1、病原细菌检验基础知识天津市动物疫病预防控制中心天津市动物疫病预防控制中心郭立力郭立力一.概念 自然界中有一大类个体微小的生物，统称微生物。其中有一小部分对人或动植物有害，也可引起传染病，这类微生物称为病原微生物。细菌：细菌是一种单细胞微生物，个体微小，需要借用显微镜才能观察到。非致病菌：无致病性 致病菌：条件性致病菌、非条件性致病菌1.细菌的基本形态及排列细菌的基本形态及排列 1.1细菌的形态：细菌的外部形态比较简单，仅有三种主要类型：球状、杆状、螺旋状，故将细菌分为球菌、杆菌和螺旋菌。1.2 排列方式：细菌的排列方式是由细菌的繁殖来决定的。细菌的繁殖方式就是简单的裂殖，1变2个、2个变4个。
2、球菌：多数球菌为正圆形，根据分裂方向及分裂后的相连情况又可分为双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌及葡萄球菌。杆菌：菌体呈杆状，杆菌的分裂方向只有一个，故可分为单杆菌、双杆菌和链杆菌。螺旋菌：菌体呈弯曲或螺旋状，两端圆或尖。2.细菌的大小细菌的大小 各种细菌的大小，有一定的差别，长的可达80微米，短的仅0.2微米。细菌的大小，以生长在最适宜的温度和培养基中的年轻培养物为标准的。培养条件、染色方法、制片方法不同，菌体大小也略有差异。3.细菌的结构细菌的结构 细菌细胞很小，但结构复杂。基本结构：细胞壁、细胞质膜、细胞质、细胞核 特殊结构：某些细菌具有特殊的结构，如荚膜、芽孢、鞭毛二.细菌的基本检验技
3、术1.细菌的形态学检验细菌的形态学检验 形态学检查技术是细菌检验极为重要的手段之一，它有利于对细菌的初步认识，也是决定是否进行分离培养及生化反应鉴定的重要步骤，有时可通过形态学检查得到初步诊断，如炭疽等。1.1染色镜检染色镜检 细菌是无色、半透明、单细胞的微小个体，折光性弱，在显微镜下只能看见大致轮廓，给研究细菌形态、排列、结构带来一定困难。为此，用一些染料将细菌染上不同颜色后，载明视野显微镜下就可以观察到细菌的内部、外部结构及特殊构造。简单染色法：只用一种染料染色，只能观察细菌的形态，但不能鉴别细菌；鉴别染色法：采用两种以上染料染色，能够鉴别细菌和观察细菌的特殊构造，如革兰氏染色法、抗酸染色
4、法、特殊染色法。1.1.1 制片及染片 无论采用哪种染色方法，染色标本的制作过程是基本相同的。抹片：细菌培养物、体液（脓汁、血液、渗出液）、组织（心、肝、脾）。干燥：置空气中自然干燥 固定：将干燥好的片子经过加热或加化学试剂进行固定。固定目的是杀死细菌，改变其对染料的通透性，使之容易着色；固定原生质及细胞的其它结构；使细菌固定在玻片上，染色冲洗时不易被冲掉。染色：普通染色、特殊染色1.1.2注意事项 抹片时一定要薄；一定要自然干燥，不可用火焰；火焰固定时温度不可过高；用水冲洗时，水流不可过大；使用的载玻片要干净、无油。1-2%盐酸浸泡或用酒精棉球擦拭干净。1.2直接涂片镜检直接涂片镜检 主要用
5、于检查细菌的运动力。最常用的有湿片法、悬滴法。注意事项：取菌液要适量，不可外溢，不要产生气泡；一般不用油镜；缩小光圈，下降聚光镜，造成一个光线较暗的环境；避免环境污染。2.细菌的分离培养细菌的分离培养 细菌分离培养是细菌学的重要步骤。不同菌类培养所需要的条件及生长特性亦各有差异。有在通常条件下即可生长繁殖的需氧菌和有氧或无氧环境中都能生长的兼性厌氧菌；也有在无氧环境中才能生长的厌氧菌；少数菌尚需培养在适量的二氧化碳环境中才能生长。细菌分离培养的方法很多，下面着重介绍常用的几种方法。2.1 接种方法接种方法2.1.1平板划线接种法：平板划线接种是细菌分离培养的常用技术，主要使标本或培养物中的混合
6、细菌能在培养基表面分散生长形成单个菌落。连续划线分离法：接种环灭菌后挑取组织或菌液少许呈45度角，在平板1/5处轻轻涂布，然后左右来回以曲线形成划线接种。分区划线分离法：接种环于平板内分划五区，每划完一个区域烧灼环一次。2.1.2斜面接种法 保存菌种。2.1.3穿刺接种法 多用于保存菌种观察动力及做厌氧培养，亦可用于观察细菌对糖类的分解反应。2.1.4倾注平板培养法 细菌计数。2.2培养方法培养方法2.2.1一般培养法（又称需氧培养法）将已接种 好的平板、斜面和液体培养基等，直接置3537孵育箱进行培养。2.2.2二氧化碳培养法 将某些细菌置于含有CO2环境中3537进行培养。2.2.3厌氧培
7、养法 厌氧罐法、气袋法、气体喷射法、厌氧培养箱法。2.3 培养基培养基 培养基按其形态有固体、半固体和液体之分。固体培养基又分为平板、斜面和高层。按其用途可分为基础培养基、増菌培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基。鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤3.细菌的生化鉴定细菌的生化鉴定 细菌在代谢活动过程中，进行各种生物化学反应，这些反应几乎都靠各种酶系统来催化。不同种类的细菌所产生的酶类和活性上都有差异，因此在代谢过程产生分解产物和合成产物各不相同。细菌学检验工作中常利用这一特点，以生物化学方法来鉴别细菌，称此为生化试验。此类试验在细菌的鉴定中极为重要，最常用的生化反
8、应试验：糖发酵试验 V-P试验 甲基红试验 吲哚试验 尿素酶试验 溶血试验 血浆凝固酶试验等三.药敏试验基础知识 细菌对抗菌药物的敏感试验，通常简称为细菌的药敏试验，是在给病畜禽进行治疗前，测定细菌对药物的敏感性，这不仅有助于选择合适的药物，而且可提供药物用量的依据。某种细菌对药物的敏感度，是指抑制该菌生长所需的最低药物浓度。细菌在体外的敏感度和临床的疗效大体上是符合的，但也有不一致者。目前供药敏试验的方法很多，可归纳为两大类，即稀释法和扩散法两种。1.稀释法稀释法 将所选用的药物稀释成不同的浓度，作用于被检菌株。试管双倍稀释法 固体培养基稀释法 2.扩散法扩散法 细菌药敏试验的扩散法是将抗菌
9、药物置于已接种待测菌的固体培养基上（或内），抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感菌的生长，从而出现抑菌环（带）。由于药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度越低，故可根据抑菌环的大小，判断细菌对药物的敏感度。抑菌环（带）边缘的药物含量即该药物的敏感度。此法操作简单，容易掌握，但只用于定性。2.1纸片法纸片法 纸片法就是用含有一定量抗生素的药敏纸片，贴在已接种试验细菌的琼脂平板上，经37C培养后，抗生素浓度梯度通过纸片上弥散作用而形成，在敏感抗生素的有效范围内，细菌的生长受到抑制，在有效范围之外，细菌能够生长，故形成了一个明星的抑菌环，根据是否有抑菌环及抑菌环的大小来判定试验菌对某一抗生素是否
10、敏感及敏感的程度。2.1.1结果判定 20mm以上为极敏、15-20mm高敏、10-15mm中敏、10mm低敏、0不敏感2.1.2注意事项 选用特殊培养基MHA，如果没有，也可用鲜血琼脂培养基或营养琼脂培养基；接种菌的浓度不能太高，接种完细菌后经2-3分钟后，再贴药敏纸片；培养的温度要恒定，培养时间一般为12-24小时。2.2挖洞法挖洞法 挖洞法就是在已接种试验细菌的琼脂平板上挖洞，然后把药放在洞内，经37C培养后，抗生素浓度梯度通过扩散作用而形成，在敏感抗生素的有效范围内，细菌的生长受到抑制，在有效范围之外，细菌能够生长，故形成了一个明显的抑菌环，根据是否有抑菌环及抑菌环的大小来判定试验菌对某一抗生素是否敏感及敏感的程度。该方法主要适用于中草药煎剂、浸剂或不易溶解的药剂。
