端以、痘苗病毒：其两条多核苷酸链在末端以 共价键相连，故与其它线形共价键相连，故与其它线形DNA病毒不同。病毒不同。5、腺病毒在、腺病毒在DNA两条链的两条链的5 端有一共价键连接端有一共价键连接 的蛋白质。的蛋白质。四、四、RNA病毒的
