1、白腐真菌生物技术与应用白腐真菌生物技术与应用环境工程专业选修课环境工程专业选修课主讲教师主讲教师 胡长庆胡长庆课程安排与考核方式课程安排与考核方式学时数学时数 32学时（包括讨论课时）学时（包括讨论课时）白腐真菌白腐真菌生物学基础生物学基础（理论基础）（理论基础）白腐真菌白腐真菌生物技术生物技术（应用基础）（应用基础）白腐真菌在白腐真菌在环境保护中环境保护中的作用的作用（应用实践）（应用实践）考核方式考核方式 闭卷考核闭卷考核成绩分配成绩分配 平时占平时占40%；考核占；考核占60%课程内容简介课程内容简介1白腐真菌生物学基础白腐真菌生物学基础 白腐真菌研究的历史、现状与未来白腐真菌研究的历史
2、、现状与未来 白腐真菌生物学（概念、分类、特点、生物降解等）白腐真菌生物学（概念、分类、特点、生物降解等）2白腐真菌生物技术白腐真菌生物技术 包括白腐真菌的培养、分离、酶技术、固定化技术等包括白腐真菌的培养、分离、酶技术、固定化技术等3白腐真菌在环境保护中的作用白腐真菌在环境保护中的作用 白腐真菌与水污染控制白腐真菌与水污染控制 白腐真菌与土壤污染控制白腐真菌与土壤污染控制 白腐真菌与重金属污染白腐真菌与重金属污染 白腐真菌与大气污染控制白腐真菌与大气污染控制 白腐真菌与有机固体废物资源化白腐真菌与有机固体废物资源化1白腐真菌生物学基础白腐真菌生物学基础 白腐真菌研究的历史、现状与未来白腐真菌
3、研究的历史、现状与未来白腐真菌研究探索的历史白腐真菌研究探索的历史 20世纪世纪70年代至年代至20世纪世纪90年代年代白腐真菌研究繁荣的现状白腐真菌研究繁荣的现状 以分子生物学为特征的理论研究以分子生物学为特征的理论研究白腐真菌研究发展的未来白腐真菌研究发展的未来 以工业化应用为终极目标以工业化应用为终极目标白腐真菌生物学白腐真菌生物学1、白腐真菌（、白腐真菌（White Rot Fungi）的概念）的概念白腐真菌的概念白腐真菌的概念不是生物学术语不是生物学术语，而是一种，而是一种功能描述的概念功能描述的概念纤维素纤维素木腐真菌木腐真菌Wood Rotting Fungi木质木质纤维素纤维素
4、Ligno-cellulose软腐真菌软腐真菌Soft rot Fungi褐腐真菌褐腐真菌Brown rot Fungi白腐真菌白腐真菌White rot Fungi木质素木质素半纤半纤维素维素多糖类多糖类软腐真菌：主要降解纤维素，对木质素降解软腐真菌：主要降解纤维素，对木质素降解 缓慢且不彻底。缓慢且不彻底。褐腐真菌：主要降解纤维素、半纤维素和部褐腐真菌：主要降解纤维素、半纤维素和部 分多糖类，几乎不降解木质素。分多糖类，几乎不降解木质素。白腐真菌：主要降解木质素和多糖类，对纤白腐真菌：主要降解木质素和多糖类，对纤 维素和半纤维素降解能力弱。维素和半纤维素降解能力弱。小结小结到底什么是白腐真
5、菌？到底什么是白腐真菌？白腐真菌的概念是从功能角度对其进行描述和界定的白腐真菌的概念是从功能角度对其进行描述和界定的白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真菌白腐真菌是一类能够引起木质白色腐烂的丝状真菌主要降解木质素和多糖类，对纤维素和半纤维素降解主要降解木质素和多糖类，对纤维素和半纤维素降解能力弱能力弱白腐真菌嗜热性好氧微生物白腐真菌嗜热性好氧微生物2、白腐真菌的分类地位与主要种类、白腐真菌的分类地位与主要种类2-1 白腐真菌的分类地位白腐真菌的分类地位生物界生物界细细菌菌古古菌菌真真核核生生物物“生物三界学说生物三界学说”示意图示意图 根据根据16S rRNA碱基序列特点，整个生物碱基序
6、列特点，整个生物界被划分为细菌（界被划分为细菌（bacteria）、古菌（）、古菌（archaea）和真核生物（和真核生物（eukaryotes）3大超界（大超界（Domain）白腐真菌属于白腐真菌属于真核生物超界真核生物超界。木腐真菌已知的有木腐真菌已知的有16001700种，种，大多数是担子菌和子囊菌。大多数是担子菌和子囊菌。软腐真菌：子囊菌、半知菌软腐真菌：子囊菌、半知菌褐腐真菌：大部分属于担子菌褐腐真菌：大部分属于担子菌白腐真菌：主要是担子菌，少白腐真菌：主要是担子菌，少 数为子囊菌数为子囊菌2-2 白腐真菌的主要种类白腐真菌的主要种类 已知白腐真菌种类有已知白腐真菌种类有400多种多
7、种，研究最为透彻，被称为白腐真菌研究，研究最为透彻，被称为白腐真菌研究模式菌种的是模式菌种的是黄孢原毛平革菌（黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium Burdsal）。黄孢原毛平革菌的生物学分类地位黄孢原毛平革菌的生物学分类地位担子菌门担子菌门Basidiomycota伏革菌科伏革菌科Corticiaceae非褶菌目非褶菌目Aphyllophorales层菌纲层菌纲Hymenomycetes原毛平革菌属原毛平革菌属Phanerochaete门门纲纲目目科科属属 黄孢原毛平革菌主要分布在北半球，其无性世代也被称为黄孢原毛平革菌主要分布在北半球，其无性世代也被称为多
8、粉侧孢霉（多粉侧孢霉（Sporotrichum pulverulentum Novobranova）。）。白腐真菌主要分布于白腐真菌主要分布于 8个菌属个菌属革盖菌属革盖菌属Coriolus原毛平革菌属原毛平革菌属Phanerochaete卧孔菌属卧孔菌属Poria层孔菌属层孔菌属Fomes多孔菌属多孔菌属Polyporus烟管菌属烟管菌属Bjerkandera侧耳属侧耳属Pleurotus栓菌属栓菌属Trametes研究较多，且表现出较强降解能力的菌种有研究较多，且表现出较强降解能力的菌种有20种种污色原毛平革菌污色原毛平革菌丝核菌丝核菌糙皮侧耳、平菇糙皮侧耳、平菇红孔菌红孔菌变色栓菌、云芝
9、变色栓菌、云芝韧革菌韧革菌漏斗状侧耳、凤尾菇漏斗状侧耳、凤尾菇多孔菌多孔菌毛栓菌毛栓菌短射脉菌短射脉菌裂褶菌、树花裂褶菌、树花金孢霉菌金孢霉菌烟管菌烟管菌短孢射脉菌短孢射脉菌维氏针层孔菌维氏针层孔菌拟蜡菌拟蜡菌香菇、椎茸香菇、椎茸毛革盖菌毛革盖菌木蹄层孔菌木蹄层孔菌射脉菌射脉菌3、白腐真菌的生理特点、白腐真菌的生理特点 白腐真菌是一个庞大的生物家族，各成员的生理特点会表现出很大白腐真菌是一个庞大的生物家族，各成员的生理特点会表现出很大的差异。的差异。笼统的谈白腐真菌的生理生化特征和性质，既不现实，也不准确。笼统的谈白腐真菌的生理生化特征和性质，既不现实，也不准确。黄孢原毛平革菌黄孢原毛平革菌
10、黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体，菌丝常为多核，少有隔膜，无黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体，菌丝常为多核，少有隔膜，无锁状联合锁状联合。多核分生孢子常为异核，担孢子却是同核体多核分生孢子常为异核，担孢子却是同核体。交配系统有。交配系统有同同宗交配和异宗交配宗交配和异宗交配。黄孢原毛平革菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。黄孢原毛平革菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。锁状联合锁状联合：担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母：担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母本，一个来自父本，当双核细胞进行细胞分裂时，在二个核之间外生一个短小本，一个来自父本，当双核细胞进行
11、细胞分裂时，在二个核之间外生一个短小弯曲的分枝，核移动，在二核之间生出一个突起如钩状，一个核进入钩，一个弯曲的分枝，核移动，在二核之间生出一个突起如钩状，一个核进入钩，一个留在菌丝。钩中保留一个核，一个往后移，菌丝中二个核一往前一个往后移钩留在菌丝。钩中保留一个核，一个往后移，菌丝中二个核一往前一个往后移钩状突起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中间有孔道），状突起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中间有孔道），在原分支外形成一隔膜，产生一个新细胞双核体，在分隔处保留一个桥形结构。在原分支外形成一隔膜，产生一个新细胞双核体，在分隔处保留一个桥形结构。分生孢子分生孢子
12、 无性繁殖，通过无性繁殖，通过菌丝体的裂殖产生。菌丝体的裂殖产生。担孢子担孢子 有性繁殖，必须通过菌丝体细胞的有性繁殖，必须通过菌丝体细胞的锁状联合过程。锁状联合过程。同宗交配和异宗交配同宗交配和异宗交配两条可互相两条可互相交配的单核交配的单核菌丝融合菌丝融合担孢子担孢子一次菌丝一次菌丝担孢子担孢子一次菌丝一次菌丝单核单核萌发萌发二次菌丝二次菌丝双核双核二次菌丝二次菌丝担孢子担孢子 只要同一孢子萌发的单核菌丝间的互相结合生出只要同一孢子萌发的单核菌丝间的互相结合生出双核菌丝后，就可形成子实体，这种现象称为双核菌丝后，就可形成子实体，这种现象称为同宗交同宗交配配。反之，只有异性的单核菌丝（不同孢
13、子），才能。反之，只有异性的单核菌丝（不同孢子），才能结合成双核菌丝，这种结合方式称为结合成双核菌丝，这种结合方式称为异宗交配异宗交配。3-1 白腐真菌的生长与代谢特点（黄孢原毛平革菌）白腐真菌的生长与代谢特点（黄孢原毛平革菌）营养期营养期初生生长初生生长白腐真菌白腐真菌繁殖期繁殖期次生生长次生生长停滞期停滞期对数期对数期细菌细菌静止期静止期 生长是线性的，生物量生长是线性的，生物量显著增加。显著增加。生长基本停滞，甚至发生生长基本停滞，甚至发生生物量的下降。生物量的下降。诱因：诱因：氮限制氮限制（nitrogen limitation,N-L）碳限制碳限制（carbon limitation
14、,C-L）N-L在木质素降解中的作用在木质素降解中的作用:实质上是白腐真菌在进化过程中对环境中氮缺乏的一种生理适应。实质上是白腐真菌在进化过程中对环境中氮缺乏的一种生理适应。C-L在木质素降解中的作用在木质素降解中的作用:主要是它和菌丝体质量的减少像偶联，从而启动了次生代谢。主要是它和菌丝体质量的减少像偶联，从而启动了次生代谢。与木质素降解有关的几个基本概念与木质素降解有关的几个基本概念营养限制营养限制N-L和和C-L木质素的降解木质素的降解木质素降解酶的合成木质素降解酶的合成要求要求木质素降解条件木质素降解条件Ligninolytic condition培养体系培养体系生理特征生理特征参与的
15、酶参与的酶木质素降解培养木质素降解培养Ligninolytic culture木质素降解活性（木质素降解活性（木质素降解活动木质素降解活动）Ligninolytic activity木质素降解酶木质素降解酶Ligninolytic enzyme白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢(cometabolized)过程过程木质素木质素完成降解过程完成降解过程白腐真菌白腐真菌？+生长底物生长底物Growth substrate白腐真菌白腐真菌共代谢的两种方式共代谢的两种方式1、某种生物将一种底物转化，却无法在这种底物上生长，即生物体、某种生物将一种底物转化，却无
16、法在这种底物上生长，即生物体不能利用这种底物氧化所产生的能量去维持生长。不能利用这种底物氧化所产生的能量去维持生长。2、一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用，对、一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用，对化合物进行降解。化合物进行降解。白腐真菌降解木质素属于何种方式？白腐真菌降解木质素属于何种方式？小结小结 3-1白腐真菌的生长与代谢特点白腐真菌的生长与代谢特点白腐真菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。白腐真菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。锁状联合锁状联合 分生孢子分生孢子 担孢子担孢子 同宗交配同宗交配 异宗交配异宗交配营养期白腐真菌生长是线性的，生物量
17、显著增加；营养期白腐真菌生长是线性的，生物量显著增加；繁殖期（子实体体生长期）生长基本停滞，甚至繁殖期（子实体体生长期）生长基本停滞，甚至发生生物量的下降。发生生物量的下降。氮限制（氮限制（N-L）碳限制（碳限制（C-L）白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢过程白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢过程共代谢的两种方式共代谢的两种方式3-2 白腐真菌在培养中的特点（黄孢原毛平革菌）白腐真菌在培养中的特点（黄孢原毛平革菌）这里的培养特指实验室中小规模的这里的培养特指实验室中小规模的,以研究基本规律为目的的培养以研究基本规律为目的的培养接种物接种物接种接种方式方式菌丝体菌丝体孢子孢子按干重或是湿
18、重计量按干重或是湿重计量优点：优点：能准确量化能准确量化 能保证碳、氮营养限制能保证碳、氮营养限制应用范围：应用范围：基础研究和应用研基础研究和应用研 究初期究初期接种方式：接种方式：制备孢子悬浮液制备孢子悬浮液 （spore suspension,SS）按）按培养基量成一定比例接入培养基量成一定比例接入关键是关键是接种物接种物的定量的定量培养方式培养方式(实验室规模的一般性培养实验室规模的一般性培养)按培养基的物理状态划分按培养基的物理状态划分半固体培养体系半固体培养体系固体培养体系固体培养体系液体培养体系液体培养体系静置培养静置培养Standing culture振荡培养振荡培养Shaki
19、ng culture静置培养静置培养Standing culture固定台面固定台面孢子孢子1-2天天菌丝垫或菌垫菌丝垫或菌垫Mycelial mat条件适宜条件适宜10天左右天左右白色粉状物白色粉状物孢子孢子1、尽量采取浅层培养方式；尽量采取浅层培养方式；2、尽量避免菌尽量避免菌墊墊起褶，尤其在培养初期菌起褶，尤其在培养初期菌墊墊很薄的时候；很薄的时候；3、氧气的扩散速度是静置培养时决定白腐真菌降解木质素能力的限制性因子；氧气的扩散速度是静置培养时决定白腐真菌降解木质素能力的限制性因子；振荡培养振荡培养Shaking culture振荡培养仪器振荡培养仪器孢子孢子1-3天天菌丝团或菌团菌丝团
20、或菌团Mycelial pellets1、菌团的大小及数量随接种量和菌团的大小及数量随接种量和转速而变化：接种量大，菌团大；转速而变化：接种量大，菌团大；转速越大，菌团越小，数目越多；转速越大，菌团越小，数目越多；（100 mL三角烧瓶三角烧瓶40 mL培养液）培养液）2、一般而言，在一般而言，在100200r/min条件下，菌团条件下，菌团直径在直径在35mm；3、主要为细菌系统建立的振荡培养技术，实际上并不适合直接应用于白腐主要为细菌系统建立的振荡培养技术，实际上并不适合直接应用于白腐真菌系统，主要是由于白腐真菌对振荡所产生的机械剪切力高度敏感；真菌系统，主要是由于白腐真菌对振荡所产生的机
21、械剪切力高度敏感；固体培养体系固体培养体系白腐真菌的固体培养主要是平板培养，少量进行斜面培养。白腐真菌的固体培养主要是平板培养，少量进行斜面培养。平板培养的目的：平板培养的目的：扩大菌的生物量或是大量获得孢子；扩大菌的生物量或是大量获得孢子；鉴定菌的酶活性鉴定菌的酶活性 或扫描菌对化学物质的降解能力；或扫描菌对化学物质的降解能力；用于菌种的分离筛选、用于菌种的分离筛选、诱变、驯化或是短期的保藏；诱变、驯化或是短期的保藏；斜面培养的目的：斜面培养的目的：菌种的中、长期保藏；菌种的中、长期保藏；孢子或菌丝体孢子或菌丝体平板培养平板培养斜面培养斜面培养数日数日数日数日气相气相生长生长气相气相生长生长
22、菌丝层菌丝层菌丝层菌丝层气生孢子气生孢子气生孢子气生孢子3-3 环境因子对白腐真菌代谢活动的影响（黄孢原毛平革菌）环境因子对白腐真菌代谢活动的影响（黄孢原毛平革菌）白腐真菌白腐真菌生理活动生理活动木质素降解木质素降解酶的合成酶的合成木质素降解木质素降解酶的活性酶的活性环境因子环境因子培养参数的操作、培养参数的操作、调控和优化调控和优化菌的代谢或降解潜能菌的代谢或降解潜能开发利用的关键开发利用的关键建立一个合理的建立一个合理的反应体系反应体系涉及的环境因子或培养条件包括：涉及的环境因子或培养条件包括：培养基成分；培养基成分；活性添加成分；活性添加成分；氧；氧；pH；温度温度培养基成分培养基成分实
23、验培养最佳碳源为葡萄糖实验培养最佳碳源为葡萄糖碳源物质碳源物质香草酸钠香草酸钠:支持菌的生长支持菌的生长,也可支持木质素降解也可支持木质素降解;葡萄糖酸钠葡萄糖酸钠:支持菌的生长支持菌的生长,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠;葡萄糖酸内酯葡萄糖酸内酯:支持菌的生长支持菌的生长,但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠但是木质素矿化程度低于甘油和琥珀酸钠;甘油甘油:可当碳源也可能源可当碳源也可能源,支持木质素降解支持木质素降解,是筛选菌突变体的碳源是筛选菌突变体的碳源;琥珀酸钠琥珀酸钠:可当碳源也可能源可当碳源也可能源,支持木质素降解支持木质素降解;葡萄糖葡萄
24、糖:支持菌的生长支持菌的生长,支持木质素矿化程度高支持木质素矿化程度高;纤维素纤维素:支持菌的生长支持菌的生长,支持木质素矿化程度极高支持木质素矿化程度极高;优优劣劣氮源物质氮源物质营养氮源的种类对木质素降解的影响不大，重要的是氮源的浓度；营养氮源的种类对木质素降解的影响不大，重要的是氮源的浓度；氮丰富状态对木质素代谢会产生负面影响；氮丰富状态对木质素代谢会产生负面影响；铵类氮源会抑制一些酶的合成，产生铵类氮源会抑制一些酶的合成，产生“氨代谢物抑制氨代谢物抑制”现象；现象；维生素维生素缓冲成分缓冲成分金属成分金属成分硫胺素是白腐真菌生长和木质素代谢的必须成分；硫胺素是白腐真菌生长和木质素代谢的
25、必须成分；乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钠是三种最为常用的缓冲成分；乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钠是三种最为常用的缓冲成分；主要功能，或作为一般的营养元素，或作为酶的结构组成和活性因子；主要功能，或作为一般的营养元素，或作为酶的结构组成和活性因子；活性添加成分活性添加成分 活性添加成分（活性添加成分（activated additive）有利于提高或保护木质素降解系统，）有利于提高或保护木质素降解系统，可以提高培养体系的反应性。可以提高培养体系的反应性。VA（藜芦醇，（藜芦醇，3,4-二甲氧基苯甲醇）二甲氧基苯甲醇）白腐真菌本身在生长过程中可以产生白腐真菌本身在生长过程中可以产生VA（次生代谢物），外源
26、加入一（次生代谢物），外源加入一定量的定量的VA可以显著提高木质素过氧化物酶的合成及活性。可以显著提高木质素过氧化物酶的合成及活性。芳族化合物芳族化合物 起到氧化还原调节剂的作用，常见的有起到氧化还原调节剂的作用，常见的有3,4-二甲氧基苯甲醇和二甲氧基苯甲醇和3-羟基邻氨羟基邻氨基苯甲酸盐。基苯甲酸盐。有机酸有机酸表面活性剂表面活性剂 有机酸，如甘醇酸（有机酸，如甘醇酸（glycolate）、乙醛酸（）、乙醛酸（glyoxylate）、草酸（）、草酸（oxalate）等，可以促进木质素降解活动。其中，草酸的作用尤其引起重视，草酸具有刺等，可以促进木质素降解活动。其中，草酸的作用尤其引起重视，
27、草酸具有刺激锰过氧化物酶及调节细胞外酸碱度的功能。激锰过氧化物酶及调节细胞外酸碱度的功能。白腐真菌液体培养体系中加入表面活性剂可以有效地保护木质素降解酶免白腐真菌液体培养体系中加入表面活性剂可以有效地保护木质素降解酶免受因机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失。受因机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失。最为常用的表面活性剂最为常用的表面活性剂Tween 80（吐温（吐温80）氧氧 环境中氧的浓度对白腐真菌的生理代谢及木质素降解活动有很大影响。环境中氧的浓度对白腐真菌的生理代谢及木质素降解活动有很大影响。但是，绝对不能简单的认为是氧的绝对浓度问题，但是，绝对不能简单的认为是氧的绝对浓度问题，起关键
28、作用的是白腐真起关键作用的是白腐真菌真正所能获得的有效氧的多寡。菌真正所能获得的有效氧的多寡。pH 白腐真菌生长所需的适宜白腐真菌生长所需的适宜pH为为5.5左右，稍高于木质素降解所要求的最左右，稍高于木质素降解所要求的最佳佳pH 4.5。当培养体系。当培养体系pH低于低于3.5或是高于或是高于4.5的情况下，会显著抑制木质素的情况下，会显著抑制木质素的降解和降解酶系统的工作。的降解和降解酶系统的工作。温度温度 白腐真菌生长扩增所需的温度范围在白腐真菌生长扩增所需的温度范围在2539，要求并不十分严格。，要求并不十分严格。4、白腐真菌酶学简介、白腐真菌酶学简介4-1 白腐真菌主要酶种概述白腐真
29、菌主要酶种概述H2O2产生酶系产生酶系葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶乙二醛氧化酶乙二醛氧化酶甲醇氧化酶甲醇氧化酶VA氧化酶氧化酶其他酶其他酶其他酶系其他酶系过氧化物歧化酶过氧化物歧化酶葡糖苷酶葡糖苷酶苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶还原脱卤酶系统还原脱卤酶系统醌还原酶醌还原酶芳烃硝基还原酶芳烃硝基还原酶蛋白酶蛋白酶木质素氧化酶系木质素氧化酶系需需H2O2的过氧化酶的过氧化酶漆酶漆酶Lac木质素过氧化物酶木质素过氧化物酶LiP锰过氧化物酶锰过氧化物酶MnP白腐真菌木质素降解酶系统（白腐真菌木质素降解酶系统（ligninolytic enzyme system）H2O2产生酶系产生酶系共同作用：以小分子有机
30、物为底物，将分子氧化还原为共同作用：以小分子有机物为底物，将分子氧化还原为H2O2。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 细胞内合成分泌到细胞外环境，将糖类物质氧化还原为细胞内合成分泌到细胞外环境，将糖类物质氧化还原为H2O2。乙二醛氧化酶乙二醛氧化酶 为细胞外的含铜氧化酶，主要以醛类物质为底物。而醛类物质为细胞外的含铜氧化酶，主要以醛类物质为底物。而醛类物质恰好是葡萄糖氧化的中间产物。恰好是葡萄糖氧化的中间产物。其他酶其他酶 参与参与H2O2的产生。主要有甲醇氧化酶，的产生。主要有甲醇氧化酶，VA氧化酶等。氧化酶等。漆酶（漆酶（Lac）木质素过氧化物酶（木质素过氧化物酶（LiP）能氧化高氧化还原电位的化
31、合物，催化酚类、能氧化高氧化还原电位的化合物，催化酚类、非酚类物质氧化，参与木质素解聚。非酚类物质氧化，参与木质素解聚。锰过氧化物酶（锰过氧化物酶（MnP）表现出对锰二价离子的绝对需要，氧化氧化还表现出对锰二价离子的绝对需要，氧化氧化还原电位相对低的化合物，如胺类、染料，在脱色反原电位相对低的化合物，如胺类、染料，在脱色反应中起主要作用，参与木质素解聚。应中起主要作用，参与木质素解聚。木木质质素素氧氧化化酶酶系系需需H2O2的过氧化酶的过氧化酶含铁的血红蛋白含铁的血红蛋白胞外酶胞外酶含铜多酚氧化酶（对二酚氧化酶）含铜多酚氧化酶（对二酚氧化酶）以单酚、二酚、二胺、多酚类化合物为底物。对非酚类物质
32、，特别是蒽、以单酚、二酚、二胺、多酚类化合物为底物。对非酚类物质，特别是蒽、苯并芘，多环芳烃类作用显著。参与木质素的解聚和降解。苯并芘，多环芳烃类作用显著。参与木质素的解聚和降解。其他酶系其他酶系过氧化物歧化酶过氧化物歧化酶 保护白腐真菌活细胞中过氧化物自由基免遭氧化压力；保护白腐真菌活细胞中过氧化物自由基免遭氧化压力；葡糖苷酶葡糖苷酶 具有糖基化的活性，在废水脱色中起着重要作用；具有糖基化的活性，在废水脱色中起着重要作用；苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶 与与VA的生物合成密切相关；的生物合成密切相关；还原脱卤酶系统还原脱卤酶系统 能还原卤素基团；能还原卤素基团；醌还原酶醌还原酶 能产生氢醌，对
33、木质素及环境污染物的降解极其重要；能产生氢醌，对木质素及环境污染物的降解极其重要；芳烃硝基还原酶芳烃硝基还原酶 是硝基芳香族化合物降解的关键；是硝基芳香族化合物降解的关键；蛋白酶蛋白酶 具体情况尚不明确；具体情况尚不明确；木质素过氧化物酶（木质素过氧化物酶（LiP）的分离和检测）的分离和检测LiP的分离的分离4-2 主要木质素降解酶的分离、提纯和检测方法主要木质素降解酶的分离、提纯和检测方法LiP的粗制品的粗制品液体培养液体培养细胞外液细胞外液6天天上清液上清液1200018000g 离心离心1030分钟分钟去除菌丝和孢子去除菌丝和孢子粗酶液粗酶液4保存保存24hDEAE树脂树脂4，离子交换，
34、离子交换LiP的粗制品的纯化的粗制品的纯化DEAE离子交换柱离子交换柱LiP的纯化制品的纯化制品NaCl梯度溶液梯度溶液洗脱洗脱LiP的标准检测方法的标准检测方法基本原理基本原理藜芦醇（藜芦醇（VA）藜芦醛（藜芦醛（VAd）LiP催化催化H2O2320nm无吸收无吸收强烈吸收强烈吸收反应体系反应体系操作要点操作要点2mmol/L VA50mmol/L 酒石酸（酒石酸（pH 3.03.5）0.4mmol/L H2O2一定量的酶液一定量的酶液 H2O2使用前新鲜配制；使用前新鲜配制；30反应时间反应时间10分钟；分钟；pH保持在保持在3.03.5；使用使用1cm石英比色皿，各比色皿总体积差额用蒸馏
35、水补足；石英比色皿，各比色皿总体积差额用蒸馏水补足；VA使用真使用真空蒸馏或是在醚中萃取的方法进行纯化；空蒸馏或是在醚中萃取的方法进行纯化；锰过氧化物酶（锰过氧化物酶（MnP）的纯化和检测）的纯化和检测MnP的纯化的纯化菌的培养液用玻璃棉过滤，获得粗过滤液菌的培养液用玻璃棉过滤，获得粗过滤液超过滤法浓缩过滤物，使其浓度增加超过滤法浓缩过滤物，使其浓度增加20倍倍用去离子水按用去离子水按1:1比例进行稀释比例进行稀释使用使用DEAE阴离子交换柱吸附阴离子交换柱吸附洗涤洗涤50mL蒸馏水蒸馏水20mmol/L酒石酸钠（含酒石酸钠（含0.4mol/L NaCl）洗脱蛋白质洗脱蛋白质超过滤法除盐超过滤
36、法除盐或浓缩或浓缩冰冻干燥，冰冻干燥，-20保存保存所有纯化步骤在所有纯化步骤在4进行，通过上述方法制备的酶制品可以保存进行，通过上述方法制备的酶制品可以保存1年不失活年不失活MnP的基本测定方法的基本测定方法利用各种芳香族底物，在补充锰（利用各种芳香族底物，在补充锰（）离子的条件下，均可进行）离子的条件下，均可进行MnP的测定。的测定。表表 用于用于MnP测定的底物及相关波长数据测定的底物及相关波长数据底物底物波长波长/nm亚香草基丙酮亚香草基丙酮3362,6-二甲氧基苯酚（二甲氧基苯酚（DMP）568丁香酸丁香酸260愈创木酚愈创木酚465姜黄素姜黄素430丁香醛连氮丁香醛连氮525松柏醇
37、松柏醇263邻联（二）茴香胺邻联（二）茴香胺460MnP的基本测定方法具体步骤的基本测定方法具体步骤1mL反应混合液反应混合液0.1mmol/L酒石酸钠酒石酸钠（pH 5.0）0.1mmol/L底物底物0.1mmol/L MnSO4适量的酶液适量的酶液光程光程1cm、体积、体积1.5mL石英比色皿，室温石英比色皿，室温加入加入0.1mmol/L H2O2以不加以不加H2O2的反应体系为对照；的反应体系为对照；1U为每分钟氧化为每分钟氧化1微摩尔每升底微摩尔每升底物的物的MnP；启动反应启动反应MnP其他具有代表性的测定方法还包括其他具有代表性的测定方法还包括ABTS氧化法，氧化法，Mn()氧化
38、法和酚红法。氧化法和酚红法。漆酶（漆酶（Lac）的定性和定量检测方法）的定性和定量检测方法Lac的定性检测方法的定性检测方法Lac的定量检测方法的定量检测方法愈创木酚法：愈创木酚法：在含在含0.02%（质量浓度）愈创木酚的平板上可以鉴定细胞（质量浓度）愈创木酚的平板上可以鉴定细胞外液中外液中Lac的活性，的活性，Lac催化愈创木酚聚合形成红棕色的区带。催化愈创木酚聚合形成红棕色的区带。1mmol/L愈创木酚愈创木酚50mmol/L乙酸钠乙酸钠pH4.5适量的酶液适量的酶液37，5分钟分钟465nm处测定吸光度处测定吸光度 一个酶活单位定义为每分钟引起波长一个酶活单位定义为每分钟引起波长465n
39、m处吸光度一个处吸光度一个0.01单位变化所需的酶液量。单位变化所需的酶液量。5、白腐真菌分子生物学简介、白腐真菌分子生物学简介黄孢原毛平革菌的分子生物学黄孢原毛平革菌的分子生物学其他白腐真菌的分子生物学其他白腐真菌的分子生物学木质素降解过氧化物酶的分子生物学木质素降解过氧化物酶的分子生物学未来发展趋势：破解各类白腐真菌基因图谱未来发展趋势：破解各类白腐真菌基因图谱6、白腐真菌的生物降解、白腐真菌的生物降解6-1 白腐真菌生物降解的特点白腐真菌生物降解的特点非专一性非专一性nonspecific非水解性非水解性nonhydrolytic细胞外性细胞外性extracellular 白腐真菌能降解
40、各种不同的化合物，具有广谱的底物范围。白腐真菌能降解各种不同的化合物，具有广谱的底物范围。其对作用底物的结构和类型要求是高度非特异性的。其对作用底物的结构和类型要求是高度非特异性的。白腐真菌在生物降解过程中白腐真菌在生物降解过程中并不出现通常的酶的水解反应。并不出现通常的酶的水解反应。白腐真菌通过细胞外酶的作用白腐真菌通过细胞外酶的作用对木质素类物质进行氧化分解。对木质素类物质进行氧化分解。木质素的结构特征木质素的结构特征6-2 白腐真菌生物降解系统白腐真菌生物降解系统白腐真菌生物降解系统的概念白腐真菌生物降解系统的概念营养限制营养限制N-L和和C-L木质素的降解木质素的降解木质素降解酶的合成
41、木质素降解酶的合成要求要求木质素降解条件木质素降解条件Ligninolytic condition参与的组分参与的组分木质素降解系统木质素降解系统Lignin degradation system,LDS白腐真菌生物降解系统白腐真菌生物降解系统 泛指所有白腐真菌在适宜的条件下所泛指所有白腐真菌在适宜的条件下所形成的参与生物降解活动的组分的集合。形成的参与生物降解活动的组分的集合。白腐真菌生物降解系统的组成白腐真菌生物降解系统的组成酶组分酶组分小分子有机物小分子有机物白腐真菌生物降解系统白腐真菌生物降解系统产过氧化氢的酶产过氧化氢的酶过氧化物酶过氧化物酶其他酶种其他酶种VA草酸草酸HAA3-羟基
42、羟基-邻氨基苯甲酸（氨茴酸）邻氨基苯甲酸（氨茴酸）注意：注意：1、葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶的区别；、葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶的区别；葡萄糖氧化酶是细胞内酶，乙二醛氧化酶为细胞外酶葡萄糖氧化酶是细胞内酶，乙二醛氧化酶为细胞外酶 2、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的异同点；、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的异同点；相同点：相同点：均在细胞内合成，分泌到细胞外，以均在细胞内合成，分泌到细胞外，以H2O2为最初氧化底物，触发为最初氧化底物，触发 酶的催化循环；酶的催化循环；不同点：不同点：Lip主要催化非酚类的芳香族化合物，只与木质素解聚有关，主要催化非酚类的芳香族化合物，只与木质素解聚有关，Mn
43、P 主要催化酚类化合物，与主要催化酚类化合物，与H2O2产生和木质素解聚均相关；产生和木质素解聚均相关；白腐真菌生物降解系统的基本要求白腐真菌生物降解系统的基本要求1 1、一种共底物，不能以木质素或是其他降解底物为唯一碳源；、一种共底物，不能以木质素或是其他降解底物为唯一碳源；2 2、底物的不可诱导性；、底物的不可诱导性；3 3、只在次生代谢期间得以表达；、只在次生代谢期间得以表达；4 4、因碳、氮、硫等的限制而触发；、因碳、氮、硫等的限制而触发；5 5、能被一些化学物质所强烈抑制；、能被一些化学物质所强烈抑制；6 6、对微量金属元素平衡的敏感；、对微量金属元素平衡的敏感；7 7、相对狭窄的酸
44、碱度范围；、相对狭窄的酸碱度范围；8 8、明显地受氧气浓度的影响；、明显地受氧气浓度的影响；6-3 白腐真菌生物降解的机制白腐真菌生物降解的机制木质素的降解机制木质素的降解机制木质素的部分结构示意图木质素的部分结构示意图 木质素是由类苯丙烷亚单位非线性木质素是由类苯丙烷亚单位非线性随机连接形成的天然生物聚合物。随机连接形成的天然生物聚合物。木质素主要前体物木质素主要前体物对豆香醇对豆香醇 松柏醇松柏醇 芥子醇芥子醇愈创木基木质素愈创木基木质素愈创木基丁香基木质素愈创木基丁香基木质素愈创木基丁香基对羟苯基愈创木基丁香基对羟苯基木质素木质素主要存在于主要存在于草本植物草本植物中中主要存在于主要存在
45、于裸子植物裸子植物中中主要存在于主要存在于木本植物木本植物中中木质素的主要种类木质素的主要种类木质素的降解过程木质素的降解过程木质素木质素脱甲基化脱甲基化羟基化羟基化芳环开裂芳环开裂白腐真菌细胞外酶白腐真菌细胞外酶愈创木基和丁香基亚单位愈创木基和丁香基亚单位甲氧基含量减少甲氧基含量减少邻苯二酚邻苯二酚脂肪羧酸脂肪羧酸水解水解1、侧链中：发生氧化形成羰基和羧基；、侧链中：发生氧化形成羰基和羧基；2、芳环中：脱甲基化形成邻苯二酚后发生氧化开裂；、芳环中：脱甲基化形成邻苯二酚后发生氧化开裂；3、环裂片段进一步被降解，释放出脂肪类产物和新的酚羟基单位，然后降解；、环裂片段进一步被降解，释放出脂肪类产物
46、和新的酚羟基单位，然后降解；4、侧链断裂与芳环开裂几乎同时发生；、侧链断裂与芳环开裂几乎同时发生；化学物质的降解机制化学物质的降解机制氧化机制氧化机制 包括包括LiP和和MnP的过氧化物酶，利用的过氧化物酶，利用H2O2促进化学物质发生单电子氧化形成自由基。促进化学物质发生单电子氧化形成自由基。氧化机制氧化机制依赖依赖MnP催化的氧化催化的氧化氧化机制类似于氧化机制类似于LiP的直接氧化，但表现出对的直接氧化，但表现出对Mn的绝对需要。的绝对需要。依赖依赖LiP的氧化的氧化直接氧化直接氧化间接氧化间接氧化 被氧化化学物质不必与酶发生结合，氧化通过简单的被氧化化学物质不必与酶发生结合，氧化通过简
47、单的电子传递而发生。主要氧化的化学物质为电子传递而发生。主要氧化的化学物质为PAH类、氰化物类、氰化物和染料。和染料。依靠某种中介物（调节剂）相助进行氧化。主要氧化的依靠某种中介物（调节剂）相助进行氧化。主要氧化的化学物质为木质素、有机酸等。化学物质为木质素、有机酸等。还原机制还原机制 白腐真菌对化学物质的降解过程中还原机制存在两种类型，一是白腐真菌对化学物质的降解过程中还原机制存在两种类型，一是依赖依赖LiP的的还原还原，一是，一是依赖依赖MnP的还原的还原。脱毒机制脱毒机制 有机化合物之所以能抵御生物降解是由于其毒性，能对生物造成毒效应。有机化合物之所以能抵御生物降解是由于其毒性，能对生物
48、造成毒效应。白腐真菌对化学物质的降解过程就涉及到其解毒机制。白腐真菌的解毒机制白腐真菌对化学物质的降解过程就涉及到其解毒机制。白腐真菌的解毒机制主要有两种，即主要有两种，即酚类化合物的甲基化酚类化合物的甲基化和和化学物质依赖于细胞质膜的还原反应化学物质依赖于细胞质膜的还原反应。6-4 白腐真菌生物降解的广谱性白腐真菌生物降解的广谱性白腐真菌种类的多样性白腐真菌种类的多样性白腐真菌特殊的降解机制白腐真菌特殊的降解机制白腐真菌对广谱的化学物质具有白腐真菌对广谱的化学物质具有敏感性和进攻性敏感性和进攻性目前白腐真菌可以有效降解的具有代表性的化学物质大类共有目前白腐真菌可以有效降解的具有代表性的化学物
49、质大类共有16类类单苯化合物单苯化合物 苯、甲苯、乙苯和二甲苯（分别简称为苯、甲苯、乙苯和二甲苯（分别简称为B、T、E和和X，合称，合称BTEX），是一类重要的），是一类重要的有机污染物。有机污染物。白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，从底物的敏感性来排序：白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，从底物的敏感性来排序：ETXB（乙苯甲苯二甲苯苯）（乙苯甲苯二甲苯苯）氯苯氯苯 氯苯是优先污染物，作为溶剂、脱脂剂、甜味剂和各类农药，染料合成的中间体氯苯是优先污染物，作为溶剂、脱脂剂、甜味剂和各类农药，染料合成的中间体被广泛使用。被广泛使用。白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，按照降解速率来排序：
50、白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，按照降解速率来排序：单氯苯间二氯苯邻二氯苯对二氯苯单氯苯间二氯苯邻二氯苯对二氯苯苯胺苯胺 主要是降解主要是降解3,4-二氯苯胺（二氯苯胺（DCA）。）。氯酚氯酚 氯酚是污染物的大类，也是造纸废水的主要成分。白腐真菌主要降解五氯苯酚氯酚是污染物的大类，也是造纸废水的主要成分。白腐真菌主要降解五氯苯酚（PCP）、单氯苯酚（）、单氯苯酚（CP）、二氯苯酚（）、二氯苯酚（DCP）和三氯苯酚（）和三氯苯酚（TCP）。）。联苯联苯 联苯类物质由于疏水性和稳定性，在环境中可以长期存在，对人及各种生物构成联苯类物质由于疏水性和稳定性，在环境中可以长期存在，对人及各种生物构
