1、(完整)脑损伤修复与再生ppt张吉强神经生物教研室 Tel:752232第十一章第十一章 神经损伤与再生神经损伤与再生 Nerve Injury and RegenerationNerve Injury and Regeneration神经损伤后神经元胞体反应神经损伤后神经元胞体反应外周神经损伤后轴突溃变与再生外周神经损伤后轴突溃变与再生胶质细胞对中枢神经系统再生的影响胶质细胞对中枢神经系统再生的影响中枢神经系统损伤后再生困难的原因中枢神经系统损伤后再生困难的原因中枢神经系统损伤后的修复策略中枢神经系统损伤后的修复策略轴突损伤后影响神经元死亡或存活的因素轴突损伤后影响神经元死亡或存活的因素神经
2、干细胞在脊髓损伤修复中的应用前景神经干细胞在脊髓损伤修复中的应用前景掌掌 握握理理 解解了了 解解教学目标与要求教学目标与要求20062006级临床医学八年制级临床医学八年制神经损伤后神经元胞体及轴突的反应神经损伤后神经元胞体及轴突的反应胶质细胞对中枢神经系统再生的影响胶质细胞对中枢神经系统再生的影响胶质细胞对中枢神经系统再生的影响胶质细胞对中枢神经系统再生的影响教学对象：教学对象：教学重点：教学重点：教学难点：教学难点：使用教材：使用教材：医学神经生物学基础医学神经生物学基础，阮怀珍、蔡文琴主编，阮怀珍、蔡文琴主编参考资料：参考资料：神经生物学神经生物学-从神经元到脑从神经元到脑，杨雄里等译
3、，杨雄里等译神经科学基础神经科学基础，李继硕主编，李继硕主编网络信息资源：网络信息资源：1.教研室网站教研室网站 http:/202.202.224.149/2.军队院校网络教学应用系统军队院校网络教学应用系统http:/192.168.10.21/mta/VirClass/VMList.htm00Contents一、一、PNSPNS损伤后的胞体反应损伤后的胞体反应二、轴突对损伤的反应二、轴突对损伤的反应三、中枢神经系统损伤三、中枢神经系统损伤 四、神经再生四、神经再生五、胶质细胞对五、胶质细胞对CNSCNS再生的影响再生的影响六、脊髓损伤的治疗策略六、脊髓损伤的治疗策略神经系统损伤后：神经系
4、统损伤后：受损轴突远端发生溃变受损轴突远端发生溃变 近端轴突发芽近端轴突发芽 损伤区周围的胶质细胞增多损伤区周围的胶质细胞增多 巨噬细胞向损伤处迁移巨噬细胞向损伤处迁移 神经元形态、生化及代谢变化神经元形态、生化及代谢变化 Overview：基本的损伤反应：基本的损伤反应（一）轴突损伤后神经元（一）轴突损伤后神经元 形态和功能的改变形态和功能的改变一、一、PNS损伤后的胞体反应损伤后的胞体反应1 1.形态学改变形态学改变急性期反应特征：急性期反应特征：(CNS、PNS相似相似)(逆行性反应逆行性反应-虎斑溶解虎斑溶解)*尼氏体分散、消失尼氏体分散、消失*染色质溶解染色质溶解*细胞核偏移细胞核偏
5、移*细胞体肿胀细胞体肿胀*突触末梢的减少突触末梢的减少normalinjured（1）神经元化学标志物的变化）神经元化学标志物的变化氧代谢率升高，代谢酶上调氧代谢率升高，代谢酶上调微管相关蛋白微管相关蛋白(MAP)、生长相关蛋白、生长相关蛋白(GAP-43)和和P75NTR表达增多表达增多神经肽、神经递质、酶的表达变化神经肽、神经递质、酶的表达变化 甘丙肽（甘丙肽（galanin）、血管活性肠肽（）、血管活性肠肽（VIP）P物质（物质（SP）、神经肽）、神经肽Y（NPY）、胆碱乙酰化酶）、胆碱乙酰化酶（2）电生理学变化）电生理学变化大多数轴突损伤的神经元大多数轴突损伤的神经元-电活动的增强，再
6、生恢复电活动的增强，再生恢复2.2.轴突损伤后影响神经元死亡或存活的因素轴突损伤后影响神经元死亡或存活的因素多数情况下，具有共多数情况下，具有共同的形态、功能、投同的形态、功能、投射或发育特征的神经射或发育特征的神经元轴突损伤后有相似元轴突损伤后有相似的胞体反应的胞体反应（1）神经元类型）神经元类型（2）动物的年龄）动物的年龄相同的神经元群在动物的不同年龄段对轴突损伤相同的神经元群在动物的不同年龄段对轴突损伤的反应性不相同的反应性不相同 出生后早期几天是运动神经元的易损期出生后早期几天是运动神经元的易损期AdultBaby（3）轴突延伸的环境）轴突延伸的环境外周神经轴突损伤后神外周神经轴突损伤
7、后神经元多存活，条件适宜经元多存活，条件适宜时神经可以再生时神经可以再生成年动物中枢神经系成年动物中枢神经系统神经元轴突损伤后统神经元轴突损伤后神经元常死亡神经元常死亡（4）从损伤区到神经元胞体的距离）从损伤区到神经元胞体的距离轴突损伤部位与神经元胞体间的距离轴突损伤部位与神经元胞体间的距离:损伤部位越损伤部位越靠近胞体，变性坏死的神经元越多，变性的速度靠近胞体，变性坏死的神经元越多，变性的速度越快越快神经轴突的侧支的位置与数量神经轴突的侧支的位置与数量:脊髓损伤后损伤轴突的逆行变脊髓损伤后损伤轴突的逆行变性止于轴突的第一个有效侧支，性止于轴突的第一个有效侧支，当该轴突无有效侧支时，变性当该轴
8、突无有效侧支时，变性继续到神经元胞体继续到神经元胞体（5）神经元兴奋性）神经元兴奋性神经元保持适宜的兴奋性，可促进其在轴突损神经元保持适宜的兴奋性，可促进其在轴突损伤后的存活伤后的存活在药物诱发的低血钠条在药物诱发的低血钠条件下，轴突切断后几乎件下，轴突切断后几乎所有的加压素类神经元所有的加压素类神经元均死亡，提示降低神经均死亡，提示降低神经元的活动性可能加重神元的活动性可能加重神经元对轴突损伤后神经经元对轴突损伤后神经元死亡的易感性。元死亡的易感性。二、神经轴突对损伤的反应二、神经轴突对损伤的反应 DegenerationDegeneration：轴突溃变：轴突溃变Intact axons
9、in PNS and CNS1.损伤远端轴突反应损伤远端轴突反应瓦勒氏瓦勒氏(Waller)变性变性轴突变性轴突变性髓鞘的崩解、髓鞘的崩解、分离；脂滴球分离；脂滴球周围的细胞吞噬：周围的细胞吞噬：Ast.Microglia,Macrophage 3-10 Days清净清净Waller在距今在距今150年前，首次发现和记录年前，首次发现和记录（2）巨噬细胞分泌的一些物质如NGF、NT-3、血小板因子、IL-2等其促进轴突再生，表明炎性细胞分泌适量的活性物质可促进轴突再生。缺血半影区（缺血半暗带）：位于中心不可逆梗死灶周围经过再灌注可以恢复正常的脑缺血区域少突胶质细胞抑制性分子军队院校网络教学应用
10、系统Spinal Cord InjuryBrain and spinal cord injury钙依赖性蛋白酶(calpain)轴突损伤部位与神经元胞体间的距离:损伤部位越靠近胞体，变性坏死的神经元越多，变性的速度越快中枢神经系统损伤再生困难的原因是什么？神经损伤后神经元胞体及轴突的反应轴突损伤区新的大分子物质逆向转运是引起神（2）各亚型C末端高度相似，含有66个氨基酸残（3）损伤局部非神经元细胞信号组织移植：周围神经，胎儿神经组织小胶质细胞、少突胶质细胞、星型胶质细胞轴突损伤后影响神经元死亡或存活的因素1、提供再生轴突延伸的支架 中期促进再生：诱导损伤轴突再生，替代损失的神经元，促进髓鞘再生
11、；（1）数个鞘髓郎飞氏结崩解）数个鞘髓郎飞氏结崩解（2）近端轴突的断端坏死，出芽，生长锥形成）近端轴突的断端坏死，出芽，生长锥形成（3）吞噬细胞吞噬消化残留的坏死轴突）吞噬细胞吞噬消化残留的坏死轴突2.损伤近端轴突反应损伤近端轴突反应神经丝神经丝(neurofilament)血影蛋白血影蛋白(spectrin)微管相关蛋白（微管相关蛋白（MAPs）其它细胞骨架成分其它细胞骨架成分崩解崩解钙依赖性蛋白酶钙依赖性蛋白酶(calpain)3.损伤后轴突细胞骨架的变化损伤后轴突细胞骨架的变化轴突断端钙内流激活蛋白酶，使轴突骨架去组装轴突断端钙内流激活蛋白酶，使轴突骨架去组装三、中枢神经系统损伤三、中枢
12、神经系统损伤 Brain and spinal cord injury 脑创伤脑创伤(Brain damage)炎症炎症(Inflammation)缺血、缺氧所致损伤缺血、缺氧所致损伤 (Hypohemia and Hypoxia injury)基本病变特征基本病变特征 胞体：肿胀、虎斑溶介，核偏位，死亡或复苏胞体：肿胀、虎斑溶介，核偏位，死亡或复苏 Waller degeneration Macrophage 增殖、吞噬、清除增殖、吞噬、清除清除慢，清除慢，2wOlig.Ast.胶质瘢痕胶质瘢痕（1）髓鞘形成细胞不同：雪旺氏细胞）髓鞘形成细胞不同：雪旺氏细胞 vs 少突胶质细少突胶质细胞胞（
13、2）CNS中巨噬细胞的募集及清除作用不及中巨噬细胞的募集及清除作用不及PNS（3）CNS中小胶质细胞向吞噬细胞转变的延迟中小胶质细胞向吞噬细胞转变的延迟（4）跨神经元变性跨神经元变性（5）继发性）继发性CNS损伤损伤(Secondary injury)1、轴突损伤反应中枢与外周的差异、轴突损伤反应中枢与外周的差异2、跨神经元变性、跨神经元变性 周围神经元变性仅限于受损神经元，不累及下一周围神经元变性仅限于受损神经元，不累及下一个神经元；而个神经元；而CNS受损可跨越突触引起与之接触受损可跨越突触引起与之接触的下一个神经元变性。称为跨神经元或跨突触变的下一个神经元变性。称为跨神经元或跨突触变性（
14、性（Transynaptic Degeneration）顺顺行性跨神行性跨神经经元元变变性性逆行性跨神逆行性跨神经经元元变变性性损损害害中枢神经元轴突受损后的跨神经元变性中枢神经元轴突受损后的跨神经元变性3、CNS继发性损伤继发性损伤延迟性轴突损伤延迟性轴突损伤半影区Centre Region半影区半影区(Penumbra zone)缺血半影区（缺血半影区（缺血半暗带缺血半暗带）：位于中心不可逆梗死灶周围经）：位于中心不可逆梗死灶周围经过再灌注可以恢复正常的脑缺血区域过再灌注可以恢复正常的脑缺血区域 4 4、轴突损伤引起的神经元分子转导变化、轴突损伤引起的神经元分子转导变化（1）靶源性物质的丧
15、失）靶源性物质的丧失 靶源性生长因子提供逆行性信号丧失靶源性生长因子提供逆行性信号丧失（2）轴突损伤区大分子物质的逆行性转运）轴突损伤区大分子物质的逆行性转运 轴突损伤区新的大分子物质逆向转运是引起神轴突损伤区新的大分子物质逆向转运是引起神 经元胞体变化的原因经元胞体变化的原因（3）损伤局部非神经元细胞信号）损伤局部非神经元细胞信号 反应性胶质细胞可产生不同类型的生长因子和反应性胶质细胞可产生不同类型的生长因子和 细胞因子细胞因子Summary of the 1st PartInjury caused degeneration of the CNS and PNS Cell body：核偏位：
16、核偏位 虎斑溶解虎斑溶解-axonal reaction 蛋白质、酶蛋白质、酶 电活动增强电活动增强 Axon:Degeneration Wallerian degeneration Changes of cytoskeleton 近端、远端区别近端、远端区别;PNS、CNS区别区别四、神经再生四、神经再生Nerve RegenerationNerve RegenerationQuestions：神经能否再生？神经能否再生？PNSPNS与与CNSCNS再生有何区别？再生有何区别？如何促进如何促进CNSCNS再生？再生？（一）周围神经再生（一）周围神经再生 PNS regeneration雪旺细
17、胞增殖形成雪旺细胞增殖形成B B ngnerngner带，诱导和支持着再生带，诱导和支持着再生新芽的发生和生长并将之引向靶结构。新芽的发生和生长并将之引向靶结构。周围神经再生周围神经再生 RegenerationBungner zone保持神经膜细胞基板完整性，间距小于保持神经膜细胞基板完整性，间距小于1cm,2-4mm/Day1cm,2-4mm/Day（二）中枢神经再生（二）中枢神经再生 CNS regenerationCNS vs PNS中枢神经系统周围神经系统雪旺细胞雪旺细胞小胶质细胞、少突胶质细胞、星型胶质细胞小胶质细胞、少突胶质细胞、星型胶质细胞CNSCNS再生困难的原因：再生困难的
18、原因：成髓鞘细胞为少突胶质细胞；神经纤维无基膜包裹；成髓鞘细胞为少突胶质细胞；神经纤维无基膜包裹；小胶质细胞清除作用较慢；胶质瘢痕形成小胶质细胞清除作用较慢；胶质瘢痕形成五、胶质细胞对五、胶质细胞对CNSCNS再生的影响再生的影响（一）少突胶质细胞（一）少突胶质细胞 髓鞘与再生抑制性物质髓鞘与再生抑制性物质少突胶质前体细胞（少突胶质前体细胞（OPC）Oligodendrocyte Progenitor Cell 少突胶质细胞，少突胶质细胞，CNS成髓鞘细胞成髓鞘细胞CNS髓鞘中存在再生抑制性物质髓鞘中存在再生抑制性物质髓鞘相关蛋白髓鞘相关蛋白Myelin-Associated Glycopro
19、tein，MAGNogo少突胶质细胞髓鞘糖蛋白少突胶质细胞髓鞘糖蛋白Oligodendrocyte-Myelin Glycoprotein，OMgp少突胶质细胞抑制性分子少突胶质细胞抑制性分子Nogo的特点的特点 （1）Nogo分子有三个亚型：分子有三个亚型：NgA、NgB、NgC（2）各亚型）各亚型C末端高度相似，含有末端高度相似，含有66个氨基酸残个氨基酸残 基组成的亲水环状片段基组成的亲水环状片段Nogo-66（3）Nogo-A的的N末端特殊，即末端特殊，即amino-NogoNogo-66amino-Nogo具有抑制神经元具有抑制神经元突起生长的作用突起生长的作用Nogo分子作用机理分
20、子作用机理 Nogo分子在少突胶质细胞膜上的存在多种拓扑结构，分子在少突胶质细胞膜上的存在多种拓扑结构，将不同的抑制活性结构域暴露，与相同或不同的受体将不同的抑制活性结构域暴露，与相同或不同的受体分子识别，通过一条或多条途径传递抑制信号。分子识别，通过一条或多条途径传递抑制信号。信号传递的重要分子信号传递的重要分子NgR、LINGO-1、p75NTR、Rho-GDIAntibody Treatment:IN-1（二）星形胶质细胞（二）星形胶质细胞 胶质瘢痕与再生抑制物质胶质瘢痕与再生抑制物质NormalGFAP+InjuryGFAP+CNS损伤部位损伤部位:星形胶质细胞增生、突星形胶质细胞增生
21、、突起相互交织最终形成胶起相互交织最终形成胶质瘢痕，质瘢痕，GFAP染色呈染色呈强阳性。强阳性。Glial Scar FormationFibroblastAstrocyteAxonMyelin成纤维细胞迁移到成纤维细胞迁移到损伤处聚集，与星损伤处聚集，与星形胶质细胞形成边形胶质细胞形成边界，成纤维细胞分界，成纤维细胞分泌泌semaphorinsemaphorin引起引起生长锥塌陷；生长生长锥塌陷；生长锥表达的锥表达的EphEph与星形与星形胶质细胞和髓鞘上胶质细胞和髓鞘上的的ephrinephrin作用，使作用，使轴突再生受到抑制轴突再生受到抑制星形胶质细胞反应影响神经再生星形胶质细胞反应影
22、响神经再生活化星型胶质细胞活化星型胶质细胞（1）分泌轴突再）分泌轴突再生抑制性分子生抑制性分子（2）被小胶质细）被小胶质细胞分泌的分子活化胞分泌的分子活化（3）由于）由于BBB破破坏被活化坏被活化（三）小胶质细胞（三）小胶质细胞 Microglia炎性反应物与吞噬反应：双刃剑炎性反应物与吞噬反应：双刃剑炎细胞浸润与小胶质细胞活化炎细胞浸润与小胶质细胞活化RestingActivated负面效应负面效应-抑制再生抑制再生 Microglia-抗原提呈细胞，炎性分泌物激活抗原提呈细胞，炎性分泌物激活Astrocyte，促胶质瘢痕形成，促胶质瘢痕形成 Microglia在活化后炎性反应中分泌的神经毒
23、性物在活化后炎性反应中分泌的神经毒性物质是质是CNS继发性损伤的重要启动因子继发性损伤的重要启动因子 CNS损伤后的再生困难，损伤后的再生困难，Microglia的清除和巨噬的清除和巨噬细胞的募集缓慢造成不良的再生环境是重要原因细胞的募集缓慢造成不良的再生环境是重要原因（1）PNS损伤后再生轴突要进入损伤后再生轴突要进入CNS环境需环境需要适量的的炎性反应存在。要适量的的炎性反应存在。（2）巨噬细胞分泌的一些物质如）巨噬细胞分泌的一些物质如NGF、NT-3、血小板因子、血小板因子、IL-2等其促进轴突再生，表明炎等其促进轴突再生，表明炎性细胞分泌适量的活性物质可促进轴突再生。性细胞分泌适量的活
24、性物质可促进轴突再生。促进再生作用促进再生作用CNS再生困难是多种因素综合再生困难是多种因素综合作用的结果，复杂而有序。作用的结果，复杂而有序。去抑制作用去抑制作用与与CNS损伤修复损伤修复 CNS髓磷脂髓磷脂(myelin)中存在大量的轴突生长抑制因子如中存在大量的轴突生长抑制因子如MAG、OMgp、CSPG、Nogo等，造成了成年哺乳动物等，造成了成年哺乳动物CNS损伤后再生困难。损伤后再生困难。主要是通过神经元上一个由主要是通过神经元上一个由NgR、p75NTR和和LINGO-1组组成的复合受体将抑制信号传入细胞内，激活成的复合受体将抑制信号传入细胞内，激活Ras 家族家族RhoA，通过
25、，通过ROCK/LIM激酶引起肌动蛋白解聚导致生长激酶引起肌动蛋白解聚导致生长锥塌陷，起到抑制轴突再生的作用。锥塌陷，起到抑制轴突再生的作用。这些研究结果对去除中枢神经损伤后再生修复抑制作用提这些研究结果对去除中枢神经损伤后再生修复抑制作用提供了基础。供了基础。专题专题Robert L.Ruff et al,2008Hypothetical switch from actin-based to microtubule-based growth in regenerationof injured mature axonsNo injuryMolecular players of neurite
26、outgrowth inhibition in the CNS（Roman J.Giger et al,2008）引入特异性物质，对神经元细胞内传导的抑制引入特异性物质，对神经元细胞内传导的抑制信号进行阻断；信号进行阻断；使用抗体封闭抑制蛋白；使用抗体封闭抑制蛋白；借助基因敲除，制作抑制因子缺失突变体，借助基因敲除，制作抑制因子缺失突变体，改变抑制因子受体，关闭其产生生物效应；改变抑制因子受体，关闭其产生生物效应；在细胞内形成特异的在细胞内形成特异的siRNA对受体蛋白、信号蛋对受体蛋白、信号蛋白的形成进行白的形成进行RNA 干扰。干扰。去抑制作用去抑制作用 主要方式主要方式 交通事故；工程事
27、故交通事故；工程事故 火器伤；暴力损伤火器伤；暴力损伤 其它原因其它原因 美国：新增美国：新增1万万/年年Spinal Cord Injury专题专题临床临床脊髓损伤的治疗策略脊髓损伤的治疗策略 早期减轻继发性损伤造成的损害早期减轻继发性损伤造成的损害：采用离子通采用离子通道阻滞剂、氧自由基清除剂，小胶质细胞活性物质抑道阻滞剂、氧自由基清除剂，小胶质细胞活性物质抑制剂等治疗措施可以减轻神经元和胶质细胞的继发性制剂等治疗措施可以减轻神经元和胶质细胞的继发性损伤；损伤；中期促进再生：中期促进再生：诱导损伤轴突再生，替代损失诱导损伤轴突再生，替代损失的神经元，促进髓鞘再生；的神经元，促进髓鞘再生；晚
28、期功能恢复：晚期功能恢复：通过康复训练，恢复损伤节段通过康复训练，恢复损伤节段以下脊髓的功能。以下脊髓的功能。1 1、提供再生轴突延伸的支架、提供再生轴突延伸的支架组织工程组织工程 细胞移植：雪旺氏细胞、嗅鞘被膜细胞、神经细胞移植：雪旺氏细胞、嗅鞘被膜细胞、神经干细胞干细胞 组织移植：周围神经，胎儿神经组织组织移植：周围神经，胎儿神经组织 化学性大分子自溶性支架：聚乳酸等化学性大分子自溶性支架：聚乳酸等2 2、辅助治疗、辅助治疗 中和再生抑制分子：抗体中和再生抑制分子：抗体 神经营养因子：神经营养因子：NGF,GDNF 加入或促进导向分子表达加入或促进导向分子表达 物理治疗或电刺激促神经元再生
29、或激活内源性物理治疗或电刺激促神经元再生或激活内源性神经干细胞神经干细胞 脱髓鞘轴突的重新髓鞘化脱髓鞘轴突的重新髓鞘化 中草药，鲨鱼脑素（神经精中草药，鲨鱼脑素（神经精)神经干细胞与脊髓损伤修复神经干细胞与脊髓损伤修复 细胞移植细胞移植Transplantation of NSCTransplantation of NSC移植干细胞移植干细胞 NGF,BDNF,etc,NSC secretes neurotrophic factor一、传递营养因子或神经生长因子以一、传递营养因子或神经生长因子以阻止神经细胞的变性坏死或促其生长阻止神经细胞的变性坏死或促其生长二、二、NSC直接抟化为神经细胞直接
30、抟化为神经细胞 脑、脊髓损伤脑、脊髓损伤 脱髓鞘疾病脱髓鞘疾病三、诱导神经系统内源性干细胞三、诱导神经系统内源性干细胞CNS神经元持续产生区域神经元持续产生区域 室下区室下区SVZ subventricular zone 海马齿状回的粒下区海马齿状回的粒下区SGZ subgranular zone 脊髓中央管周围脊髓中央管周围干干细细胞胞增增 殖殖迁迁移移/分化分化胶质细胶质细胞途胞途径径神神经经元途元途径径前体前体细细胞胞靶靶点点形成新髓鞘形成新髓鞘抑制瘢痕抑制瘢痕引引导轴导轴突突以中以中间间神神经经元元构构成通路成通路调节调节未受未受损损通路通路替替换换受受损损神神经经元元移植干移植干细细
31、胞胞诱导诱导体体内内干干细细胞胞干细胞应用存在的问题干细胞应用存在的问题 1.免疫排斥免疫排斥hESC,BMCNSC 2.数量和质量供体细胞库数量和质量供体细胞库 3.伦理道德问题伦理道德问题 4.ESC畸胎瘤问题畸胎瘤问题 5.NSC定向诱导分化定向诱导分化spinal cord（glial cell）脊髓）脊髓中有某种物质在正常情况下限制或阻止干细胞分化中有某种物质在正常情况下限制或阻止干细胞分化成为新的神经元成为新的神经元 6.NSC活性保存时间活性保存时间本章总结 神经损伤与再生神经损伤与再生 神经元胞体反应神经元胞体反应 神经轴突对损伤的反应神经轴突对损伤的反应轴突溃变轴突溃变 神经再生神经再生 胶质细胞对胶质细胞对CNS再生的影响再生的影响 细胞移植与脊髓损伤细胞移植与脊髓损伤复习题 中枢神经系统损伤再生困难的原因是什么？中枢神经系统损伤再生困难的原因是什么？胶质细胞对中枢神经再生的影响胶质细胞对中枢神经再生的影响 脊髓损伤治疗的策略脊髓损伤治疗的策略 课外阅读：课外阅读：Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.Nature Biotechnology,2005,23(7):862-871Thank you！谢谢观看谢谢观看
