1、分子生物学技术在AML规范化诊断中的价值陈陈 苏苏 宁宁苏州大学附属第一医院苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所江苏省血液研究所v急性白血病的分型vAML的诊断技术及进展vAML的细胞和分子遗传学异常vAML的微小残留病检测2011年美国发病率和死亡率最高的10种肿瘤类型CA Cancer J Clin 2011CA Cancer J Clin 20112011年美国血液肿瘤预期发病率和死亡率发病率：淋巴瘤发病率：淋巴瘤(NHLHL)白血病白血病(CLLAMLALLCML)MM死亡率：白血病死亡率：白血病(AMLCLLALLCML)淋巴瘤淋巴瘤(NHLHL)MM2007年美国各年龄和性别组报告
2、死亡数排名前五位的 肿瘤类型CA Cancer J Clin 2010中国白血病发病率中国白血病发病率v 白血病发病率:2.1-6.9/10万v AML(1.85/10万)v ALL(0.69/10万)v CML(0.36/10万)v CLL(0.05/10万)日本白血病发病率日本白血病发病率v 2001年全国白血病中心v AML(1.2-2.9/10万)v ALL(0.5-1.5/10万)v CML(0.3-1.1/10万)v CLL(0.1-0.8/10万)v 1827年，法国的Alfred Velpeau 描述第一例白血病v 1847 年，Virchow首次提出了“白血病”这个名称v 1
3、976年，法、美、英3国7位血液学家以光镜下的形态为主，参照细胞化学染色，制定了FAB分型标准，标志着现代白标志着现代白血病诊断与分型的开端血病诊断与分型的开端 v 80年代末至90年代初，随着免疫学、细胞遗传学和分子生物学理论和技术的发展，出现了MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学）分型v WHO造血和淋巴组织肿瘤分类方案（2001，2008）FAB分型及WHO分类vFAB：主要建立在形态学基础上vWHO(2001和2008)p骨髓或外周血原始细胞比例20%p将一些有明确诊断及预后指导意义的细胞或分子遗传学异常作为诊断和分型的重要标志p将患者诊断之前的疾病状态和治疗措施纳入考量F
4、AB和WHO分类方案的主要区别急性白血病的WHO分型v急性髓细胞白血病（AML）和相关肿瘤 v系列不明的急性白血病（ALAL)v前体淋巴肿瘤pB淋巴母细胞白血病/淋巴瘤pT淋巴母细胞白血病/淋巴瘤急性髓细胞白血病（AML）和相关肿瘤 v伴再现性遗传学异常的AMLv伴MDS相关改变的AML p继发于MDS或MDS/MPNp伴有MDS相关细胞遗传学异常p2或3系50%以上的细胞有发育异常v治疗相关性AML v不另作分类的AMLv髓细胞肉瘤vDowns综合征相关髓系增生疾病v母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤伴再现性遗传学异常的AMLAML with t(8;21)(q22;q22)RUNX1-RUNX1
5、T1AML with inv(16)(p13.1q22)or t(16;16)CBFB-MYH11APL with t(15;17)(q22;q12)PML-RARAAML with t(9;11)(p22;q23)MLLT3-MLLAML with t(6;9)(p23;q34)DEK-NUP214AML with inv(3)(q21q26.2)or t(3;3)RPN1-EVI1AML-M7 with t(1;22)(p13;q13)RBM15-MKL1?AML with mutated NPM1?AML with mutated CEBPA通常通常AML的诊断标准，原始细胞比例的诊断标
6、准，原始细胞比例20%，但如果，但如果t(8;21)、t(15;17)或或inv(16)阳性，则不论原始细胞比例为多少，阳性，则不论原始细胞比例为多少，AML诊断成立诊断成立 急性髓细胞白血病微分化型(M0)急性髓细胞白血病未成熟型(M1)急性髓细胞白血病成熟型(M2)急性粒单核细胞白血病(M4)急性单核细胞白血病(M5)急性红白血病(M6)急性巨核细胞白血病(M7)急性嗜碱粒细胞白血病(ABL)急性全髓增殖性疾病伴骨髓纤维化不另作分类的AML急性白血病的WHO分型v急性髓细胞白血病（AML）和相关肿瘤 v系列不明的急性白血病（ALAL)v前体淋巴细胞肿瘤pB淋巴母细胞白血病/淋巴瘤pT淋巴母
7、细胞白血病/淋巴瘤急性白血病的WHO分型v急性髓细胞白血病（AML）和相关肿瘤 v系列不明的急性白血病（ALAL)v前体淋巴细胞肿瘤pB淋巴母细胞白血病/淋巴瘤pT淋巴母细胞白血病/淋巴瘤vB淋巴母细胞白血病/淋巴瘤p无法分类的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤p伴有再现性遗传学异常的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤t(9;22)(q34;q11)BCR/ABLt(v;11q23)如t(4;11)如MLL/AF4t(12;21(p12;q32)TEL/AML1t(1;19)(q23;p13)E2A/PBX1t(5;14)(q31;q32)IL3-IGH超二倍体核型亚二倍体核型vT 淋巴母细胞白血病/淋巴瘤骨
8、髓淋巴母细胞骨髓淋巴母细胞20%且无髓外肿块，如伴有且无髓外肿块，如伴有t(12;21)、t(1;19)等等 B淋巴淋巴母细胞白血病特征性的细胞遗传学异常，可诊断为母细胞白血病特征性的细胞遗传学异常，可诊断为B淋巴母细胞白血病淋巴母细胞白血病v急性白血病的分型vAML的诊断技术及进展vAML的细胞和分子遗传学异常vAML的微小残留病检测急性白血病的诊断和分型依赖于多种检测方法的联合使用v形态学：外周血片、骨髓（涂片活检）v细胞化学染色v免疫表型检测：多参数流式细胞仪v细胞遗传学检测p常规核型分析pFISH、CGH、SKY、染色体涂染v分子遗传学检测p融合基因检测（RT-PCR）：PML-RAR
9、A、AML1-ETO、CBFB-MYH11、MLL-、BCR-ABLp基因突变：FLT3-ITD、CEBPA、NPM、TET2、IDH1、NOTCH1、IKZF1、FBXW7p拷贝数变化（CNV）:array-CGH、SNP-arrayp高通量测序技术1950196019701980199020002010确定染确定染色体数色体数目目=46发现发现Ph；发现发现+21各种显带技术各种显带技术出现；发现多出现；发现多数数AL患者伴患者伴有染色体异常有染色体异常FISH出现；出现；阐明某些染阐明某些染色体异常的色体异常的分子学改变分子学改变SKYCGHPCR技术技术FLT3-ITD(1996)c-
10、KIT突变（突变（1993）.芯片技术：芯片技术：cDNA arrayArray-CGH、SNP-array、测序技术的发展测序技术的发展大量基因突变的发现：大量基因突变的发现：JAK2、NPM、CEBPA、PAX5、IKZF1、FLT3、RUNX1、WT1、RAS、NOTCH1.新一代高新一代高通量测序通量测序技术；各技术；各种遗传学种遗传学改变间的改变间的相互作用相互作用白血病遗传学研究的历史G 带带labeldenatureXXXXXXdenatured chromosomesAnneal/hybDNARP11-438N5G248P8432B2der(X)normal(11)WCP3WC
11、P5FISH-2p,-3p,+3q23-q29(3q25),-4,+5,-7p15-p22,+7p11.2,-8p,-8q11.2-q21.2,+8q21.3-q23,-8q24,-10,-12p,+12p11,-14q24-q32,-15,-16p,-1969-71,XXYY,+1,del(1)(p11),del(2)(p?),der(3)t(3;11)(p24;?),-4,-4,+6,+der(7)t(7;10)ins(10;8)(q22;?),-8,-8,ins(10;8)(q22;?),-10,+11,der(12)t(8;12)(?;p13)t(8;12)(?;?),der(14)t
12、(3;14)(?;q21),-16,+17,+18,-19cp5 CGHBAC arraySKYApproachOligosArray Oligos on glassv分辨率高，可发现5kb的CNVv样本要求量小：0.5ugv费用更低vAgilentvNimbleGenv不能检测单亲二倍体（UPD）、LOHv不能检测平衡性染色体重排APL：STAT5B-RARAT-ALL患者：UTX 缺失v分辨率高，Affymetrix、Illuminav可检出CNV、单亲二倍体、LOH，可推算样本嵌合度del(11)(p13p13):33.86Mb-36Mb Removal of NRE LMO2 acti
13、vationtelcene1e3-4e2e5e6LMO2NREproximal promoterdistal promoterbreakpoint测序技术的快速发展带来价格的下降19902001200720102012摩尔定律13年，年，30亿美元亿美元已经进入已经进入数千美元数千美元测一个全测一个全基因组的基因组的时代时代5色的MFC可部分弥补这一缺陷vLAIP在疾病发展过程中可发生转化，导致假阴性，应用多种抗体组合可减少假阴性一、免疫标志一、免疫标志二、染色体易位和融合基因二、染色体易位和融合基因三、基因突变三、基因突变四、异常表达的四、异常表达的AMLAML相关基因相关基因AML患者的患
14、者的MRD检测标志检测标志AML常见染色体异常t(8;21)10%t(15;17)8%inv(16)/t(16;16)5-10%11q23异常3-5%3045205单一异常：单一异常：45%2种异常：种异常：55%-5/5q-；-7/7q-；8；-Y；+11；+13；+21;+223q26；del(9q)t(6;9)；t(9;22)等等伴再现性遗传学异常的AMLAML with t(8;21)(q22;q22)RUNX1-RUNX1T1AML with inv(16)(p13.1q22)or t(16;16)CBFB-MYH11APL with t(15;17)(q22;q12)PML-RAR
15、AAML with t(9;11)(p22;q23)MLLT3-MLLAML with t(6;9)(p23;q34)DEK-NUP214AML with inv(3)(q21q26.2)or t(3;3)RPN1-EVI1AML-M7 with t(1;22)(p13;q13)RBM15-MKL1?AML with mutated NPM1?AML with mutated CEBPA一、免疫标志一、免疫标志二、染色体易位和融合基因二、染色体易位和融合基因三、基因突变三、基因突变四、异常表达的四、异常表达的AMLAML相关基因相关基因AML患者的患者的MRD检测标志检测标志v发生率高v在病程
16、中稳定存在v突变集中于热点部位v目前以NPM1基因A型突变最为常用基因突变在MRD检测中应用的要求PHF6基因突变类型AML患者常见基因突变及其预后意义NPM1基因突变类型一、免疫标志一、免疫标志二、染色体易位和融合基因二、染色体易位和融合基因三、基因突变三、基因突变四、异常表达的四、异常表达的AML相关基因相关基因AML患者的患者的MRD检测标志检测标志异常表达的异常表达的AML相关基因及其预后意义相关基因及其预后意义vMRD的概念及其检测技术的概念及其检测技术vAML患者的患者的MRD检测标志检测标志vAML患者患者MRD检测的临床意义检测的临床意义一、一、FCM检测检测LAIP二、二、R
17、Q-PCR检测遗传学标志检测遗传学标志AML患者患者MRD检测的临床意义检测的临床意义v美国西雅图移植中心v99例CR1接受同胞相合或无关供体HSCT的AML患者v移植前采用10色MFC检测骨髓标本MRD水平v75例患者未检出MRD，24例患者检出不同程度MRDp0.1%：14例v评估移植前MRD水平对预后的影响HSCT前MRD水平对AML患者预后的影响J Clin Oncol 2011;29(11):1190-1197.v2年总生存率：移植前MRD阴性患者显著高于阳性患者（76.6%vs 30.2%）v2年复发率：移植前MRD阴性患者显著低于阳性患者（17.6%vs 64.9%）v移植前MR
18、D水平有助于提示移植预后J Clin Oncol 2011;29(11):1190-1197.v荷兰、英国多中心协作组，94例儿童AML患者v68%的患者可检出2个以上LAIP，26%的患者可检出1个LAIP，6%的患者无LAIPFCM检测LAIP在儿童AML患者中的应用Leukemia(2010)24,15991606随着巩固治疗的进行，MRD的水平呈逐渐降低的趋势Leukemia(2010)24,15991606v诱导化疗后MRD水平可作为判断患者预后的独立因素，不同组别3年无病生存期或总生存期有显著差异Leukemia(2010)24,15991606一、一、FCM检测检测LAIP二、二
19、、RQ-PCR检测遗传学标志检测遗传学标志v 一项406例APL的动态RQ-PCR检测结果显示，MRD持续阳性或由阴性转为阳性为APL复发的指证v RQ-PCR检测PML-RARA基因的敏感性为10-3-10-5，分子复发患者PML-RARA基因的上升速度约为1 log/月v PB和BM的对照试验显示，BM检测的敏感性约为PB的1.5倍v 每隔3个月进行BM的PML-RARA检测是理想的MRD检测策略，可提前发现复发迹象，并尽早砷剂治疗，防止血液学复发RQ-PCR检测PML-RARA融合基因J Clin Oncol 2009;27:36503658.v MRC AML-15方案对APL患者每隔
20、3个月进行BM的PML-RARA检测，发现复发迹象后给予砷剂治疗，白血病复发率明显低于未常规进行MRD检测的AML 12方案组J Clin Oncol 2009;27:36503658.RQ-PCR检测PML-RARA融合基因可早期提示APL复发J Clin Oncol 2009;27:3650-3658.v动态RQ-PCR检测结果显示，AML1-ETO、CBFB-MYH11融合基因的表达水平与复发密切相关v经过巩固治疗后，在长期缓解的核心结合因子白血病患者中，常可检测到低水平的融合基因转录v以104个ABL1基因拷贝作为内参照，AML1-ETO融合基因低于10-12个拷贝预示患者可达长期缓解
21、RQ-PCR检测AML1-ETO、CBFB-MYH11对早期发现AML复发的意义Blood 2010;115:453-474v不同遗传学背景的AML细胞，其克隆增殖速度和分子水平复发的变化存在较大差异vOmmen HB等采用RQ-PCR技术对74例伴有分子标志（PML-RARA、AML1-ETO、CBFB-MYH11融合基因和NPM1突变）的复发AML患者进行MRD动态监测vCBFB-MYH11阳性克隆的倍增时间明显长于其他克隆AML分子水平复发的动态差异Blood 2010;115:453-474Ommen,H.B.et al.Blood 2010;115:198-205RQ-PCR检测显示
22、，AML1-ETO、CBFB-MYH11、PML-RARA、NPM突变等分子标志在血液学复发前可观察到逐渐升高的趋势，CBFB-MYH11白血病克隆的倍增时间（36天）长于AML1-ETO（14天）、PML-RARA（12天）、NPM突变（11天）v由于CBFB-MYH11相关白血病复发时白血病细胞增殖缓慢，有学者认为PB检测MRD足以提早发现复发迹象，并及时进行干预v近期的一项研究对53例AML1-ETO相关白血病患者进行了长期随访，结果显示巩固治疗期间及治疗完成后一年内，每3个月1次MRD检测足以早期鉴别出复发患者Blood 2010;115:198-205J Clin Oncol.201
23、0 Aug 10;28(23):3724-9.vAML1-ETO、CBFB-MYH11、PML-RARA等特异性的融合基因是最理想的MRD检测标志vRQ-PCR技术是检测上述标志的理想手段vWT1是常用于AML患者MRD检测的泛白血病标志v有关WT1是否是可行MRD标志仍存在不一致的结论pJ Clin Oncol 2008;26:5429-35pJ Clin Oncol 2008;26:4595-602pBlood 2009;113:4505-11v引起争议的部分原因是不同的引物设计方案v6.8%的AML存在WT1基因突变，且集中于3端，若将探针设计于WT1基因3端，可能导致假阴性结果WT1基
24、因作为MRD标志的价值Current Opinion in Oncology 2010,22:656663vCilloni等通过系统性的分析和评估，最终选定于WT1基因的5端设计引物，并对正常外周血、骨髓和白血病患者样本中WT1的表达进行了大样本的研究v504例AML患者的RQ-PCR检测结果显示，由于PB和BM的WT1基因表达背景较高，因此WT1基因作为MRD标志的敏感性并不高vWT1基因更适合作为诱导化疗后早期评价的指标，作为长期微量MRD动态检测的准确性有限Current Opinion in Oncology 2010,22:656663J Clin Oncol 2009;27:519
25、55201.标准DA（7+3）诱导化疗后WT1基因表达水平下降2 log的AML患者复发率显著升高（p=0.004）RQ-PCR检测显示，PB和PBSC的WT1基因表达为50/10000 ABL拷贝，BM为250/10000 ABL拷贝，由于PB的WT1基因表达背景低于BM（P25%的AML患者，少数初诊时检出FLT3-ITD的患者复发时原有的FLT3-ITD可缺如，并出现新的FLT3突变vRAS和WT1基因突变与FLT3-ITD类似，也有不稳定的特点，部分患者复发时突变可丢失vCEBP-a突变也较为稳定,，可能成为MRD标志之一，但GC含量高，扩增困难vNPM1基因突变在AML患者中检出率近
26、30%，80%为A型突变，且多见于正常核型AMLvNPM1基因突变是AML患者常见基因突变中最重要的MRD标志，敏感性可达10-5，疾病进展中也较稳定，提示其为白血病发生的早期事件vRQ-PCR检测NPM1突变可作为MRD的监测手段v采用RQ-PCR进行的动态监测显示，80%血液学复发患者在平均97天前检测到分子水平的复发pNPM1突变由阴性转为阳性p或NPM1突变阳性的患者拷贝数上升1个数量级Blood 2009,114:2220-2231.Blood.2011;117(9):2577-2584.vAML的诊断、治疗趋势：依赖于实验室检测、分型越来越细、治疗趋向个体化v细胞和分子遗传学异常对于AML患者的发病机制研究、诊断、分型、风险分层、预后判断和MRD监测有重要意义v随着更多临床和实验室数据的积累，各种基因突变等分子遗传学异常也将在AML的诊断和临床治疗中发挥重要的作用结 语Thanks for your attention!
