1、第十二章第十二章 免疫组织化学技术免疫组织化学技术n（Immunohistochemistry Technique，IHCT）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性特异性抗体抗体在组织细胞原位通过在组织细胞原位通过抗原抗体反应抗原抗体反应和和组织组织化学化学的呈色反应，对相应抗原进行的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定性、定位、定量测定定量测定的一项免疫检测方法的一项免疫检测方法。免疫组织化学技术的概念和特点免疫组织化学技术的概念和特点特点：特点：将免疫反应的将免疫反应的特异性特异性、组织化学的、组织化学的可见性可见性、分子生物学技术的分子生物学技术的敏
2、感性敏感性结合。结合。借助借助显微镜显微镜（电子或荧光）、在（电子或荧光）、在细胞或亚细细胞或亚细胞胞结构、检测各种抗原（蛋白、多肽、酶、结构、检测各种抗原（蛋白、多肽、酶、激素、病原体等）。激素、病原体等）。结构、功能与代谢的动态观察，为疾病诊断、结构、功能与代谢的动态观察，为疾病诊断、机制研究提供有力手段。机制研究提供有力手段。分类：分类：n酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术n荧光免疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术n免疫金（银）组织化学技术免疫金（银）组织化学技术n亲和组织化学技术亲和组织化学技术n免疫标记电镜组织化学技术免疫标记电镜组织化学技术第一节第一节 酶免疫组织化学技术酶免疫组
3、织化学技术定义定义:是在一定条件下，应用是在一定条件下，应用酶标抗体酶标抗体(抗原抗原)与与组织或细胞标本中的抗原组织或细胞标本中的抗原(抗体抗体)发生反应，催发生反应，催化底物产生化底物产生显色反应显色反应，通过显微镜识别标本中，通过显微镜识别标本中抗原抗原(抗体抗体)的分布位置和性质，也可通过图像的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。分析技术达到定量的目的。一、组织处理一、组织处理 n常用的标本有常用的标本有组织切片组织切片、组织印片组织印片和和细细胞涂片胞涂片等。等。n优点优点：染色标本可长期保存，染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可用普通光镜观察结果，可观察组织
4、细胞的细微结构。可观察组织细胞的细微结构。二、技术分类二、技术分类（一）酶标记抗体免疫组化技术（一）酶标记抗体免疫组化技术（二）非标记抗体酶免疫组化技术（二）非标记抗体酶免疫组化技术（一）酶标记抗体免疫组化染色（一）酶标记抗体免疫组化染色定义定义:借助借助交联剂交联剂的共价键将的共价键将酶酶直接连接在直接连接在抗体抗体上，酶上，酶标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催化作标抗体与靶抗原反应后，再通过对底物的特异性催化作用，生成不溶性用，生成不溶性有色产物有色产物，达到对抗原，达到对抗原定性、定量、定定性、定量、定位位检测的目的。检测的目的。常用的方法常用的方法:直接法直接法 间接法间接法
5、组织抗原组织抗原第一抗体第一抗体过氧化物酶过氧化物酶直接法直接法v 直接法直接法 HRPHRP标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原标记在特异性抗体（第一抗体）上，抗原-抗体抗体 HRPHRP复合物，加入底物显色。有色物质沉积在抗原抗体反应部位，复合物，加入底物显色。有色物质沉积在抗原抗体反应部位，从而可对组织或细胞抗原进行定位，定性，定量分析。从而可对组织或细胞抗原进行定位，定性，定量分析。特点：一步完成，方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，但敏感特点：一步完成，方法简便、省时，专一性强，非特异染色轻，但敏感性差，性差，一种标记抗体只能检测一种抗原一种标记抗体只能检测一种抗原。v 间接法两
6、步法间接法两步法 HRPHRP标记在第二抗体即抗抗体，标记在第二抗体即抗抗体，抗原抗原-特异性特异性抗体抗体-第二抗体第二抗体 HRPHRP复合物复合物特点：敏感性较直接法高，特点：敏感性较直接法高，一种标记抗体能用于相应动一种标记抗体能用于相应动物制备的多种特异性抗体，物制备的多种特异性抗体，检测多种抗原检测多种抗原。但较直接法。但较直接法费时，非特异染色稍重费时，非特异染色稍重。间接法酶标记抗体免疫组化间接法酶标记抗体免疫组化（二）非标记抗体酶免疫组化染色（二）非标记抗体酶免疫组化染色特点特点:n用用酶酶免疫动物，制备效价高、特异性强的免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体抗酶抗体n酶通
7、过免疫学反应与酶通过免疫学反应与抗酶抗体抗酶抗体及组织抗原上的及组织抗原上的第一抗体第一抗体结结合，最后经合，最后经酶酶分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检分子催化底物的显色反应，达到对抗原的检测测n避免了酶标记抗体对抗体的损伤避免了酶标记抗体对抗体的损伤，提高了方法的敏感性。，提高了方法的敏感性。主要有四种技术类型：主要有四种技术类型：酶桥法酶桥法PAPPAP法法双桥双桥PAPPAP法法碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（APPAAPAPPAAP）法）法技术类型技术类型1.1.酶桥法酶桥法：抗酶抗体作为抗酶抗体作为第三抗体（第三抗体（Ab3Ab3），通过第二抗体作，通过第二
8、抗体作桥抗体（桥抗体（Ab2Ab2），将结合在组织抗原上的，将结合在组织抗原上的第一抗体（第一抗体（Ab1Ab1）与与第三抗体第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原连接起来，最后形成酶联的抗原-抗体复合物，抗体复合物，底物显色。底物显色。底物底物+HRPHRP+二抗二抗/Ab2/Ab2兔源一抗兔源一抗/Ab1/Ab1Ag+兔源抗酶抗体兔源抗酶抗体/Ab3/Ab3AgAgAg-Ab1-Ab2-Ab3-HRPAg-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物复合物AgAg1.一抗和三抗都是兔源性，属于双抗原夹心法，都能与二抗连接一抗和三抗都是兔源性，属于双抗原夹心法，都能与二抗连接2.三抗抗体酶再与三抗抗体
9、酶再与HRP连接，避免了抗体的损伤和非特异染色连接，避免了抗体的损伤和非特异染色3.二抗在种属上与一抗（抗原）和三抗（酶）存在免疫学反应，二抗为羊抗兔二抗在种属上与一抗（抗原）和三抗（酶）存在免疫学反应，二抗为羊抗兔IgG 优点优点：敏感性较酶标法有所提高敏感性较酶标法有所提高 缺点：缺点：n操作分四步，较复杂操作分四步，较复杂n如果如果抗酶抗体与酶结合弱抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉，在操作中酶常被冲洗掉n如果如果抗酶抗体的非特异性成分抗酶抗体的非特异性成分与桥联抗体结合，结果与桥联抗体结合，结果就与抗酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会就与抗酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的影响
10、方法的敏感性。敏感性。2.PAP法法：1970年发现，年发现，是酶桥法的改良法。是酶桥法的改良法。PAP法将酶法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物复合物)：2个抗酶抗体个抗酶抗体+3个个HRP(五角形结构）五角形结构）+底物底物+二抗二抗/Ab2/Ab2兔源一抗兔源一抗/Ab1/Ab1AgAg+兔源兔源PAPPAP复合物复合物AgAgAg-Ab1-Ab2-PAPAg-Ab1-Ab2-PAP复合物复合物技术类型技术类型特点特点:要求第一抗与抗酶抗体的动物种属相同（兔源性）要求第一抗与抗酶抗体的动物种属相同（兔源性）P
11、APPAP复合物稳定复合物稳定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端 PAPPAP不存在游离的不存在游离的Ig,Ig,不易产生非特异染色，因此特异不易产生非特异染色，因此特异性、敏感性和重复性好。性、敏感性和重复性好。特别适用石蜡切片中微量抗原的检测或回顾性研究特别适用石蜡切片中微量抗原的检测或回顾性研究3.3.双桥双桥PAPPAP法法 基本原理基本原理:是在是在PAP法中通过法中通过两次连接桥抗体和两次连接桥抗体和PAP而建而建立起来的，通过双桥可结合更多的立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子复合物于抗原分子上。具有放大作用，适用于组织细胞上。具有放
12、大作用，适用于组织细胞微量抗原的检测。微量抗原的检测。技术类型技术类型两种放大原理A：重复桥联抗体与：重复桥联抗体与PAP复合复合物中抗酶抗体未饱和抗原位置物中抗酶抗体未饱和抗原位置结合，主要机制。结合，主要机制。B：重复桥联抗体与第一抗体：重复桥联抗体与第一抗体抗体未饱和抗原位置结合抗体未饱和抗原位置结合Ab1Ab2Ab34.APAAP法：法：有些组织细胞富含有些组织细胞富含内源性过氧化物酶内源性过氧化物酶，染色时就不宜使用染色时就不宜使用HRP体系。用体系。用碱性磷酸酶碱性磷酸酶代替代替HRP建立的碱性磷酸酶建立的碱性磷酸酶(AP)-抗碱性磷酶抗碱性磷酶(AAP)法，法，简称简称APAAP
13、法，如骨髓。法，如骨髓。+底物底物二抗二抗/Ab2/Ab2兔源一抗兔源一抗/Ab1/Ab1Ag兔源兔源APAAPAPAAP复合物复合物AgAgAgAg-Ab1-Ab2-APAAPAg-Ab1-Ab2-APAAP复合物复合物技术类型技术类型四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物（一）辣根过氧化物酶（一）辣根过氧化物酶（HRP）最常用底物二氨基联苯胺（最常用底物二氨基联苯胺（DAB)显棕色显棕色。此外还有，氨基乙基。此外还有，氨基乙基卡巴唑（卡巴唑（AEC），产物呈橘红色；），产物呈橘红色；4-氯氯-1-萘酚，反应物为灰蓝色。萘酚，反应物为灰蓝色。（二）碱
14、性磷酸酶（二）碱性磷酸酶（ALP）n偶氮偶联反应：底物偶氮偶联反应：底物-萘酚磷酸盐，水解后与快蓝与快红形萘酚磷酸盐，水解后与快蓝与快红形成深蓝色或红色沉淀物。成深蓝色或红色沉淀物。n靛蓝四唑反应：形成蓝紫色沉淀。靛蓝四唑反应：形成蓝紫色沉淀。HRPHRP染色结果比染色结果比APAP染色结果保存时间长；染色结果保存时间长；含有内源性含有内源性HRPHRP的组织切片（淋巴组织和肿瘤的组织切片（淋巴组织和肿瘤组织）首选标记酶为组织）首选标记酶为APAP；APAP和和HRPHRP结合可进行双重或结合可进行双重或3 3重免疫组化标记。重免疫组化标记。HRP和和AP染色比较染色比较CD68 胞浆阳性胞浆
15、阳性ER 核阳性核阳性E-钙粘素钙粘素 膜阳性膜阳性五、酶免疫组织化学技术的应用五、酶免疫组织化学技术的应用n提高病理诊断准确性；提高病理诊断准确性；n癌基因蛋白的临床应用；癌基因蛋白的临床应用；n对肿瘤细胞增生程度的评价，对肿瘤细胞增生程度的评价，如如Ki67为增为增殖细胞核抗原；殖细胞核抗原；n肿瘤转移和肿瘤分期肿瘤转移和肿瘤分期；n指导肿瘤靶向治疗。指导肿瘤靶向治疗。第二节第二节 荧光免疫组化技术荧光免疫组化技术定义定义:采用采用荧光素标记荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为的已知抗体（或抗原）作为探针探针，检测待测组织、细胞标本中的检测待测组织、细胞标本中的靶抗原靶抗原（或抗体），（或抗
16、体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微荧光显微镜下镜下，分辨出抗原，分辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，或抗体）的所在位置及其性质，并可利用并可利用荧光定量技术荧光定量技术计算其含量。以达到对抗原计算其含量。以达到对抗原(或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。一一、标本的制作、标本的制作标本的类型：标本的类型：涂片和印片涂片和印片 组织切片组织切片 培养的粘附细胞培养的粘附细胞 悬浮细胞悬浮细胞 活细胞活细胞标本的保存标本的保存 ：标本固定干燥后，标本固定干燥后，最好立即检测最好立即检测 保持干燥、置
17、保持干燥、置44甚至甚至-20-20 以下保存以下保存二、荧光免疫组化染色二、荧光免疫组化染色优点：优点：操作简便、特异性高操作简便、特异性高 缺点：缺点：敏感度偏低、一种荧光敏感度偏低、一种荧光抗体只能检测一种抗原，抗抗体只能检测一种抗原，抗体制备麻烦体制备麻烦抗原抗原标记抗体标记抗体标本标本载玻片载玻片 直接法直接法优点：优点：较直接法灵敏，敏感性高较直接法灵敏，敏感性高510倍，标记一种倍，标记一种抗体可以鉴定多种抗原。抗体可以鉴定多种抗原。缺点：缺点：非特异荧光、操作时间较长非特异荧光、操作时间较长间接法间接法二、荧光免疫组化染色二、荧光免疫组化染色 用两种荧光素分别标记用两种荧光素分
18、别标记两种不同的特异性抗体两种不同的特异性抗体，对同一，对同一标本中的相应两种抗原同时显示两种颜色的荧光标本中的相应两种抗原同时显示两种颜色的荧光。标记抗体标记抗体A A抗原抗原A A抗原抗原B B标记抗体标记抗体B B标本标本载玻片载玻片双标记荧光免疫染色法双标记荧光免疫染色法二、荧光免疫组化染色二、荧光免疫组化染色CD31，heart鹦鹉热衣原体鹦鹉热衣原体包涵体鉴定包涵体鉴定 三、荧光免疫组化技术的优缺点三、荧光免疫组化技术的优缺点n优点：优点：nAg和和Ab的特异性与形态的检查结合在一起。的特异性与形态的检查结合在一起。n能做到快速、敏感、定位。能做到快速、敏感、定位。n缺点：缺点：n
19、对组织细胞进行微细结构的观察做不到。对组织细胞进行微细结构的观察做不到。n标本不能永久保存，荧光有自然消退现象，标本不能永久保存，荧光有自然消退现象，需及时观察并照相。需及时观察并照相。n有非特异性荧光的干扰有非特异性荧光的干扰四、荧光免疫技术的应用四、荧光免疫技术的应用n病原体检测病原体检测n自身抗体检测自身抗体检测n免疫病理检测免疫病理检测n细胞表面抗体和受体检测细胞表面抗体和受体检测n蛋白质、激素、药物、肿瘤标志物、过敏原等蛋白质、激素、药物、肿瘤标志物、过敏原等测定测定第三节第三节 亲合组织化学技术亲合组织化学技术广义的：抗原广义的：抗原-抗体，植物凝集素抗体，植物凝集素-糖类，生物素
20、糖类，生物素-亲和素，亲和素，SPA-IgG，阳离子，阳离子-阴离子，配体阴离子，配体-受体受体 亲和组织化学亲和组织化学（Affinity histochemistry）是利用两种是利用两种物质之间的物质之间的高度亲合力高度亲合力而建立的一种方法。而建立的一种方法。植物凝集素、生物素和葡萄球菌植物凝集素、生物素和葡萄球菌A蛋白蛋白等，都对某种等，都对某种组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如荧光素、荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合。等结合。采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影采用荧光显微镜、酶加底物的显
21、色反应、放射自显影或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。的定位或定量。亲和组织化学技术亲和组织化学技术n生物素生物素-亲和素法亲和素法n葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A法法n凝集素法凝集素法n生物素生物素-链霉亲和素法链霉亲和素法一、生物素一、生物素-亲合素法亲合素法 生物素生物素/Biotin:即维生素即维生素H，是一种碱性蛋白，结构简单。是一种碱性蛋白，结构简单。咪唑酮环咪唑酮环结合亲和素结合亲和素戊酸侧链结合戊酸侧链结合抗体或其他分子抗体或其他分子 亲合素亲合素/Avidin:抗生物素蛋白，天然抗生物素蛋白，天然亲和素是四
22、聚体，具有亲和素是四聚体，具有4个与生物素亲个与生物素亲和力极高的结合位点。和力极高的结合位点。链酶亲和素链酶亲和素/streptavidin,SA：由链霉菌属细菌分泌的一种由链霉菌属细菌分泌的一种蛋白质，与亲和素有类似的生物学特性，具有蛋白质，与亲和素有类似的生物学特性，具有4个生物素分个生物素分子结合位点。子结合位点。III噻吩环噻吩环（一）亲合素（一）亲合素-生物素生物素-过氧化酶复合物技术过氧化酶复合物技术Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，ABC原理：原理：预先按一定比例将预先按一定比例将亲合素亲合素与与酶标生物素酶标生物素结合形成结
23、合形成可溶性的可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的复合物。当其与检测反应体系中的生物生物素化抗体素化抗体（直接法）或（直接法）或生物素化第二抗体生物素化第二抗体（间接法）（间接法）相遇时，相遇时，ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABC标记标记体系连成一体进行检测。体系连成一体进行检测。Ag-Ab-生物素生物素-亲和素亲和素-酶标生物素（酶标生物素（ABC)待测抗原待测抗原 非特异性抗原非特异性抗原A-A-亲合素亲合素 B-B-生物素生物素 E-E-酶酶ABC ABC 直接法
24、原理示意图直接法原理示意图（一）亲合素（一）亲合素-生物素生物素-过氧化酶复合物技术过氧化酶复合物技术Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，ABCABC ABC 间接法原理示意图间接法原理示意图待测抗原待测抗原非特异性抗原非特异性抗原A-A-亲合素亲合素 B-B-生物素生物素 E-E-酶酶（一）亲合素（一）亲合素-生物素生物素-过氧化酶复合物技术过氧化酶复合物技术Avidin Biotin Peroxidase Complex technique，ABC 缺点：缺点：有些组织如肝、肾、白细有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有胞、脂肪组织和
25、乳腺等有内源性生物素活性内源性生物素活性，需要，需要对组织进行预处理对组织进行预处理 ABC复合物在中性时带复合物在中性时带正正电荷电荷，容易与细胞核等带，容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合；负电荷结构非特异结合；亲合素为糖蛋白，可以与亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合。凝集素等碳水化合物结合。优点：优点：n敏感性高：桥联放大作用敏感性高：桥联放大作用n特异性高特异性高n一抗和二抗工作浓度低一抗和二抗工作浓度低n操作时间缩短操作时间缩短n可以多重标记可以多重标记（一）亲合素（一）亲合素-生物素生物素-过氧化酶复合物技术过氧化酶复合物技术Avidin Biotin Peroxidas
26、e Complex technique，ABC（二）桥联亲合素（二）桥联亲合素-生物素技术生物素技术Bridged Avidin-Biotin technique，BRAB原理：原理：是以是以游离的亲合素游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中价性，将检测反应体系中抗原抗原、生物素化抗体生物素化抗体复合物复合物与与标记生物素标记生物素联结起来，达到检测反应分子的目的。联结起来，达到检测反应分子的目的。最终形成的最终形成的抗原抗原-生物素化抗体生物素化抗体-亲合素亲合素-酶标生物素复酶标生物素复合物合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，可积聚
27、大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。BRAB BRAB 直接法原理示意图直接法原理示意图待测抗原待测抗原 非特异性抗原非特异性抗原A-A-亲合素亲合素 B-B-生物素生物素 E-E-酶酶Ag-Ab-生物素生物素-亲和素亲和素-酶标生物素酶标生物素（二）桥联亲合素（二）桥联亲合素-生物素技术生物素技术Bridged Avidin-Biotin technique，BRABBRAB BRAB 间接法原理示意图间接法原理示意图待测抗原待测抗原非特异性抗原非特异性抗原A-A-亲合素亲合素 B-B-生物素生物素
28、E-E-酶酶（二）桥联亲合素（二）桥联亲合素-生物素技术生物素技术Bridged Avidin-Biotin technique，BRAB（三）标记亲和素（三）标记亲和素-生物素技术生物素技术Labelled Avidin-biotin technique，LAB原理原理:以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测，接进行检测，Ag-Ab-生物素生物素-亲和素亲和素-酶。酶。以测以测IL-2为例为例特点特点:n相当高的灵敏度，相当高的灵敏度，n省略了加标记生物素步骤，操作较省略了加标记生物素步骤，操作较BRAB法简便。法简便。n间接间
29、接LAB法采用生物素化第二抗体，可进一步法采用生物素化第二抗体，可进一步提高提高 检测灵敏度。检测灵敏度。（三）标记亲物素（三）标记亲物素-生物素技术生物素技术（四）链霉亲合素（四）链霉亲合素-生物素法生物素法(LSAB）原理：利用原理：利用生物素结合的二抗生物素结合的二抗与与酶标记的链霉亲合酶标记的链霉亲合素蛋白素蛋白就组合成酶标链霉亲合素就组合成酶标链霉亲合素-生物素方法。生物素方法。（labelled streptavidin biotin technique,LSAB）Ag-Ab1-Ab2-生物素生物素-链酶亲和素链酶亲和素-酶酶LSAB法具有几大特点：法具有几大特点：n敏感性高：敏感
30、性高：酶标记酶标记SA,可结合更多的生物素化的可结合更多的生物素化的二抗，放大效应远远超过二抗，放大效应远远超过ABC法，且分子量小，法，且分子量小，穿透力强，增加敏感性。穿透力强，增加敏感性。n低背景着色低背景着色:等电点低（等电点低（6-6.5），所带正电荷少，），所带正电荷少，减少非特异性吸附。减少非特异性吸附。n操作时间缩短操作时间缩短:ABC法需法需100min，减少到，减少到35min。n一抗浓度低一抗浓度低（四）链霉亲合素（四）链霉亲合素-生物素法生物素法(LSAB）二、葡萄球菌二、葡萄球菌A蛋白法蛋白法定义定义:葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A/SPA是一种从金黄色葡萄是一种从金黄色
31、葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物动物IgG的的Fc段结合段结合，用，用SPA标记物（酶、荧标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测实验。反应的各种免疫检测实验。SPA可以和人及多种动物的可以和人及多种动物的IgG结合（人、豚鼠、兔、结合（人、豚鼠、兔、猪、小鼠、猴等），解决了不同动物检测时，需分别猪、小鼠、猴等），解决了不同动物检测时，需分别标记相应二抗的问题；标记相应二抗的问题；结合部位是结合部位是Fc段，因此不会影响抗体的活性段，因此不会影响抗体的活性；具有具有双价结合力
32、，可结合两个双价结合力，可结合两个IgG分子。分子。对对IgG 亚型的结合有选择性，可能出现的假阴性结果。亚型的结合有选择性，可能出现的假阴性结果。SPA可结合人可结合人IgG1、2或或4，但不结合，但不结合IgG3。常用常用HRP标记，染色程序基本同酶标记抗体法，仅二标记，染色程序基本同酶标记抗体法，仅二抗改用抗改用SPA-HRP，Ag-Ab-SPA-HRP。二、葡萄球菌二、葡萄球菌A蛋白法蛋白法三、凝集素法三、凝集素法凝集素凝集素/lectin：一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的组织中提纯的糖蛋白糖蛋白或或结合糖结合糖的蛋白质，可使的蛋
33、白质，可使红细胞凝集红细胞凝集故故称凝集素，具有与称凝集素，具有与特定糖基特定糖基专一结合的特性。专一结合的特性。凝集素法一方面利用凝集素可以与凝集素法一方面利用凝集素可以与标记物标记物结合，另一方面又结合，另一方面又可以与可以与细胞膜糖基细胞膜糖基结合所形成一种亲合反应。结合所形成一种亲合反应。凝集素受体：存在细胞膜上的糖蛋白和糖脂中凝集素受体：存在细胞膜上的糖蛋白和糖脂中寡糖寡糖。是研究。是研究肿瘤细胞膜糖变化的理想工具。肿瘤细胞膜糖变化的理想工具。直接法直接法是将标记物直接标记在凝集素上，是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合
34、。间接法间接法是先将是先将凝集素凝集素与组织细胞膜糖基结与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的合，然后再用标记的抗凝集素抗体抗凝集素抗体与结合与结合在细胞上的在细胞上的凝集素凝集素反应。反应。糖糖-凝集素凝集素-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个形成一个“三明治样三明治样”的结合物。的结合物。三、凝集素法三、凝集素法第四节第四节 免疫电镜技术免疫电镜技术一、免疫标记电镜技术的原理一、免疫标记电镜技术的原理l免疫电子显微镜技术（免疫电子显微镜技术（Immun
35、oelectron Microscope，IEM）：）：是利用是利用高电子密度的高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记铁蛋白等）标记抗体抗体，或用经免疫组织，或用经免疫组织/细胞化学反应能细胞化学反应能产生高电子密度产物，在产生高电子密度产物，在电子显微镜电子显微镜下对高电子密度标下对高电子密度标记的抗原（抗体）进行记的抗原（抗体）进行亚细胞亚细胞水平定位的技术。水平定位的技术。l特点特点:定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器；在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点
36、。优点。二、免疫标记电镜技术标本的制备要求二、免疫标记电镜技术标本的制备要求 保存良好的保存良好的细胞超微结构细胞超微结构，注意保持组织的，注意保持组织的抗原性抗原性；在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强；在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强；选择的试剂能选择的试剂能顺利穿过组织顺利穿过组织；在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。薄切片免疫染色三种。优点优点切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应；易于获得良
37、好的免疫反应；可在可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下，提高电镜下的检出率；的检出率；特别适用于含抗原量较少的组织；特别适用于含抗原量较少的组织；包埋前染色包埋前染色缺点：缺点：经过一系列的免疫染色步骤，常出现一定的超微结经过一系列的免疫染色步骤，常出现一定的超微结构损伤。构损伤。组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片后，再进行免疫组化染色。超薄切片后，再进行免疫组化染色。包埋后染色包埋后染色 优点优点超微结构保存较好，方法简便，阳性结构有高超微结构保存较好，方法简便，阳性结构有高度的可重复性度的可重复性，还
38、能在同一张切片上进行多重免，还能在同一张切片上进行多重免疫染色。疫染色。缺点缺点抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失。甚至丧失。将组织置于将组织置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速冻，蔗糖液中，以液氮速冻，在冰冻超薄切片机上切片，切片厚度可略厚在冰冻超薄切片机上切片，切片厚度可略厚于常规树脂切片于常规树脂切片。超薄冷冻切片超薄冷冻切片优点优点不需经固定、脱水、包埋等步骤，直接进行免不需经固定、脱水、包埋等步骤，直接进行免疫染色，所以抗原性保存较好，疫染色，所以抗原性保存较好，兼有包埋前和包兼有包埋前和包埋后染色的优点。埋后染色的优点。n免疫
39、胶体金染色法免疫胶体金染色法n免疫胶体铁细胞化学染色法免疫胶体铁细胞化学染色法n酶免疫电镜技术酶免疫电镜技术三、常用的免疫标记电镜技术三、常用的免疫标记电镜技术三、常用的免疫标记电镜技术三、常用的免疫标记电镜技术（一）免疫胶体金染色法（一）免疫胶体金染色法u免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以是以胶体金胶体金作为示踪标志物应用于抗作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型的免疫标记技术。原抗体检测的一种新型的免疫标记技术。分类：分类：1.透射电镜（透射电镜（TEM)根据染色步骤分直接法和间接法；根据标记与包埋根据染色步骤分直接法和间接法；根据标记与包埋前后的关系，分为包埋前和后标记法前后的关系，分
40、为包埋前和后标记法2.扫描电镜扫描电镜(SEM)根据胶体金能发射二次电子的能力，可用作标记物。根据胶体金能发射二次电子的能力，可用作标记物。一般选一般选20-75nm的颗粒，用于细胞表面成分研究。的颗粒，用于细胞表面成分研究。免疫胶体金染色法免疫胶体金染色法应用：应用：n细胞表面成份的研究；细胞表面成份的研究；n与冷冻蚀刻技术结合与冷冻蚀刻技术结合-细胞膜蛋白颗粒或其它细胞膜蛋白颗粒或其它膜成份进行精细定位；膜成份进行精细定位；n电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基因位点。出基因位点。用胶体金用胶体金-SPA复合物复合物-Ab-Ag 法法观察核糖
41、体蛋白在染色质中的分观察核糖体蛋白在染色质中的分布，布，bar=0.5m研究细菌的菌毛（丁香假单胞菌）研究细菌的菌毛（丁香假单胞菌）bar=0.5m（二）免疫胶体铁细胞化学染色法（二）免疫胶体铁细胞化学染色法 胶体铁是一种胶体铁是一种阳离子胶体阳离子胶体，将抗体分子标记上胶，将抗体分子标记上胶体铁，通过体铁，通过普鲁士蓝普鲁士蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一定电子密度，可用在电镜和光定大小，还具有一定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。镜水平的抗原定位研究。（三）酶免疫电镜技术（三）酶免疫电镜技术 酶的高效催化作用，对底物反应形成不同的酶的高效催化作
42、用，对底物反应形成不同的电子密度，用电子显微镜观察，通过对酶的定位电子密度，用电子显微镜观察，通过对酶的定位对抗原或抗体定位。对抗原或抗体定位。第第 五节五节 免疫组织化学技术的临床应用免疫组织化学技术的临床应用（自学）（自学）免疫组织化学的基本过程包括：免疫组织化学的基本过程包括：1.1.抗原的提取与纯化；抗原的提取与纯化；2.2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.3.将标记物与抗体结合形成标记抗体；将标记物与抗体结合形成标记抗体；4.4.标本的处理与制备；标本的处理与制备；5.5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应；抗
43、原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应；6.6.观察结果。观察结果。第六节第六节免疫组织化学技术要点免疫组织化学技术要点（一）标本的主要来源（一）标本的主要来源n活体组织：活体组织：各种实验动物及人体活检标本；各种实验动物及人体活检标本；n各种体液及穿刺液：各种体液及穿刺液：直接涂片或离心沉淀；直接涂片或离心沉淀；n培养细胞：培养细胞：悬浮细胞离心沉淀作细胞涂片、悬浮细胞离心沉淀作细胞涂片、单层细胞直接涂片固定。单层细胞直接涂片固定。一、标一、标 本本 的的 处处 理理(二）标本的固定与保存二）标本的固定与保存固定目的固定目的：良好的固定是免疫组织化学结果可靠的重要保：良好的固定是免疫组织化学结果
44、可靠的重要保证。证。固定的意义固定的意义：防止细胞自溶、保持细胞形态和结构、保持：防止细胞自溶、保持细胞形态和结构、保持组织的抗原性、防止标本脱落、去除脂质、抑制细菌的繁组织的抗原性、防止标本脱落、去除脂质、抑制细菌的繁殖。殖。固定的原则固定的原则：不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结合。结合。固定剂的选择：固定剂的选择：必须根据其性质及所进行的组织化学必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂反应选择适当的固定剂 n蛋白质类抗原：乙醇或甲醇蛋
45、白质类抗原：乙醇或甲醇n微生物类抗原：丙酮或三氯化碳微生物类抗原：丙酮或三氯化碳n多糖类抗原：多糖类抗原：10%10%福尔马林固定福尔马林固定n类脂丰富的组织：用有机溶剂处理类脂丰富的组织：用有机溶剂处理单一固定液：甲醛、酒精等单一固定液：甲醛、酒精等混合固定液：如混合固定液：如Bouin液、液、Zenker液等。液等。Bouin液：苦味酸饱和液（液：苦味酸饱和液（1.22%）75 ml，福尔马林，福尔马林25 ml，冰，冰醋酸醋酸5ml。(二）标本的固定与保存二）标本的固定与保存抗原抗原固定剂固定剂固定温度与时间固定温度与时间蛋白质蛋白质95%乙醇乙醇室温，室温，315min免疫球蛋白免疫球
46、蛋白丙酮丙酮4，30 min酶酶四氯化碳四氯化碳4，30 min激素激素1%多聚甲醛多聚甲醛4，45 h细菌细菌丙酮，甲醇丙酮，甲醇室温，室温，310min病毒病毒丙酮、无水乙醇、四丙酮、无水乙醇、四氯化碳氯化碳4，3060 min类脂类脂10%甲醛甲醛室温，室温，310min细胞悬液细胞悬液1%的多聚甲醛的多聚甲醛室温，室温，2 min各种抗原的固定方法各种抗原的固定方法制片方法的评价制片方法的评价：n冰冻切片：适用不稳定的抗原（首选）冰冻切片：适用不稳定的抗原（首选）n石蜡切片：形态研究的主要方法。可观察细胞结石蜡切片：形态研究的主要方法。可观察细胞结构的理想方法、陈旧切片的回顾性研究，可
47、长期构的理想方法、陈旧切片的回顾性研究，可长期保存保存(二）标本的固定与保存二）标本的固定与保存二、抗二、抗 原原 的的 保保 存存 与与 修修 复复抗原修复抗原修复:使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即即抗原修复抗原修复。常用的方法有：常用的方法有：酶消化法酶消化法 盐酸水解法盐酸水解法 微波法微波法 高压锅法高压锅法 煮沸法煮沸法不同方法适用不同类型的抗原的修复，通过预实验探讨合适的条件。不同方法适用不同类型的抗原的修复，通过预实验探讨合适的条件。三、抗三、抗 体体 的的 处处 理理 与与 保保 存存（一）抗体的选择（一）抗体的选择注意选择具有注意
48、选择具有高特异性、稳定高特异性、稳定的优质抗体的优质抗体多克隆抗体多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低，有敏感性较高、特异性相对较低，有交叉反应，适用交叉反应，适用石蜡包埋的组织切片石蜡包埋的组织切片，单克隆抗体单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低特异性较高、敏感性相对较低（二）抗体的稀释（二）抗体的稀释抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度三、抗三、抗 体体 的的 处处 理理 与与 保保 存存（三）抗体的保存（三）抗体的保存分装密封保存，避免对抗体的污染分装密封保存，避免
49、对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价、量）并注明标记（批号、名称、效价、量）根据厂家提供的保存条件保存根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低避免反复冻融而使抗体效价降低三、抗三、抗 体体 的的 处处 理理 与与 保保 存存四、结四、结 果果 判判 断断（一）设立对照实验（一）设立对照实验：阳性对照：已知阳性抗原，证明显色程序正确。阳性对照：已知阳性抗原，证明显色程序正确。阴性对照：不含已知抗原的标本为对照，主要目的排阴性对照：不含已知抗原的标本为对照，主要目的排 除假阳性。除假阳性。空白实验：用空白实验：用PBSPBS代替第一抗体，排除内源性的代替第一抗体，排除内源性的生物
50、素生物素和内源性酶和内源性酶。替代试验：用替代试验：用同种动物免疫前同种动物免疫前或非免疫血清，替代或非免疫血清，替代第第一抗体一抗体，排除，排除异嗜性抗原异嗜性抗原所致的非特异性反应。所致的非特异性反应。吸收或阻断试验：吸收或阻断试验：过量的已知抗原过量的已知抗原与第一抗体反应，与第一抗体反应，结果应为阴性或弱阳性，结果应为阴性或弱阳性，确认天然抗原引起的抗原抗确认天然抗原引起的抗原抗体反应体反应必须设立对照必须设立对照 阳性细胞显色分布类型：阳性细胞显色分布类型：细胞质、细胞核、细胞细胞质、细胞核、细胞膜表面膜表面阳性细胞显色：抗原分布于细胞核阳性细胞显色：抗原分布于细胞核（二）阳性结果（
