1、第十章 真核细胞的培养 Eukaryotic cell culture张双双 2013.10.9细胞培养类型和细胞株细胞培养类型和细胞株获得细胞方式获得细胞方式细胞维护细胞维护冷冻和细胞的储藏冷冻和细胞的储藏污染污染培养细胞类型 细胞来源：原代细胞 转化细胞 杂交瘤细胞 细胞生长方式-细胞是否贴壁：贴壁细胞 悬浮细胞 获得细胞方式 原代细胞 持续传代的细胞株 复苏细胞原代细胞 原代细胞是很难分离得到的，这种细胞通常要杀死动物并解剖获取组织，再分离和培养细胞，这些操作是非常耗时，也容易出错。多数细胞类型都只能得到一点点，而且原代细胞的生存时间很短,原代细胞是最接近实物的。获取来源 主要自己分离
2、从公司购买，但价格比较贵 从其他人手里索要 医院和医学院要向做同一种实验的实验室索求细胞最常用最可靠的细胞株来源之一是ATCC http:/www.atcc.org/。ATCC是一家私营非盈利性的组织，它收集、保存、销售各种动物和人类的细胞株，另外它还提供一些微生物、病毒、DNA探针和植物。传代细胞复苏细胞 真核细胞通常悬浮在带有血清和冷冻剂的培养基内，保存在-196的液氮中。如果是商业订购的，通常储存在用干冰包裹的冻存管中。所以冻存后的细胞必须快速解冻后立即培养，以获得最大生存能力。细胞维护换液传代冻存与复苏换液抗生素的使用培养器械细胞培养基血清的使用注意事项抗生素 大多数实验室都使用抗生素
3、，但是如果无菌操作技术掌握的好的话，抗生素也不是必须的，毕竟抗生素也会对细胞产生不利的影响。多数抗生素在37的半衰期很短，故培养基内实际的抗生素浓度要比以为的低。但是如果你养的细胞很贵重，或者细胞来源不容易的话，最好还是加入适当的抗生素，因为一旦污染了，对实验者来说是非常棘手的。细胞培养所用的抗生素一般以干粉形式保存，使用时用无菌水或其他溶剂将其溶解，这样所得到的抗生素无需再进行过滤灭菌。培养器械培养瓶 选择培养瓶类型根据培养细胞的种类和体积来决定，大多数实验室使用锥形瓶或培养皿来培养悬浮或贴壁的细胞也有一些其他类型的容器用来培养大量细胞或是特殊的种类的细胞。大多数组织培养容器是一次性聚乙烯材
4、料的，并通过放射线灭菌，而玻璃容器很少使用，使用起来不如一次性的方便。非处理过的塑料器皿常用来培养悬浮生长的细胞，而多数贴壁生长的细胞在处理过的器皿表面生长较好。不同的公司处理器皿的方式不一样，故细胞生长可能偏爱某个公司的产品，因此不要轻易更换耗材提供商。培养基的颜色培养基中都有酚红或其他染料pH指示剂 酚红为例：pH6.5以下为柠檬黄 pH6.5为黄色 pH7.0为橙色 pH7.4为红色 pH7.6为粉红色 pH7.8为紫色多数细胞的最适pH为7.4左右。注意事项 向那些保证培养基不被支原体污染的供应商订购 细胞培养基有许多热不稳定的成分，必须低温保存，但培养基在接触细胞前必须事先（一般是使
5、用10min前）预热到37，千万不要将冷的培养基加入细胞中。最好买500ml瓶装的培养基或在500ml的瓶内配置。细胞可能会用尽培养基中的某种成分,生长缓慢的细胞也要勤换培养基。血清 血清能提供细胞生长所必须的生长因子和营养元素，多数细胞需求量比较大，但某些细胞特别是转化后的细胞对于血清的需要量是很低的，在0.5%左右。注意事项 血清浓度：大多数细胞的适宜浓度为5%20%。血清的种类：有些细胞偏爱马血清，组织细胞培养的标准血清为小牛血清，而有些细胞则需要更贵的胎牛血清，还有些细胞（特别是人的）则需要最贵的同种生物血清。血清是否为热灭活血清。血清的某些成分预热失活，比如补体、支原体。细胞传代 每
6、种细胞都有各自的生长速率，分瓶时机也各不相同。而细胞的密度情况又会影响到细胞自身的生理情况，所以必须耐心的将细胞维持在合适的密度，而且每次实验时细胞的密度也要尽量保持一致。此外，每次分瓶时都要对细胞进行计数。分瓶时，贴壁生长成单层的细胞必须从培养瓶上洗到悬浮液中，但这些细胞常常分泌一些细胞外基质（ECM），且细胞间也通过依赖钙离子的受体配体系统粘在一起使得洗下细胞变得困难。当然也可以把细胞刮下来，但会损失细胞，所以一般使用胰酶消化。对于附着力强的细胞，则先用EDTA螯合钙离子，再用胰酶消化。活细胞的显微计数 细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。即
7、可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。步骤1、制备细胞悬液：对于悬液培养的细胞，可直接进行下面的步骤2（计数与计算过程）。如果计数对象为贴壁生长的细胞，首先需将培养物按如下步骤制备成细胞悬液。1）终止培养，将培养液吸出，用PBS洗培养物一次。2）给培养瓶内加入1ml 0.25胰蛋白酶溶液，于37消化35min。期间不断在镜下观察。当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。3）加入一定量的培养液（如果这些培养细胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。2、计数与计算过程1）在细胞
8、计数板中央放置计数专用的盖玻片。2）用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。3）置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。4）按下式计数细胞悬液的密度：细胞密度（4个大格细胞总数/4）104个/ml。台昐蓝染色与细台昐蓝染色与细胞计数胞计数细胞密度（大格细细胞密度（大格细胞平均数）胞平均数）2104个个/ml。细胞冷冻和储存 细胞生长时的表型会发生改变或漂变，所以细胞必须计数，计数后应马上冻存。冷冻细胞前的准备：检查冷冻细胞所需试剂和器具是否备齐。确认有无菌的可用于冷冻的冻存管。确认
9、液氮里有你冻存细胞的位置。冷冻细胞 1.收集对数生长期细胞；2.以25l台盼蓝溶液稀释25l细胞悬液；用血球 计数板计数并计算细胞存活率（至少应该在90%以上)3.细胞悬液在4 条件下200g离心10分钟；4.将沉淀的细胞重新悬浮在冷冻液中（大约5106 细胞/0.5 ml 冷冻液）；5.将细胞悬液加入到冷冻管中，每管0.5 ml；6.将冷冻管置于-80冰箱中；7.24小时后，将冷冻管移入液氮罐中；8.在记录本或电脑中记录下每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。污染 发生污染，既耽误时间又是一个灾难，熟练的无菌操作能避免许多问题，但早期检测污染是一种可以预警的方法。对于培养
10、箱中的细胞都要注意观察。要养成习惯，每次打开培养箱时，迅速看看有没有发生污染，并且动作要快，不要长时间保持培养箱打开状态，打开时也不要说话。识别污染 肉眼观察 浑浊情况 培养基的颜色 闻！：把鼻子贴在瓶口去闻，许多污染都能闻到特殊的 味道 显微观察 视不同微生物污染的情况不同污染分类 细菌 真菌 支原体 黑胶虫 原虫 异种细胞细菌 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生
11、病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。可在培养液中加相应的抗生素处理 真菌 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。支原体 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下
12、生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，但会造成细胞功能变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话,建议用8ug/ml的浓度。黑胶虫 可穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是
13、细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。原虫 培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。非同种细胞 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。
