1、第四章第四章氨基酸氨基酸内容内容氨基酸氨基酸-蛋白质的构件分子蛋白质的构件分子氨基酸的分类氨基酸的分类氨基酸的酸碱化学氨基酸的酸碱化学氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应氨基酸的光学活性和光谱性质氨基酸的光学活性和光谱性质氨基酸混合物的分析分离氨基酸混合物的分析分离氨基酸的性质氨基酸的性质聚合能力聚合能力酸碱性质酸碱性质侧链的结构侧链的结构手性手性蛋白质的水解蛋白质的水解完全水解：氨基酸的混合物完全水解：氨基酸的混合物部分水解：肽段和氨基酸部分水解：肽段和氨基酸 在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成氨基酸单体。氨基酸单体。酸水解：酸水解：6MHCl或或4MH
2、2SO4不消旋，得到不消旋，得到L-氨基酸；色氨酸破坏、羟基氨基氨基酸；色氨酸破坏、羟基氨基酸部分分解、天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基。酸部分分解、天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基。蛋白质的水解蛋白质的水解 碱水解：碱水解：多数氨基酸遭到不同程度的破坏，消旋，多数氨基酸遭到不同程度的破坏，消旋，得到得到D-,L-型氨基酸的混合物；色氨酸稳型氨基酸的混合物；色氨酸稳定、精氨酸脱氨定、精氨酸脱氨5MNaOH蛋白质的水解蛋白质的水解 酶水解：酶水解：不消旋、不破坏氨基酸、需要多种酶的不消旋、不破坏氨基酸、需要多种酶的协同作用；水解位点特异，水解时间长。协同作用；水解位点特异，水解时间长。用于一级结构分析用于一
3、级结构分析蛋白质的水解蛋白质的水解L-L-氨基酸的基本结构氨基酸的基本结构C CH HH H2 2N NCOOHCOOHR R残基：在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子，脱水后残基：在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子，脱水后的残余部分叫残基（的残余部分叫残基（residue),residue),因此蛋白质肽链中的氨因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。基酸统统是残基形式。Chiral carbon氨基酸的结构氨基酸的结构肽键肽键一分子氨基酸的一分子氨基酸的羧基和一分羧基和一分子氨基酸的子氨基酸的氨基脱水缩合形氨基脱水缩合形成的酰胺键，即成的酰胺键，即-CO-NH-。氨。氨基酸借肽键联结成多肽链
4、。基酸借肽键联结成多肽链。蛋白质分子中的主要共价键，性质比较蛋白质分子中的主要共价键，性质比较稳定。单键，具有部分双键的性质，难稳定。单键，具有部分双键的性质，难以自由旋转而有一定的刚性，因此形成以自由旋转而有一定的刚性，因此形成肽键平面，包括连接肽键两端的肽键平面，包括连接肽键两端的CO、和和2个个C共共6个原子的空间位置处个原子的空间位置处在一个相对接近的平面上。一条多肽链在一个相对接近的平面上。一条多肽链的一端含有一个游离的氨基的一端含有一个游离的氨基,另一端含有另一端含有一个游离的羧基一个游离的羧基.肽键肽键氨基酸的性质氨基酸的性质中性环境：兼性离子中性环境：兼性离子旋光性旋光性a-a
5、-氨基酸：白色晶体、熔点高，不同氨氨基酸：白色晶体、熔点高，不同氨基酸有特殊的晶型基酸有特殊的晶型一般能溶于水（胱氨酸和酪氨酸除外）一般能溶于水（胱氨酸和酪氨酸除外）氨基酸的分类氨基酸的分类 1809年发现年发现Asp，1938年发年发Thr，目前已，目前已发现发现180多种。但是组成蛋白质的多种。但是组成蛋白质的aa常见的有常见的有20种，称为基本氨基酸（编码的蛋白质氨基种，称为基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本后由基本aa经酶促修饰而来。经酶促修饰而来。非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸R
6、R基的化学结构分基的化学结构分 R为脂肪烃基的氨基酸（为脂肪烃基的氨基酸（5种）种）Gly、Ala、Val、Leu、Ile、R基均为中性烷基（基均为中性烷基（Gly为为H），），R基对分子酸碱基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6.00.03）Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。从旋光性。从Gly至至Ile，R基团基团疏水性疏水性增加，增加，Ile 是是这这20 种种a.a 中脂溶性最强的之一（除中脂溶性最强的之一（除Phe 2.5、Trp3.4、Tyr 2.3以外）。以外）。R R中含有羟
7、基和硫的氨基酸（中含有羟基和硫的氨基酸（4 4种）种）含羟基的有两种：含羟基的有两种：Ser和和Thr。Ser的的-CH2 OH基（基（pKa=15），在生理条件下），在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义。在大多数酶形成氢键，具有重要的生理意义。在大多数酶的活性中心都发现有的活性中心都发现有Ser残基残基存在。存在。Thr 中的中的-OH是仲醇，具有亲水性，但此是仲醇，具有亲水性，但此-OH形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。心中很少出现。Ser和和Th
8、r的的-OH往往与糖链相往往与糖链相连，形成糖蛋白连，形成糖蛋白。含硫的两种：含硫的两种：Cys、Met。Cys Cys 具有两个重要性质具有两个重要性质（1）在较高）在较高pH值条件，巯基离解。值条件，巯基离解。（2）两个）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。胱氨酸。CysssCys。二硫键在蛋白质。二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。的结构中具有重要意义。Cys还常常出现在酶的活性中心。还常常出现在酶的活性中心。Met的的R中中含有甲硫基（含有甲硫基（-SCH3），硫原子有亲核性，易），硫原子有亲核性，易发生极化，因此，发生极化，因此，Met是一种重要的甲
9、基供体是一种重要的甲基供体。R R中含有酸性基团及酰胺（中含有酸性基团及酰胺（4 4种）种）Asp、Glu，一般称酸性氨基酸，一般称酸性氨基酸Asp侧链羧基侧链羧基pKa（-COOH）为）为3.86，Glu侧链羧基侧链羧基pKa（-COOH）为）为4.25，在生理条件下带有负电荷的仅有的两个在生理条件下带有负电荷的仅有的两个 氨基酸。氨基酸。R R中含碱性基团（中含碱性基团（2 2种）种）Lys的的R侧链上含有一个氨基，侧链氨基侧链上含有一个氨基，侧链氨基的的pKa为为10.53。生理条件下，。生理条件下，Lys侧链侧链带有一个正电荷（带有一个正电荷（NH3+），同时它的），同时它的侧链有侧链
10、有4个个C的直链，柔性较大，使侧链的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短肽间的连接）肽间的连接）Arg是碱性最强的氨基酸，侧链是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机上的胍基是已知碱性最强的有机碱，碱，pKa值为值为12.48，生理条件，生理条件下完全质子化。下完全质子化。R R中含有芳基的氨基酸（中含有芳基的氨基酸（3 3种）种）PhePhe、Tyr Tyr、TrpTrp 具有共轭具有共轭电子体系电子体系,易与其它缺电子体易与其它缺电子体系或系或电子体系形成电荷转移复合物电子体系形成电荷转移复合物(charge-transfe
11、r complex)或电子重或电子重叠复合物。在受体叠复合物。在受体底物或分子相互识底物或分子相互识别过程中具有重要作用。别过程中具有重要作用。这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在280nm处，处，TrpTyrPhe。Phe疏水性最强。酪氨酸的疏水性最强。酪氨酸的-OH磷酸化是一个磷酸化是一个普遍的调控机制，普遍的调控机制，Tyr在较高在较高pH值时，酚羟基值时，酚羟基离解。离解。Trp有复杂的有复杂的共轭休系，比共轭休系，比Phe和和Tyr更易形成电荷转移络合物。更易形成电荷转移络
12、合物。R R为环状的氨基酸（为环状的氨基酸（2 2种）种）Pro(Pro(His)His)Pro是一种环状结构的氨基酸，它的是一种环状结构的氨基酸，它的-亚氨基亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段出现在两段-螺旋之间的转角处，螺旋之间的转角处，Pro残基所残基所在的位置必然发生骨架方向的变化。在的位置必然发生骨架方向的变化。His含咪唑环，咪唑环的含咪唑环，咪唑环的pKa在游离氨基在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者酸中和在多肽链中不同，前者pKa为为6.
13、00，后者为，后者为7.35，它是，它是20种氨基酸中种氨基酸中侧链侧链pKa值最接近生理值最接近生理pH值的一种，在值的一种，在接近中性接近中性pH时，可离解平衡。它是在生时，可离解平衡。它是在生理理pH条件下条件下唯一具有缓冲能力唯一具有缓冲能力的氨基酸。的氨基酸。必需氨基酸必需氨基酸：成年人：成年人：Leu、Ile、Val、Thr、Met、Trp、Lys、Phe婴儿期：婴儿期：Arg和和His供给不足，属半必须氨基酸。供给不足，属半必须氨基酸。必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架（体内不能合成这些氨基酸的碳架（-酮酸）酮酸）
14、9 9种人体必需氨基酸的记忆口诀种人体必需氨基酸的记忆口诀借一两本蛋色书来借一两本蛋色书来 谐音谐音:借借(缬氨酸缬氨酸),一一(异亮异亮氨酸氨酸),两两(亮氨酸亮氨酸),本本(苯丙氨酸苯丙氨酸),蛋蛋(蛋氨酸蛋氨酸),色色(色氨酸色氨酸),书书(苏氨苏氨酸酸),来来(赖氨酸赖氨酸).笨蛋来宿舍，晾一晾鞋笨蛋来宿舍，晾一晾鞋 笨（苯丙氨酸）蛋（蛋氨酸）笨（苯丙氨酸）蛋（蛋氨酸）来（赖氨酸）宿（苏氨酸）舍（色氨来（赖氨酸）宿（苏氨酸）舍（色氨酸），晾（亮氨酸）一晾（异亮氨酸酸），晾（亮氨酸）一晾（异亮氨酸）鞋（缬氨酸）鞋（缬氨酸）携带一两本甲硫色书来携带一两本甲硫色书来 携（缬氨酸）带一（异亮氨
15、携（缬氨酸）带一（异亮氨酸）两（亮氨酸）本（苯丙氨酸酸）两（亮氨酸）本（苯丙氨酸）甲硫（甲硫氨酸）色（色氨酸）甲硫（甲硫氨酸）色（色氨酸）书）书(苏氨酸苏氨酸)来来(赖氨酸赖氨酸)天冬酰氨天冬酰氨 1806 Vauquelin 天冬门芽天冬门芽甘氨酸甘氨酸 1820 Braconnot 明胶明胶亮氨酸亮氨酸 1820 Braconnot 羊毛、肌肉羊毛、肌肉酪氨酸酪氨酸 1849 Bopp 奶酪奶酪丝氨酸丝氨酸 1865 Cramer 蚕丝蚕丝谷氨酸谷氨酸 1866 Ritthausen 面筋面筋天冬氨酸天冬氨酸 1868 Ritthausen 蚕豆蚕豆苯丙氨酸苯丙氨酸 1881 Schult
16、ze 羽扇豆芽羽扇豆芽丙氨酸丙氨酸 1881 Weyl 丝心蛋白丝心蛋白 赖氨酸赖氨酸 1889 Drechsel 珊瑚珊瑚精氨酸精氨酸 1895 Hedin 牛角牛角组氨酸组氨酸 1896 Kossel,Hedin 奶酪奶酪胱氨酸胱氨酸 1899 Morner 牛角牛角缬氨酸缬氨酸 1901 Fischer 奶酪奶酪脯氨酸脯氨酸 1901 Fischer 奶酪奶酪色氨酸色氨酸 1901 Hopkins 奶酪奶酪异亮氨酸异亮氨酸 1904 Erhlich 纤维蛋白纤维蛋白甲硫氨酸甲硫氨酸 1922 Mueller 奶酪奶酪苏氨酸苏氨酸 1935 McCoy et al 奶酪奶酪氨基酸发现年代表
17、alanine丙氨酸丙氨酸AlaAarginine 精氨酸精氨酸 ArgRasparagine天冬酰氨天冬酰氨 Asn AsxNaspartic acid天冬氨酸天冬氨酸Asp AsxDcysteine半胱氨酸半胱氨酸CysCglutamine谷氨酰胺谷氨酰胺Gln Glx Qglutamic acid谷氨酸谷氨酸Glu Glx Eglycine甘氨酸甘氨酸GlyGhistidine组氨酸组氨酸HisHisoleucine异亮氨酸异亮氨酸IleIleucine亮氨酸亮氨酸LeuLlysine赖氨酸赖氨酸LysKmethionine甲硫氨酸甲硫氨酸MetMphenylalanine苯丙氨酸苯丙氨
18、酸PheFproline脯氨酸脯氨酸ProPserine丝氨酸丝氨酸SerSthreonine苏氨酸苏氨酸ThrTtryptophan色氨酸色氨酸TrpWtyrosine 酪氨酸酪氨酸TyrYvaline缬氨酸缬氨酸ValV要求：要求：能倒背能倒背JUZBOXJUZBOX氨基酸名称与符号 甘油醛的旋光性甘油醛的旋光性L和D的来源 与与 L-amino acidD-amino acidL和D型氨基酸“D/LD/L”判断法判断法 （将将H H原子靠近自己，观察原子靠近自己，观察CARCAR的走向，逆时针的走向，逆时针（左转）为（左转）为L L型，顺时针（右转）为型，顺时针（右转）为D D型。型。D
19、：dextro 右右 ：carboxyl group;L：levo 左左 ：amino group;：residue;CCARRAL型型D型型L和D型氨基酸的判断拉丁语中拉丁语中苏氨酸的异构体 二硫键二硫键Disulfide bondDisulfide bond要求全部背出要求全部背出20种标准氨基酸的物化性质其他氨基酸的结构其他氨基酸的结构氨基酸修饰 4-Hydroxyproline ;5-Hydroxylysine,6-N-methyllysine,desmocine ;Phospho-Ser,-Thr,-Tyr;-Carboxyglutamic acid;Pyroglutamic aci
20、d;从各种生物分离到的氨基酸已达从各种生物分离到的氨基酸已达250250种以上种以上大量出现在胶原蛋白大量出现在胶原蛋白结缔组织结缔组织修饰型氨基酸1羟赖氨酸羟赖氨酸结缔组织结缔组织修饰型氨基酸2 3 3凝血酶凝血酶信号传导信号传导修饰型氨基酸3 4 4氨基酸衍生物Pyroglutamic acid(焦谷氨酸焦谷氨酸),神经肽的神经肽的N端多数为焦谷氨酸端多数为焦谷氨酸氨基酸衍生物21号和号和22号号primary amino acid Ornithine;Citrulline5-HydroxytryptophanHomoamino acids3,4-Dihydroxyphenylalanin
21、e(DOPA)-Aminobutyric acid(GABA)Mono,di,tri-iodotyrosine;thyroxine 1 1氨基酸衍生物Hao,B.,et al.A novel UAG encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase.Science 296:1462-1466,2002.SeC,硒半胱氨酸硒半胱氨酸第第21个一级氨基酸个一级氨基酸?PyL(吡咯赖氨酸吡咯赖氨酸),第第22个一级氨基酸个一级氨基酸?2 2氨基酸衍生物 瓜氨酸瓜氨酸(存在于尿素循环存在于尿素循环,从西瓜汁分离到从西瓜
22、汁分离到)鸟氨酸鸟氨酸(存在于尿素循环存在于尿素循环)3 3“The taste of love”是松果体素是松果体素 (褪黑素褪黑素,melatoninmelatonin)和和 血清素血清素(serotonin)(serotonin)的前体。的前体。氨基酸衍生物 4 4 Homoserine 微生物、植物的代谢中间产物微生物、植物的代谢中间产物 HomocysteineHomocitrulline 摄取高摄取高Lys含量的食物时从尿中排出含量的食物时从尿中排出Homomethionine*Met的分解产物，存在的分解产物，存在于于S-adenosylhomo-cysteine和叶酸中和叶酸中
23、.Methionine氨基酸衍生物从从Tyr衍生出衍生出来的重要生来的重要生理物质，理物质，其其中多巴是一中多巴是一种氨基酸。种氨基酸。5 5氨基酸衍生物味精是神经递质味精是神经递质GABA的直接前体的直接前体 6 6氨基酸衍生物甲状腺内贮存碘的氨基酸甲状腺内贮存碘的氨基酸 7 7氨基酸衍生物氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质无色晶体，熔点较高（无色晶体，熔点较高（200200300300），水中溶解度各不同，取决，水中溶解度各不同，取决于侧链。于侧链。在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的氨基酸氨基酸TrpTrp、TyrTyr、Phe,Phe,利用这一特利用这一特点，
24、可以通过测定点，可以通过测定280280nmnm处的紫外吸处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量。收值的方法对蛋白溶液进行定量。氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质 有紫外特征吸收的氨基酸光吸收的测定氨基酸的旋光性与光谱性质氨基酸的旋光性与光谱性质氨基酸的旋光性：氨基酸的旋光性：氨基酸的构型（指氨基酸的构型（指-碳）也以甘油醛为碳）也以甘油醛为参考物，从蛋白质的酸水解或酶水解液中参考物，从蛋白质的酸水解或酶水解液中得到的都是得到的都是L型，但型，但D型氨基酸在自然界也型氨基酸在自然界也存在；蛋白质用碱水解或有机合成氨基酸存在；蛋白质用碱水解或有机合成氨基酸时，得到的都是无旋光性的时，得到的都是无旋
25、光性的DL-消旋物消旋物氨基酸的旋光符号和大小取决于氨基酸的旋光符号和大小取决于R基基的性质，与测定溶液的的性质，与测定溶液的pH有关。有关。比旋是比旋是-氨基酸的物理常数，是鉴氨基酸的物理常数，是鉴别各种氨基酸的依据之一别各种氨基酸的依据之一氨基酸的光谱性质：氨基酸的光谱性质：参与蛋白质组成的参与蛋白质组成的20多种氨基酸在可见多种氨基酸在可见光区没有光吸收，在红外区和远紫外区光区没有光吸收，在红外区和远紫外区都有光吸收，但在近紫外区只有芳香族都有光吸收，但在近紫外区只有芳香族氨基酸有光吸收；氨基酸有光吸收；同一个氨基酸分子上可以同时携带正电同一个氨基酸分子上可以同时携带正电荷和负电荷，称为
26、两性电解质荷和负电荷，称为两性电解质。氨基酸作为两性电解质氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质 根据酸碱质子理论，根据酸碱质子理论，HA A-H+氨基酸是两性电解质，既是质子供体，又是质子氨基酸是两性电解质，既是质子供体，又是质子受体。当氨基酸完全质子化时，可看作是多元酸；受体。当氨基酸完全质子化时，可看作是多元酸；COOH和和NH3+可以发生解离，用可以发生解离，用Ka表示它们的表示它们的解离常数；解离常数；在氨基酸溶液中，在氨基酸溶液中，pH值计算公式如下：值计算公式如下：pH=pKalg（质子受体质子受体/质子供体质子供体）侧链不解离的中性氨基酸看作二元酸侧链不解离的中性氨基酸看作二元酸酸性
27、氨基酸和碱性氨基酸看作三元酸酸性氨基酸和碱性氨基酸看作三元酸+A+A-A0A0Ka1=Ka2=A0 H+A+A-H+A+pH=pKalg（质子受体质子受体/质子供体质子供体）当 ，pH=pKa1A0=当 A0=A-，pH=pKa2A0 Ka1Ka2氨基酸的酸碱滴定0.1HCl0.1HClpK值的变化 在在所携带的所携带的为零为零时的时的溶液的溶液的pHpH值。值。.氨基酸带电状况与溶液的氨基酸带电状况与溶液的pH有关。当有关。当pH大于大于等电点时，等电点时，氨基酸带净氨基酸带净负负电荷；当电荷；当pH小于小于等电点时，氨基酸带净等电点时，氨基酸带净正正电荷！在一定的电荷！在一定的pH范围内，
28、氨基酸溶液的范围内，氨基酸溶液的pH离等电离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。氨基酸的甲醛滴定氨基酸的甲醛滴定氨基酸酸碱滴定的等电点氨基酸酸碱滴定的等电点pH 过高或过低，过高或过低，没有适宜的指示剂，因此，氨基酸虽然是没有适宜的指示剂，因此，氨基酸虽然是两性电解质，但不能直接用酸碱滴定。两性电解质，但不能直接用酸碱滴定。在氨基酸中加入甲醛，甲醛与氨基酸中的在氨基酸中加入甲醛，甲醛与氨基酸中的氨基作用形成羟甲基衍生物，降低了氨基氨基作用形成羟甲基衍生物，降低了氨基的碱性，使滴定终点移动。的碱性，使滴定终点移动。氨基酸的主要化学反应氨基酸的主要化学反应氨基酸
29、的化学反应氨基酸的化学反应-氨基氨基参加的参加的反应反应与亚硝酸反应（生成羟基氨基与亚硝酸反应（生成羟基氨基酸和氮气）酸和氮气）与酰化试剂反应（氨基被酰基与酰化试剂反应（氨基被酰基化而被保护）化而被保护）烃基化烃基化反应反应DNFB反应（生成反应（生成DNP-氨基酸氨基酸）PITC反应（生成反应（生成PTH-氨基酸氨基酸）形成西佛碱反应（与醛类化合物形成西佛碱反应（与醛类化合物）脱氨基反应脱氨基反应-羧基参加的反应羧基参加的反应成盐成酯成酰氯（与二氯亚砜等）脱羧基反应叠氮反应（氨基酸酯与肼、亚硝酸）-氨基与氨基与-羧基共同参加反应羧基共同参加反应与茚三酮反应（氨与还原茚三酮发生作用生成紫色物质
30、）成肽反应侧链侧链R基参加的反应基参加的反应酪氨酸酚羟基组氨酸咪唑精氨酸胍基色氨酸吲哚基半胱氨酸巯基H2NCHCOOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺二甲氨基萘磺酰氯（酰氯（DNS-Cl）pH9.7 40NCH3CH3O=S=OHNCHCOOH RDNS-氨氨基酸基酸取代取代DNFB测定蛋白质测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高端氨基酸，灵敏度高酰化反应酰化反应氨基酸与氨基酸与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)DNFB)的反应的反应（sangersanger反应）反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色黄色)+HF弱碱中弱碱中氨基酸氨
31、基酸氨基酸与苯异硫氰酯（氨基酸与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应的反应（EdmanEdman反应）反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱硷中弱硷中(400 C)(硝基甲烷硝基甲烷 400 C)H+氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质脱羧反应脱羧反应 NH2 I R-CH-COOH-R-CH2-NH2+CO2氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型
32、茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。3 注意：注意：脯氨酸与羟脯氨酸与茚三酮反应脯氨酸与羟脯氨酸与茚三酮反应生成生成 亮黄色化合物，最大吸收在亮黄色化合物，最大吸收在440nm处处。侧链侧链R R基参加的反应基参加的反应蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰 在温和的条件下，以可控制的方式在温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂发生特异反应，引使蛋白质与某种试剂发生特异反应，引起蛋白质个别氨基酸侧链或官能团发生起蛋白质个别氨基酸侧链或官能团发生共价化学改变。用于结构与功能的研究共价化学改变。用于结构与功能的研究氨基酸混合物的分析分离氨基酸混合物的分析分离分离方
33、法分离方法柱层析柱层析纸层析（相对迁移率，非极性性质）纸层析（相对迁移率，非极性性质）薄层层析薄层层析离子交换层析（电荷和非极性）离子交换层析（电荷和非极性）气相层析气相层析高效液相层析高效液相层析氨基酸洗脱顺序的判定：氨基酸洗脱顺序的判定：氨基酸与树脂的亲合力主要决氨基酸与树脂的亲合力主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂聚定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂聚苯乙烯之间的疏水相互作用；亲和力愈大愈难洗脱！苯乙烯之间的疏水相互作用；亲和力愈大愈难洗脱！层析分离层析分离根据根据蛋白质蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。共同
34、特点物理分离方法。共同特点:一个固定相和流动相，一个固定相和流动相，当蛋白质混合溶液当蛋白质混合溶液(流动相流动相)通过装有珠状或基质材通过装有珠状或基质材料的管或柱料的管或柱(固定相固定相)时，由于混合物中各组份在物时，由于混合物中各组份在物理化学性质理化学性质(如如吸引力吸引力、溶解度溶解度、分子的形状与大、分子的形状与大小、分子的电荷性与小、分子的电荷性与亲和力亲和力)等方面的差异使各组等方面的差异使各组分在两相间进行反复多次的分配而得以分开。流分在两相间进行反复多次的分配而得以分开。流动相的流动取决于引力和压力，不需要电流。动相的流动取决于引力和压力，不需要电流。用层析法可以纯化得到非
35、变性的、天用层析法可以纯化得到非变性的、天然状态的蛋白质。层析方法中然状态的蛋白质。层析方法中凝胶过凝胶过滤层析滤层析、离子交换层析离子交换层析、亲和层析亲和层析等等是目前最常用的层析方法。是目前最常用的层析方法。层析原理层析原理分配定律分配定律:Kd=cA/cB有效分配系数：有效分配系数：Keff=某物质在某物质在A相中的相中的总量总量/某物质在某物质在B相中的总量相中的总量Keff=Kd*Rv,Rv=VA/VB逆流分配（反流分布法）逆流分配（反流分布法）是连续操作的多次液一液提取的分离方法。被是连续操作的多次液一液提取的分离方法。被分离的各个组分在两种不相混溶的溶剂中有不分离的各个组分在两
36、种不相混溶的溶剂中有不同的分配系数，以不同程度分配在两相中，其同的分配系数，以不同程度分配在两相中，其中一个相不断地向前移动，同时不断添加新鲜中一个相不断地向前移动，同时不断添加新鲜溶剂进行提取，经过多次操作后即可将复杂混溶剂进行提取，经过多次操作后即可将复杂混合物分离。此法需要经过多次振摇提取，因而合物分离。此法需要经过多次振摇提取，因而逆流分配代谢是由大量容器管连接组成，采用逆流分配代谢是由大量容器管连接组成，采用自动操作、自动提取分离。逆流分配仪体积较自动操作、自动提取分离。逆流分配仪体积较大，比较复杂，在使用上受到一定限制大，比较复杂，在使用上受到一定限制 64溶剂 A溶剂 B总量64
37、32321616161688161644881212121244228812128822平衡后总量 32 32总量 64转移1转移3转移2转移4总量 16 32 16总量 8 24 24 8总量 4 16 24 16 4分管号码 1 2 3 4 5物质Y(Kd=1)的分配情况理论塔板决定层析效果理论塔板决定层析效果理论塔板数理论塔板数将将色谱柱色谱柱比作比作蒸馏塔蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相固定相占据，占据，另一部分空间充满另一部分空间充满流动相流动相。组分随流动相进入色谱柱
38、后，。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理理论塔板论塔板（theoretical plate），一个理论塔板的长度称），一个理论塔板的长度称为为理论塔板高度理论塔板高度（theoretical plate height）H。由于。由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。微小差异，仍然可以获得好的分离效果。理论塔板数（理论塔
39、板数（number of theoretical plate）又称理论塔片数，用）又称理论塔片数，用 n 表示：为表示：为完成某一指定分离要求所需理论塔板的完成某一指定分离要求所需理论塔板的数量，即组分流过色谱柱时，在两相间数量，即组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数。描述色谱柱效进行平衡分配的总次数。描述色谱柱效能的一项主要指标，当色谱柱长为能的一项主要指标，当色谱柱长为L时，时，则它的理论塔板数则它的理论塔板数 n 为：为：n=L/H 或或 H=L/n 当色谱柱长当色谱柱长L固定时，固定时，n 值越大，或值越大，或H值越小，柱效率越高，分离能力越强。值越小，柱效率越高，分离能力越
40、强。n 和和H可以等效地用来描述柱效率。可以等效地用来描述柱效率。高效液相色谱高效液相色谱法是以液体作为流动相，并彩用法是以液体作为流动相，并彩用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。HPLC适于分析分离适于分析分离不挥发和极性不挥发和极性物质。对样物质。对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，弥补了气相色谱法的不足。在目前性的限制，弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占占20%，而，而80%则需用高效液相色谱来分析。则需用高效液
41、相色谱来分析。HPLC配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合仪，数据处理的积分仪和记录仪等电子仪，数据处理的积分仪和记录仪等电子系统，系统，是一种先进的分析仪器，在生物是一种先进的分析仪器，在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。中发挥了重要作用。纸层析、薄层层析纸层析、薄层层析纸层析纸层析纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质
42、在某的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数。溶剂系统中的分配系数是一个常数。层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的纸重的22左右（其中约有左右（其中约有6的水与纤维素的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤低形成固
43、定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的使其上的溶质依据本身的分配系数分配系数在两相间进在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。分便实现了分离。离子交换层析离子交换层析泵的结构泵的结构HPLCHPLC层析系统层析系统 0.5-5 cm 5-100 cm
