1、 一、天然产物化学成分的预试验基本原理是根据各成分极性的不同，先系统地分成几个不同部分，然后利用显色反应或沉淀反应，或结合纸色谱、薄板色谱，定性判断各部分中可能含有的化合物类型。根据相似相溶的原理，极性大的成分在极性溶剂中溶解度大，极性小的成分则易溶于非极性溶剂。选择适当的溶剂，极性由小到大，或由大到小，可顺次将极性比较相近的成分分开。常用溶剂的极性次序为（由小到大）：石油醚环己烷苯氯仿（二氯甲烷）乙醚乙酸乙酯正丁醇丙醇、乙醇甲醇水KB）100，作一次简单萃取就可实现基本分离；10010，则需萃取10-12次；2时，需做100次以上萃取；1时，KAKB，作任意次分配也无法实现分离。对酸性、碱性
2、及两性有机化合物来说，pH值变化可以改变它们的存在状态（游离态或解离型），从而影响在溶剂系统中的分配比。以酸性物质为例，其在水中的解离平衡及解离常数K，可用下式表示：HA+H2OA-+H3O+当pH值3时，酸性物质多呈非解离状态（HA）、碱性物质则呈解离状态（BH+）存在；当pH值12，则酸性物质呈解离状态（A-）、碱性物质则呈非解离状态（B）存在。样品水溶液pH3，有机溶剂提取水相有机相pH12，有机溶剂提取糖类等强极性中性物质两性物质碱性物质pH9，缓冲溶液提取（NaHCO3水溶液）pH3，有机溶剂提取酸性物质（有机酸等）（酚类等）水相有机相水相有机相pH13，缓冲溶液提取水相有机相水相有
3、机相中性物质pH6，有机溶剂提取水相有机相酸性物质图2-5 利用pH梯度萃取分离物质的模式 逆流分溶法（counter current distribution，CCD）是一种多次、连续的液-液萃取分离过程。原理相当于多个分液漏斗相连接。现一般采用逆流分溶仪，该仪器为由上百个萃取单元组成的全自动连续液-液萃取装置。每个单元相当于一个分液漏斗。操作程序主要是振摇萃取静置分层两相分开转移再萃取。纸层析又叫纸色谱法，系以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。供试品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组成成分的位置。比移值原点中心至斑点中心的距离原点中心至展开剂前沿的
4、距离纸色谱 1）展开室 通常为圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖，应能密闭。2）点样器 常用具支架的微量注射器或定量毛细管,应能使点样位置正确、集中。3）滤纸 质地均匀平整，具有一定机械强度，不含影响展开效果的杂质；也不应与所用显色剂起作用。1）上行法 2）下行法（3）特殊纸色谱 1）反相纸层析 2）高温纸层析 3）盐析纸层析 定义：将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充在色谱管中，然后加入与固定相不相混融的另一相溶剂（流动相）冲洗色谱柱。这样，物质同样可在两相溶剂相对作逆流移动，在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。常用的载体主要有硅胶、硅藻土及纤维素粉等。分离水溶
5、性或极性较大的成分，固定相多采用强极性溶剂，如水、缓冲液等，流动相则用氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，称之为正相层析；分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸等时，则两相可以颠倒，固定相可用石蜡油，而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂，称之为反相层析。加压液相柱层析用的载体多为颗粒直径较小，机械强度及比表面积均大的球形硅胶微粒。按加压强弱可以分为：快速色谱（flash chromatography，约2.02105Pa）低压液相色谱（LPLC，5.05105 Pa）中压液相色谱（MPLC，5.05105-20.2105Pa）高压液相色谱（HPLC，20.2105Pa）减压液相柱层析是利用真空为动力来加速流动相的一
6、种色谱分离方法。减压液相色谱法具有设备简单、分离时间短、分离容量大等特点。常用的支持剂有硅藻土、纤维素、滑石粉等，最常用的固定相是甲酰胺。原理：多次分配的过程，分配系数(溶解度)不等实现分离。分类：正相色谱，反相色谱 正相色谱：水为固定相(硅胶载体)，有机溶剂为流动相，极性强的组分K（分配系数）大，Rf值小；反相色谱：烷基化学键合相为固定相，水-有机溶剂为流动相，极性强的组分K小，Rf值大。一、根据物质溶解度差别进行分离二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离四、根据物质分子大小进行分离五、根据物质解离程度不同进行分离六、其他分离方法 物理吸附、化学吸附
7、及半化学吸附 物理吸附也叫表面吸附，因构成溶液的分子（含溶质及溶剂）与吸附剂表面分子的分子间力相互作用所引起的。化学吸附如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝的吸附，或生物碱被酸性硅胶的吸附等，具有选择性，吸附十分牢固，有时甚至不可逆。半化学吸附，如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间氢键吸附，力量较弱，介于物理吸附与化学吸附之间。固液吸附时，吸附剂、溶质、溶剂三者统称为吸附过程中的三要素。极性吸附剂硅胶、氧化铝。具有特点：1）对极性物质具有强的亲和能力，故极性强的溶质将被优先吸附。2）溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出越强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。3）溶质即使被硅胶
8、、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂时又可被后者置换洗脱下来。非极性吸附剂活性炭。对非极性物质具有较强的亲和能力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力即随之减弱。从活性炭上洗脱被吸附物质时，洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素。极性判断：1）化合物的极性大小依化合物的官能团的极性大小而定。R-COOH Ar-OH H2O R-OH R-NH2，R-NH-R，R-N-RR R-CO-N-RR R-CHO R-CO-RR-CO-OR R-O-RR-XR-H 溶剂水溶度（g/100g）极性己烷1.880.007弱苯2.2
9、90.06乙醚（无水）4.471.3氯仿5.200.1乙酸乙酯6.113.0乙醇26甲醇31.2水81.0强表23 常见溶剂的介电常数 简单吸附，常见如在结晶及重结晶过程中加入活性炭进行的脱色、脱臭等操作，在物质精制过程中应用很广。注意，有时拟除去的色素不一定是亲脂性的，故活性炭脱色不一定总能收到良好的效果。一般需根据预试结果先判断色素的类型，再决定选用什么吸附剂处理为宜。吸附色谱法定义：是指用吸附剂作固定相，利用被分析组分对吸附剂表面吸附能力的差异和在流动相中溶解度的差异来进行分离分析的方法。按其操作方式可以分为柱层析色谱和薄层色谱。吸附色谱法常用吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺和活性炭等。色谱
10、柱为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂。操作步骤：吸附剂的填装 试品的加入 洗脱 干法干法将吸附剂一次加入色谱柱，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入洗脱剂；或在色谱柱下端出口处连接活塞，加入适量的洗脱剂，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。湿法湿法将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后加入洗脱剂将附着管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿管壁缓缓加入，注意勿使吸附剂翻起。或将供试品溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发
11、去尽使呈松散状，加在已制备好的色谱柱上面。洗脱 通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。玻板。要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。固定相或载体。最常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254；薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种。常见粘合剂：1015煅石膏，0.50.7羧甲基
12、纤维素钠水溶液。涂布器。点样器。展开室。薄层板制备 将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.20.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，后在110烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。点样 用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。展开 将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.51.0cm，密封室盖，待展开至规定距离，取出薄层板，晾干，按规定检测。显色和Rf值 Rf=展开后原点与斑点的距离/原点与溶剂
13、前沿间距离。也可以通过相对比移值对所得物质进行定性的分析，Rr=Rf(a)/Rf(s)=被测组分移动的距离/参考物质移动的距离 a-被分离组分，s-参考物质。Rr值的重复性和可比性都优于Rf。点样薄层板在不同的层析缸中展开的方式黄绿色棕褐色红色浅蓝色亮绿色紫罗兰色褐色化合物显色剂生物碱1.碘化铋钾试剂；2.碘蒸气黄酮类1.紫外线-氨熏；2.三氯化铝乙醇液蒽醌类1.乙酸镁甲醇液；2.5%氢氧化钾糖类邻苯二甲酸-苯胺强心苷1.氨胺T-三氯乙酸；2.Kedde试剂甾体1.茴香醛硫酸液；2.三氯化锑冰醋酸酚类1.三氯化铁水溶液；2.三氯化铁-铁氰化钾溶液 3.香草醛盐酸液；4.快速蓝盐-B酸类1.葡萄
14、糖苯胺；2.溴甲酚绿乙醇液表24 常见化合物的薄层色谱显色剂 吸附剂的用量。一般为样品量的30-60倍，样品极性小，难以分离者，吸附剂用量可适当提高至样品量的100-200倍。尽可能选择极性小的溶剂装柱和溶解样品，以利于样品在吸附柱上形成狭窄的原始谱带。洗脱所用溶剂的极性宜逐步增加，跳跃不能太大。实验室常用的混合溶剂如下所示：吸附柱色谱常用的混合溶剂（极性递增）己烷-苯，苯-乙醚，石油醚-乙酸乙酯，氯仿-乙醚，氯仿-乙酸乙酯，氯仿-甲醇，丙酮-水，甲醇-水 为避免发生化学吸附，酸性物质宜用硅胶作吸附剂、碱性物质则宜用氧化铝作吸附剂进行分离。通常在分离酸性（或碱性）物质时，洗脱溶剂中分别加入适量
15、醋酸（氨、吡啶、二乙胺），可收到防止脱尾，促进分离的效果。吸附柱色谱也可用加压方式进行。溶剂系统也可通过TLC进行筛选，一般TLC展开时使组分Rf值达到0.2-0.3的溶剂系统可选用为柱色谱分离该相应组分的最佳溶剂系统。聚酰胺吸附属于氢键吸附，特别适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。一般认为通过分子中的酰胺羰基CO与酚类、黄酮类化合物的酚羟基Ar-OH，或酰胺键上的游离氨基NH2与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。至于吸附强弱则取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。1.形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。OHHOOHOHOHOH 2.成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者
16、，其在聚酰胺上的吸附相应减弱。OHOHOHOHOHCOOHHOOH OOH3.分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之，则减弱。OHOH 一般情况下，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强，可大致排列成下列顺序：水甲醇丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液。聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的，适合于该类化合物的制备分离；对生物碱、萜类、甾体、糖类等其他极性与非极性化合物的分离也有着广泛的用途；对鞣质的吸附特强，近乎不可逆，故用于植物粗提物的脱鞣质处理特别适宜。大孔吸附树脂是一种不含交换基团的、具有大孔结构的高分子吸附剂，也是一中亲脂性物质。原理：大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相
17、结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或生成氢键的结果。筛选原理是由于其本身多孔性结构所决定。由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附脂上经一定的溶剂洗脱而分开。大孔吸附树脂多为白色的球状颗粒，粒度多为2060目。分为非极性和极性两大类。目前常用的为苯乙烯型和丙烯腈型，在树脂合成时根据需要引入极性基团则成为极性树脂从而增强吸附能力。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。对有机物的选择性较好，不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响。中药分离提取操作的基本程序：中药提取液通过大孔树脂吸附上有效成分的树脂洗脱洗脱液回收溶液药液干燥半成品。洗脱液：可使用甲醇、乙
18、醇、丙酮、乙酸乙酯等。应用：现已被广泛应用于苷与糖类的分离，生物碱的精制，多糖、黄酮、三萜类化合物的分离等。HPLC是在经典液相色谱基础上引入气相色谱的塔板理论，并采用了高压输液泵高压输液泵、高效固定相高效固定相和高灵敏度的检测器高灵敏度的检测器，具有分析速度快、分离效率高和操作自动化特点的一种色谱技术。常用的HPLC检测器：紫外-可见分光检测器、示差折光检测器一、根据物质溶解度差别进行分离二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离四、根据物质分子大小进行分离五、根据物质解离程度不同进行分离六、其他分离方法 1.凝胶过滤法 2.透析法 3.超滤 1）原理：
19、凝胶过滤法也叫凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography，简称GPC法)，分子筛过滤、排阻色谱。其原理主要是利用具有网状结构的凝胶分子筛的作用，根据被分离物分子大小不同而分离。待分离系统中小分子物质直径比凝胶孔径小，可渗入凝胶微孔中，产生阻滞作用大、流程长、移动速度慢，最后流出，而大分子由于阻滞作用小，流程短，移动速度快，先流出。交联葡聚糖凝胶(Sephadex)以葡聚糖凝胶为原料，交联剂为环氧氯丙烷，在碱性条件下制成三维空间网状结构。目前市售SephadexG10至G200共有8种。G表示凝胶保水值，单位为ml/g干胶，G后面的数字代表凝胶吸水量的10倍。G-
20、25表示每克干胶膨胀时吸水2.5ml，G-200表示每克干胶膨胀时吸水20ml。Sephadex G-25中的OH经OCH2CH2CH2OH 取代后得到的产物。与Sephadex G比较，Sephadex LH-20分子中 -OH总数没有改变，但碳原子所占比例却相对增加了。因此与Sephadex G 仅有亲水性不同，它不仅可在水中应用，也可以在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用。琼脂糖是从天然琼脂中分离制备的链状多糖，结构单元为交替排列的D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖。琼脂糖链间以氢键相互连接形成琼脂糖束，经凝聚处理后构成琼脂糖凝胶。琼脂糖的商品名因生产厂家不同而异。瑞典的商
21、品名为Sepharose；美国的为Bio-Gel A；英国的为Segavac；丹麦的为Gelarose。除Segavac外，都是悬浮于10-3mol/l EDTA和0.02%NaN3（叠氮化钠）溶液中以湿态形式出售。Sepharose有三种型号：Sepharose 2B、4B和6B。数字表示凝胶中干胶的百分含量。从2B到6B，琼脂糖浓度逐渐增加，筛孔逐渐减小，机械强度依次增大。聚丙烯酰胺凝胶是全合成的凝胶。商品名Bio-Gel P-。P-后的数字乘以1 000，表示该种凝胶可应用于分离蛋白质的最高分子质量。P后面的数字越大，越适合于大分子的分离。透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大
22、分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。透析袋1)原理 超滤是一种以压力为驱动力，利用超滤膜的筛分作用，根据相对分子质量的不同来进行分离的膜技术。超滤膜的孔径通常在1300nm之间，选用不同孔径的超滤膜，可以将相对分子质量在几百到几十万之间的物质进行分离。待分离组分的大小一般要相差10倍以上。2)超滤膜的选择 截留分子量的选择 膜的孔径或截留分子量的选择虽然主要是根据被被分离物的相对分子质量分离物的相对分子质量。超滤膜的选择
23、膜表面是液体和膜相互作用的界面，溶质和膜之间有静电相互作用或电荷转移反应，膜表面的极性、溶液的pH值等均会影响膜的分离效率。最好采用抗污性较好的膜材料，如聚丙烯腈、磺化聚砜膜等。3）超滤法的特点：选择性高，分离效率高。减少工序，缩短生产周期（不需加热浓缩），节 约原料，降低成本。物质不发生相变，常温操作，有效成分不被破 坏，能保持原配方的成分。去杂质效果好。除菌效果好。超滤后可得到无菌澄清的药液，代替加热灭菌。超滤柱提纯大分子物质示意图压力：6.91046.9105Pa一、根据物质溶解度差别进行分离二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离四、根据物质分子
24、大小进行分离五、根据物质解离程度不同进行分离六、其他分离方法 离子交换法 1.原理：以离子交换剂作为固定相，以水或含水溶剂作为流动相。当流动相流过交换柱时，溶液中的中性分子及与离子交换剂不能发生交换的离子将通过柱子从柱底流出，而可发生交换的离子则与交换基团进行离子交换并吸附到柱上，然后改变条件，用适当溶剂将其从柱上洗脱下来，即可实现物质分离。2.结构与性质 根据离子交换剂所含功能团的酸碱性，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两大类；根据交换剂的基质性质，可分为离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶三种。离子交换剂含有解离性离子交换基团（功能基团）的高分子物质，由两部分组成：一部分是大分子聚合
25、物基质主体结构，另一部分是具有荷电活性的功能基团。ClXNRRXClNR-R:HMSORMHSO-R:33-3-3阴离子交换阴离子交换阳离子交换阳离子交换 离子交换树脂中的主体结构树脂是人工合成的疏水性物质，如聚苯乙烯、聚苯酚磺酸、聚丙烯酸等。1）类型：A阳离子交换树脂这类交换树脂基质上共价结合的是带负电荷带负电荷的活性基团，即反离子为阳离子，能与溶液中带正电荷的物质进行交换。根据其活性基团解离度的不同，可进一步分成强酸型、弱酸型和中等酸型三类。强酸型：R-SO3H 中等酸型：R-COOH、R-PO3H2 弱酸型：R-OH、R-SHB、阴离子交换树脂这类交换树脂基质上共价结合的是带正电荷带正电
26、荷的活性基团，即反离子为阴离子，能与溶液中带负电荷的物质进行交换。强碱型：含有季胺基团，通式为R-NRRROH中等碱型：主体结构上既结合强碱性基团又结合弱碱性基团弱碱型：含有伯胺、仲胺或叔胺基团，通式R-NH3OH、R-NH2ROH、R-NHRROH 2）性质 A颜色与形状黑色、黄色和乳白色等。外形大部分呈珠状，大小以目表示。B交换容量离子交换树脂与溶液中的离子或离子化合物进行交换的能力，它取决于单位质量（或体积）的树脂中活性基团的数目，单位为mmol/g（ml）树脂。3）应用 A用于不同电荷离子的分离。B用于相同电荷离子的分离。离子交换纤维素是由纤维素作主体结构，纤维素上的OH基团被功能团取
27、代而形成的，属于亲水型离子交换剂。可分为阳离子型和阴离子型。离子交换纤维素层析的原理和离子交换树脂相似，在植物成分分析方面的区别在于：前者适用于蛋白质、酶等活性大分子；后者适用于aa、肽、核苷酸、生物碱、甾醇、萜类、黄酮等中小分子，以及大分子溶液中表面活性剂、尿素及两性电解质的去除。离子交换凝胶与离子交换纤维素相同，属于亲水型离子交换剂。离子交换凝胶兼有分子筛和离子交换两种功能，总交换量比离子交换纤维素大，因此，在某些情况下，分离能力超过了由单一树脂或纤维素构成的离子交换剂。不足之处：当洗脱溶液的pH值和离子强度改变时，大部分离子交换凝胶的基质体积会发生较大的变化，造成柱体积压紧、流速降低。一
28、、根据物质溶解度差别进行分离二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离四、根据物质分子大小进行分离五、根据物质解离程度不同进行分离六、其他分离方法 主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或激素。当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相pH值或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。1.亲合色谱 超临界流体萃取法是利用超
29、临界状态下的流体为萃取剂，从液体或固体中萃取中药材中的有效成分并进行分离的方法。CO2因其本身无毒、无腐蚀、临界条件适中（7.488Mpa，304.15K）的特点，成为超临界流体萃取法最为常用的超临界流体（SF）。现已成功利用超临界流体提取法提取到了青蒿素，延胡索乙素，薯蓣皂苷、玫瑰精油、卵磷脂等。从天然物中分离到化合物单体后，需进行结构鉴定，从天然物中分离到化合物单体后，需进行结构鉴定，方法有波谱法，化学法，文献调研等。方法有波谱法，化学法，文献调研等。1)1)纯化和干燥化合物的样品纯化和干燥化合物的样品 2)2)通过文献调研，理化常数和化学定性分析等初步通过文献调研，理化常数和化学定性分析
30、等初步判断结构类型判断结构类型 3)3)由波谱法等确定分子式，分子量，不饱和度；进由波谱法等确定分子式，分子量，不饱和度；进一步推出结构官能团推出结构片断或骨架推出一步推出结构官能团推出结构片断或骨架推出平面结构确定其构型，构象平面结构确定其构型，构象。第四节 天然产物化学成分的结构鉴定 1.检查样品有无均匀一致的晶形，有无明确尖锐的熔点等；2.薄层层析TLC（荧光、显色剂）。一般，只有当样品在三种展开系统中均呈现单一斑点时方可确认其为单一化合物，个别情况下，甚至须采用正、反相层析两种方式加以确认。3.气相色谱GC和HPLC是一种很好的检测方法，省时、灵敏度高。1.已知化合物鉴定的一般程序1）
31、测定样品的熔点，与已知品的文献值对照，比较 是否一致或相近2）测定样品与标准品的混熔点，所测熔点值不下降3）将样品与标准品共薄层色谱或纸色谱，比较其Rf值是否一致4）测定样品的红外光谱图，与标准品的红外光谱或标准谱图进行比较，是否完全一致。2.未知化合物结构研究 1）方法注意样品在提取、分离过程中的行为。测定有关理化性质，如不同pH值、不同溶剂中的溶解度及层析行为、灼烧实验、化学定性反应等。结合文献调研。2.未知化合物结构研究 2）程序：进行检识反应，初步推断化合物的类型 化合物分子式的测定a、元素分析结合分子量测定 b、同位素峰法c、高分辨质谱 计算不饱和度 r+db，推测可能存在的基团 测
32、定有关光谱，如IR，UV，1H-NMR，13C-NMR来确定其结构 结构验证：a.根据初步推断的结果与已知化合物进行比对；b.测定NOE谱或二维核磁共振谱；c.进行X-ray d.人工合成。1.确定分子式、计算不饱和度1）元素定量分析+分子量测定 一般在进行元素定量分析前应先进行元素定性分析，找出分子中存在哪几种原子。进行元素定量分析，找出各种原子的相对数目，即决定经验式（实验式）。测定分子量，确定各种原子的确实数目，给出分子式。例如：从刺果甘草根中分得的某白色针晶，该物质只含有C、H、O三种元素，元素定量分析得到以下结果C：79.35%，H：10.21%，EI-MS测定其分子离子峰（m/z）
33、为456，试确定该化合物的分子式。解：（1）从100中扣除C、H后得O=10.44%；（2）C：H：O=79.35%/12.01：10.21%/1.008：10.44%/16.00=10.16：15.58：1 按倍比定律，原子间的化合一定是整数的，所以最终确定为（C10H16O）n；（3）因为EI-MS测定其分子离子峰（m/z）为456，C10H16O 的分子量为152，所以n=456/152=3；（4）该化合物最终确定为C30H48O3。已知组成有机化合物的主要元素（F、P、I除外）均由相对峰度比一定的同位素所组成，且重元素一般比轻元素重1-2个质量单位。故由重元素组成的分子也将较轻元素组成
34、的正常分子重1-2个质量单位。所以，在大多数有机化合物的MS图上，除分子离子峰M+外，常能看到M+1，M+2的同位素峰。对一定的化合物来说，其M、M+1及M+2峰的相对强度始终为一定值（含Cl、Br除外）。高分辨质谱（HR-MS）可将物质的质量精确测定到小数点后第3位。例如：C8H12N4、C10H12N2O、C10H12O2、C10H16N2四种化合物，它们的相对分子质量虽都是164，但精确质量并不相同，在HR-MS上可以很容易地进行分别。C8H12N4 164.1063 C10H12N2O 164.0950 C10H12O2 164.0837 C10H16N2 164.1315 r+db=
35、IV-I/2+III/2+1 I 为一价原子（如H、D、X）的数目；III 为三价原子（如N、P）的数目；IV为四价原子（如C、Si）的数目。O、S等二价原子与不饱和度计算无关，故不予考虑。200400nm为紫外谱区，400700nm为可见谱区。（1）UV中常用的光谱术语：max和min表示样品分子的最大和最小吸收波长，max摩尔吸收系数；发色团：指能吸收光子能量并产生跃迁的不饱和共价键基团，这些基团一般带有电子，如：C=C、C=O、C=N、N=N、N=O等；助色团：指在200nm以上没有吸收，但与发色团相连后可使发色团的最大吸收峰向长波长方向移动，吸收强度也有所增加的基团，一般为带有n电子的
36、原子或官能团，如OH、NH2、Cl、SH等；红移：使吸收峰向长波长方向移动的现象；蓝移：使吸收峰向短波长方向移动的现象；增色效应：使吸收强度增加的效应；减色效应：使吸收强度减弱的效应。一般采用紫外分光光度计。1）无共轭体系的简单分子 饱和碳氢化合物：这类化合物分子中只有电子，在 近紫外区无吸收。带杂原子的饱和分子，仅少数化合物的吸收带落在近紫外区 具孤立发色团分子：孤立发色团均含有双键，若再有n电子（如羰基）时，则会发生跃迁，从而产生一系列孤立发色团的特征吸收带。与助色团相连的不饱和键：当助色团与不饱和键相连时，由于杂原子，如N、O、Br等上的孤对电子可与不饱和键中的电子云发生p-共轭，所以吸
37、收带红移，同时吸收强度也增加。2)共轭分子 丙烯和胡萝卜素分子都含有碳碳双键，但前者无色，后者则为桔黄色。why？原来，随着共轭烯键的增加，电子不仅可在孤立双键之间活动，而且可在不同共轭程度的多烯范围内活动，这也是多烯类化合物常出现一系列吸收峰的原因所在。由于紫外光谱的吸收波长呈现比较强的规律性，故共轭多烯的紫外吸收可从理论上进行预测，如Woodward-fieser规则、Fieser-Kuhn规则等。1）成分的鉴定A.骨架类型的判断 两个指标max及max a若在200-400nm之间无吸收，则说明该分子为饱和化合物或仅带有孤立C=C的非共轭分子。b若在270-350nm之间有弱吸收（=10
38、-100），且在200nm以上无其他吸收，表明该化合物可发生n-*跃迁。据此可推测分子中有-C=O、-C=C-O、-C=N-、-C=C-N等带有孤对电子的未共轭的发色团。A.骨架类型的判断c若紫外图谱上有许多峰，且某些峰甚至出现在可见光区，则该化合物可能具有长链共轭系统或稠环芳烃。d若波长吸收峰在250nm以上，max在1000-10000之间，则化合物一般含有芳香系统。e若波长吸收峰的强度max在10000-20000之间，标明分子中具有、-不饱和酮或共轭烯烃。a酮式和醇式的判断 如：苯甲酰丙酮有两个异构体，它们的紫外吸收完全不同OOOHO max 247nm max 310nmb.顺式和反
39、式的区别 2）样品中杂质的检查 紫外光谱可用来测定试样中具有紫外吸收的微量杂质。紫外分析也是药检部门的常用方法之一。例如，肾上腺素中常常混有其合成原料肾上腺酮，此杂质的含量过高会影响肾上腺素的疗效，药检机关就是采用紫外光谱来检测肾上腺酮的含量的。3）在定量分析中的应用 利用紫外光谱进行定量分析的前提是样品必须在紫外-可见光区有明显的吸收，其原理基于朗伯-比尔定律，即样品在某波长处的吸收强度与所测样品的浓度成正比A=cl。分子中价键的伸缩及弯曲振动将在光的红外区域，即4000-625cm-1处引起吸收。测得的吸收图谱叫红外光谱IR(Infrared Absorption Spectroscopy
40、)。特征谱带区指纹区发生在40001500cm-1的吸收峰比较稀疏，容易辨认，且由化合物中主要官能团产生的吸收。发生在1500600cm-1的吸收峰。比较密集，犹如人的指纹，故称指纹区。特征区和指纹区细分为八个重要区段（cm-1）37503000 OH，NH；33003000 C-H的不饱和键伸缩振动，CH（CC-C，C=C-H，Ar-H）；30002700 C-H的饱和键伸缩振动，CH(-CH3，-CH2,CH，H-C=O)；25002000 叁键和累积双键的伸缩振动区，CC，CN，-CC-C-；19001650 C=O（酸、醛、酮、酯、酸酐、酰胺）；16801500 C=C，C=N（脂酚、
41、芳香、16001500比较强的苯环骨架振动）；14751300 C-H（面内）；1000650 C=C-H，Ar-H（面外），C-H的弯曲振动。1）定性分析已知物标准品对照法和标准图谱查对法 2）定量分析符合朗伯特-比尔定律 3）结构测定主要用于判断分子中官能团的存在及其所处状态 质谱可用于确定分子量、求算分子式和提供其他结构信息。常用的质谱是电子轰击质谱EI-MS、电喷雾质谱ESI-MS、快速原子轰击质谱FAB-MS，另外还有化学电离质谱CI-MS、场致电离FI-MS、场解析电离FD-MS等。质谱的裂解规律：中性分子的电子数为偶数，失去一个电子后形成的离子的电子数必为奇数，带奇数电子的离子用
42、“+”表示。此外，电荷的位置要尽量标识清楚。一般的，有机物失去电子从易到难的顺序为：杂原子上的孤对电子共轭电子电子电子。因此，电荷的位置多在杂原子或不饱和键上。1）简单裂解简单裂解 只涉及到一个共价键的断裂，根据断裂键与官能团的相对位置，简单裂解又可分为-裂解、-裂解和-裂解等。-裂解指具有正电荷的官能团的原子和-碳原子之间的断裂，如：OO+CH3+-裂解指-与-碳原子之间的裂解+RH2C CH2OHR CH2+H2C OH RDA裂解为一些不饱和环状化合物的一类重要的裂解反应，其裂解过程是Diels-Alder成环反应的逆反应。逆Diels-AlderDiels-Alder+二烯碎片单烯碎片
43、 核磁共振是由于自旋核吸收一定能量从低能状态跃迁到高能状态引起的。核磁共振可提供核与核之间相对关系的信息，这些信息对化合物分子的结构测定很有意义。1HNMR13C-MNR2D-NMR主要分类 1H-NMR测定中通过化学位移、谱线的积分面积以及裂分情况（重峰数及偶合常数J）可以提供分子中H的类型、数目及相邻原子或基团的信息，对天然产物的结构测定具有十分重要的意义。化学位移值范围一般为0-12ppm sp3杂化碳上的氢，即饱和烷烃中的氢的0-2之间，且大致按照环丙烷CH3CH2CH的顺序依次增大。sp2杂化碳上的氢指烯氢和苯环上的氢，烯氢的化学位移在4.5-7.0之间，芳氢及，-不饱和羰基系统中位
44、氢信号在6.0-8.5之间，醛基氢在9.0-10.0。sp杂化碳多指炔碳，有时也指叠烯碳，如丙二烯CH2=C=CH2。炔氢及炔键上甲基的化学位移一般都在1.7-2.3之间。活泼氢，判断某信号是否源于活泼氢时，最常用的方法就是在样品管中加入一滴重水再记录图谱看该峰是否消失。R-OH（0.5-5），Ar-OH游离（4.0-8.0），Ar-OH分子内缔合（10.0-15.0）。已知磁不等同的两个或两组1H核在一定距离内会因相互自旋偶合干扰而使信号发生分裂，表现出不同分裂，如s（单峰）C-C，d（二重峰）C CH,t（三重峰）C-CH2,q（四重峰）C-CH3,m（多重峰）等。遵循n+1 规则当某核同
45、时与n个邻近的核偶合且偶合常数相等时，则该核的信号会裂分成n+1个小峰。可用来判断基团之间的位置，对芳环而言，邻位偶合常数最大，一般为J=6.0-9.4Hz，间位偶合常数次之，一般为J=1.0-3.1Hz，对位偶合常数最小，一般为J=0-1.7Hz 1H-NMR上积分面积与分子中的总质子数相当，当分子式已知时，就可以算出每个信号所相当的H数。测定样品所用溶剂及所需要的条件测定样品所用溶剂及所需要的条件：对样品有足够的溶解度。与样品不发生化学反应。溶剂的吸收峰对样品信号没有干扰。常用氘代溶剂有CDCl3、CD3OD、DMSO、CD3COCD3、氘代吡啶等。1H-NMR3H339H2H1H至少19
46、个HOOCH3OHH3COCH3OOCH3ONH21HBr s2HBr s1H化学位移积分面积噪声去偶碳谱 DEPT 也叫全氢去偶或宽带去偶。图谱上碳的信号均是单峰。另外，因照1H后产生的NOE效应，连有H的13C信号强度将会增加，季碳信号因不连有H，信号比较弱。DEPT是无畸变极化转移增益的简称。当=135时，CH3、CH向上出峰，CH2则向下出峰，由此即可将全去偶碳谱中各个碳原子的类型确定下来。常用碳谱分类 13C-NMR化学位移的幅度很宽，约为200个ppm。1）碳原子杂化状态。一般情况下，sp2杂化碳的共振信号出现在较低场，在大多数的化合物中为120-240；sp杂化碳次之，共振吸收在
47、70-110之间；sp3杂化碳共振信号出现在最高场，范围在-20-100之间（TMS-四甲基硅烷作标准）。2）诱导效应。诱导效应主要是指由于电负性取代基的吸电子作用，碳原子p轨道上的电子云向电负性基团方向移动，从而产生的去屏蔽效应，化学位移值向低场移动。例如苯环上连有-OH，苯环碳为127.8，接电负性基团OH后，向低场位移了26.6，变成154.4。3）共轭效应 在共轭体系中，多重键由于具有非定域性质，从而使中心碳原子受到屏蔽的现象称为共轭效应。O201.6O192.4O190.7伯碳-CH34个叔碳CH羰基碳无畸变极化转移增益实验无畸变极化转移增益实验DEPT13513C-NMR 1）HM
48、QC（异核多量子相干谱）。主要显示的是碳氢之间的一键相关C-H，也称作13C-1H COSY，为有机分子中C、H信号的准确归属提供科学的依据。2）HMBC（异核多键相干谱）。主要显示的是碳氢之间二键至四键相关C-C-H。3）1H-1H COSY是指同一个偶合体系中质子之间的偶合相关谱，它主要研究1H同核偶合体系。4）NOE和 NOESY谱。NOE效应可以提供两核的空间距离信息，对化合物的解析，尤其对立体化学问题的解决有重要意义。NOE增益效应实验分为一维NOE差谱和二维NOESY谱两种。HMQC 异核多量子相干谱2.125.726.466.78 6.793.73,3.69,3.66OOCH3O
49、HH3COCH3OOCH3ONH2346572643722.052.756.156.6105.6 106.0106.1108.05-CH37-OCH33-OCH33-OCH3H-4C-4H-6C-6H-4C-4H-6C-6C-H1）做出质谱，确定该物质的分子量；2）做出1H-NMR谱，确定该化合物的氢原子数；3）做出13C-NMR谱，确定碳的总数；从而确定该物质的分子式；4）做出DEPT谱，确认伯、仲、叔、季碳的骨架单元；5）做出13C-1H相关谱（HMQC），确定与碳直接相连的质子；6）做出1H-1H 化学位移相关谱（COSY），找出各氢之间的连接及偶合关系，确认可能的结构单位；7）做出异核
50、多键远程相关谱（HMBC），将可能的结构单元相连接；8）做出空间效应谱（NOESY），确认原子间的空间位置；9）对分子结构进行全面确认。测定化合物在紫外及可见光区（200-700nm）的旋光，然后以比旋光度或摩尔比旋光度对波长作图，即得到的谱线即为旋光分散谱，简称旋光谱（ORD）。光学活性分子中如果还有发色团时，则产生异常的旋光光谱，出现峰和谷，得到所谓Cotton效应谱线。旋光光谱及其Cotton效应谱线特征与分子的立体化学结构（构型、构象）有重要关联，可用于确定未知化合物的立体结构。当通过上述波谱仍无法确定化合物的结构时，可培养化合物的单晶，利用单晶X-衍射技术来获得该物质的骨架结构。X-
