1、 第十一章 固相膜免疫分析技术（solid phase membrane-based immunoassy）定义：定义：以微孔滤膜微孔滤膜为固相载体固相载体微孔膜具有多孔性，像滤纸可被液体穿过（穿流）；也可向毛细管作用在膜上泳动(侧向横流)标记物标记物：酶或各种有色离子酶或各种有色离子（彩色乳胶、胶体金或胶体硒）标记抗体或抗原被检物被检物：通过抗原抗体反应检测抗原或抗体结果:可见的显色结果固相膜免疫分析技术固相膜免疫分析技术固相膜免疫测定的特点固相膜免疫测定的特点优点优点不足之处不足之处简便，快速（简便，快速（1015min）敏感度略低敏感度略低，价格略高（与，价格略高（与ELISAELISA
2、比比精密度较差，质控困难精密度较差，质控困难保存期长保存期长（优质试剂）（优质试剂）稳定性较差（普通试剂）稳定性较差（普通试剂）可测定物范围广（可测定物范围广（定性试验定性试验）不易制备定量、半定量试剂不易制备定量、半定量试剂不需大型仪器不需大型仪器斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatography assay,DICA)临床上常用的固相膜免疫技术：临床上常用的固相膜免疫技术：斑点酶免疫吸附试验斑点酶免疫吸附试验(dot enzyme
3、linked immunospot assay,Dot-ELISA)免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)胶体金免胶体金免疫技术疫技术第一节第一节 胶体金免疫技术胶体金免疫技术colloidal gold immunoassay1.1.原理：原理：以硝酸纤维素膜为载体，以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。2.2.常用胶体金免疫诊断方法常用胶体金免疫诊断方法 斑点免疫金渗滤试验和斑点金免疫层析试验斑点免疫金渗滤试验和斑点金免疫层析试验一、胶体金和免疫金的制备一、胶体金和免疫金的制备(p46)(p46)定义：定义：金盐被还原为金
4、原子后形成的金颗粒悬液结构：结构：基础金核（原子原子Au）和双离子层内层：负离子层AuCl2-外层：正离子层的H+金颗粒间因静电作用互相排斥，成稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液。（一）胶体金（一）胶体金（colloidal gold）胶体金特性胶体金特性 胶体特性 呈色性和光吸收性 稳定性 聚沉现象1.1.胶体特性胶体特性 1100 nm，微小微小颗粒稳定、均匀、颗粒稳定、均匀、呈呈单一分散状态，成胶体金溶液。单一分散状态，成胶体金溶液。对电解质敏感对电解质敏感：可破坏胶体金的外周水化层胶体金凝聚成大颗粒沉淀 某些蛋白质分子可稳定胶体金2.2.呈色性和光吸收性呈色性和光吸收性 随颗粒大小
5、改变。随颗粒大小改变。颗粒大小不同，呈色不同：颗粒大小不同，呈色不同：（小）25 nm 橙黄色；（中）1020 nm 酒红色；（较大）3080 nm紫红色。光吸收性也不同：光吸收性也不同：随着直径增大，可见光区最大吸收峰波长增长，A680/A519比值增大。肉眼观察胶体金颜色或测定其吸收峰波长的变化粗略预估胶体金直径大小预估胶体金直径大小胶体金颗粒胶体金颗粒（nmnm）胶体金特性胶体金特性 呈色呈色 maxmax（nmnm）1616酒红色酒红色51851824.524.5橙红色橙红色5225224141红色红色5255257171紫色紫色535535不同直径金颗粒的呈色性和光吸收性不同直径金颗
6、粒的呈色性和光吸收性3.3.稳定性稳定性 溶胶又是不稳定的体系，其溶剂化作用很弱，碰撞时有合并为较大、较重颗粒的倾向。影响因素：胶粒间的相互吸引力：胶粒间的相互吸引力：距离近，距离近，引力大导致胶引力大导致胶体颗粒合并变大体颗粒合并变大 胶粒与溶剂化层带电情况胶粒与溶剂化层带电情况：各金胶带相同的电荷，同性电荷相斥，双电层越厚，胶粒带电量愈大，排斥力越大，越稳定排斥力越大，越稳定。溶剂膜斥力：溶剂膜斥力：金颗粒间有一层厚的溶剂化膜，反抗金颗粒接近。膜斥力越大，越稳定膜斥力越大，越稳定。4.4.聚沉现象聚沉现象 电解质：电解质：中和胶体金颗粒的电荷量，使溶剂层变薄，胶粒间排斥力减少，合并趋势增强
7、。温度：温度：越高，吸附能力减弱，溶剂化程度降溶剂化程度降低低，不稳定性增加 浓度：浓度：越高，粒子间距减少，引力增加引力增加（二）胶体金的制备（二）胶体金的制备1.1.制备原理（化学合成法）制备原理（化学合成法）氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。常用还原剂常用还原剂：柠檬酸三钠柠檬酸三钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等，根据还原剂的强弱可制备直径为0.8150 nm不等的胶体金。配制0.01 HAuC14溶液，100mL 搅拌，煮沸 快速加入1柠檬酸三钠，2mL 煮沸15min，移除热源，继续搅拌至室温 恢复至原体积。d=16 nm1 min内溶液由淡
8、黄色转为灰色黑色酒红色2.2.常用制备方法常用制备方法胶体金颗粒（nm）1%柠檬酸三钠(mL)*162.0024.51.50411.00710.70胶体金粒径与柠檬酸三钠加入量的关系胶体金粒径与柠檬酸三钠加入量的关系加入不同量的柠檬酸三钠即可得不同粒径的胶体金加入不同量的柠檬酸三钠即可得不同粒径的胶体金降低降低增大增大*100mL，0.01%氯金酸中加入的柠檬酸三钠3.3.鉴定和保存鉴定和保存（1 1）鉴定：）鉴定：粒径大小、粒径均一性，有无凝集颗粒粒径大小、粒径均一性，有无凝集颗粒 肉眼观察肉眼观察：日光下观察颜色和浊度，若清亮透明即良好胶体金，若浑浊或液体表面有漂浮物提示有凝集颗粒。分光光
9、度计分光光度计：获得最大吸收波长（见图）透射电镜透射电镜：精确测量精确测量胶体金平均粒径。测量100个以上，计算平均直径和标准差，平均平均直径（颗粒大小），标准差（均一性）直径（颗粒大小），标准差（均一性）粗粗略略估估计计金纳米微粒体系的吸收光谱1.12 nm;2.19nm;3.24nm;4.33nm;5.41nm金纳米球电镜照片图金纳米球电镜照片图 A A：20nm20nm；C C金纳米棒：金纳米棒：515121nm21nm50 nm50 nm100 nm100 nm王康林王康林.纳米金共振散射相关光谱及其应用纳米金共振散射相关光谱及其应用,2008,2008优优 质质劣劣 质质（2 2）保
10、存）保存：洁净的玻璃容器；室温避光无灰尘环境中保存3个月，4保存半年 避免冻存避免冻存：导致胶体金聚集。2020天内标记：胶体金的不稳定性天内标记：胶体金的不稳定性（三）免疫金的制备（三）免疫金的制备(P53)(P53)1.1.制备原理：制备原理：原理：原理：胶体金与抗原或抗体等大分子的结合。实质：实质：抗原或抗体吸附在胶体金表面。吸附机制吸附机制：不明确，可能是静电吸附作用。静电吸附作用。胶体金表面带负电荷蛋白质含正电荷的基团静电吸附作用牢固结合静电吸附作用牢固结合。优点优点：物理吸附，不影响蛋白质的性质。：物理吸附，不影响蛋白质的性质。2.2.技术要点：技术要点：（1）胶体金溶液胶体金溶液
11、pHpH的调整的调整（吸附作用取决于pH）接近蛋白质等电点或偏碱：接近蛋白质等电点或偏碱：低于等电点胶体金聚集失去结合能力。用0.1 mol/L K2CO3和0.1 mol/L HCl维持pH标记标记IgGIgG（9.09.0）标记标记McAbMcAb（8.28.2）亲和层析抗体（亲和层析抗体（7.67.6）SPASPA（5.96.25.96.2）ConAConA（8.08.0）亲和素（亲和素（910910）（2 2）蛋白质的最适标记量：）蛋白质的最适标记量：方法方法：标记蛋白系列稀释标记蛋白系列稀释各取一定量加入定量的胶体金试管中各取一定量加入定量的胶体金试管中加入加入NaClNaCl，混匀
12、后静置数小时，混匀后静置数小时设置对照管：不加蛋白或加入蛋白量不够。设置对照管：不加蛋白或加入蛋白量不够。结果：结果：从对照管开始溶液由蓝色逐变为红色。选维持红色管的最低蛋白含量作为稳定胶体金所必稳定胶体金所必须的最适标计量须的最适标计量NaClAuNPs蛋白质的最适标计量蛋白质的最适标计量对照对照倍比稀释蛋白质倍比稀释蛋白质混匀，静置数小时混匀，静置数小时 原则：原则：p稳定胶体金所必须的最适标计量p在最适标记量基础上增加蛋白含量增加蛋白含量10%20%即为即为标记全部胶体金溶液所需标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量的蛋白总量（3 3）标记过程：）标记过程：在确定胶体金与蛋白的最适用比例后 磁
13、力搅拌下磁力搅拌下，将蛋白溶液逐渐加入胶体金溶液中 数分钟后加入稳定剂稳定剂（5%BSA或1%PEG20 000）（4 4）金标记的纯化）金标记的纯化 目的目的：除去未标记的蛋白、未充分标记的胶体金以及标记过程中形成的聚合物。方法方法：超速离心，凝胶过滤法3.3.注意事项：注意事项：（1 1）pHpH调节：调节：注意胶体金可阻塞pH计的电极，不可直接插入胶体金中 先用终浓度为0.1%PEG20 000稳定胶体金（2 2）蛋白质含盐量较高或形成聚合物影响标记过程。标记前用低浓度盐水透析数小时并高速离心除去聚合物。4.4.免疫金保存免疫金保存 用含稳定剂的缓冲液稀释成工作液保存。缓冲液缓冲液：中性
14、PBS或Tris缓冲液稳定剂稳定剂：蛋白质、葡萄糖（最常用）蛋白质、葡萄糖（最常用）、PEG20 000、明胶 在免疫金中加50%甘油：-18可保存一年以上二、胶体金免疫技术的方法学二、胶体金免疫技术的方法学种类与原理种类与原理（p125-p127p125-p127）（一）斑点金免疫层析法（一）斑点金免疫层析法（dot imumunogold chromatographic assay,DICA）1.1.原理原理 胶体金标记技术胶体金标记技术与蛋白质层析技术蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。样品借助毛细作用在层析条上泳动 与固相的抗原或抗体
15、结合形成复合物被富集或截留 目测显色情况，判断结果LATERAL FLOW TEST STRIP OF VEDALAB30胶体金标记物胶体金标记物2.2.方法类型方法类型（1 1）双抗体夹心法）双抗体夹心法-检测大分子抗原检测大分子抗原阳性：阳性：T和和C处都变红色；处都变红色；阴性：只有阴性：只有C处变红色处变红色G-金标特异性抗体（兔型）金标特异性抗体（兔型）A-标本标本T-特异性抗体（兔型）特异性抗体（兔型）C-二抗（羊抗兔免疫球蛋白抗体）二抗（羊抗兔免疫球蛋白抗体）过量过量 阳性阳性阴性阴性无效无效T TC C（2 2）竞争法）竞争法-检测小分子抗原检测小分子抗原免疫层析竞争法原理示意
16、图免疫层析竞争法原理示意图A-A-标本标本;G-;G-金标抗体金标抗体;T-;T-标准抗原标准抗原C-C-二抗（羊抗兔免疫球蛋白抗体二抗（羊抗兔免疫球蛋白抗体）阴性阴性阳性阳性T带不变色C带都变红色T和C带变红色少量少量3.3.技术要点技术要点（1 1）试剂盒的组成）试剂盒的组成 主要成分胶体金层析条主要成分胶体金层析条 所用试剂全部所用试剂全部为干试剂为干试剂（2 2）操作要点：）操作要点：加样加样将试剂条标记线一端侵入待测标本中25 s或在标本加样处加一定量待检标本，平放平放 520 min520 min内观察结果内观察结果 结果判断结果判断：因方法而异。注意无棕红色线质控带出现：因方法而
17、异。注意无棕红色线质控带出现则试剂无效。则试剂无效。（二）斑点金免疫渗滤试验（二）斑点金免疫渗滤试验（dot imumunogold filtration assay,DIGFA）1.1.原理原理 硝酸纤维素膜包被抗原或抗体洗涤液阳性：膜上呈呈红色斑点红色斑点是床旁实验（是床旁实验（point of care test,POCT）主）主要方法之一，整个检要方法之一，整个检测测5min快速免疫反应无关成分流过渗滤装置+标本（抗体或抗原）免疫反应，浓缩胶体金+免疫金盖盖微孔膜微孔膜吸水垫料吸水垫料底板底板斑点免疫金渗滤装置斑点免疫金渗滤装置塑料小盒塑料小盒吸水垫吸水垫固相抗体或抗原的硝酸纤维素膜固
18、相抗体或抗原的硝酸纤维素膜2.2.方法类型方法类型（1 1）双抗体夹心法：）双抗体夹心法：加入标本（抗原抗原）与膜上的抗体快速结合，浓缩胶体金标记抗体，免疫反应，浓缩标记抗体，免疫反应，浓缩洗涤液洗去未结合的免疫金阳性：膜上呈呈红色，胶体金红色，胶体金聚集聚集硝酸纤维素膜上包被抗体包被抗体AB固相固相Ab（NC膜）膜）-待测待测Ag-Ab-胶体金胶体金红色红色洗涤液洗涤液洗涤液洗涤液（2 2）间接法：）间接法：加入标本（抗体抗体）与膜上的抗原结合，浓缩胶体金标记羊抗人标记羊抗人IgGIgG抗体，免疫反应抗体，免疫反应洗涤液阳性：膜上呈红呈红色（胶体金聚集）色（胶体金聚集）硝酸纤维素膜上包被抗原
19、包被抗原洗涤液易产生假阳性假阳性，少用。人血清标本中含有非目的IgG的干扰设质控设质控质控点大小或质控点大小或性状不同于检性状不同于检测点测点DIGFADIGFADICADICA试剂形式试剂形式渗滤装置及附渗滤装置及附加试剂加试剂试剂条试剂条试剂保存试剂保存4 48 68 6个月个月室温一年室温一年操作步骤操作步骤3 35 51 1观察时间观察时间5 min5 min5 520 min20 min阳性反应颜色阳性反应颜色浓度浓度操作结束颜色操作结束颜色不变不变颜色逐渐加深颜色逐渐加深（三）临床应用及评价（三）临床应用及评价1.1.金免疫测定技术特点金免疫测定技术特点 操作简便、快捷、操作人员不
20、需技术培训 无需仪器设备，试剂稳定、便于保存 适于适于“床旁检验床旁检验”2.2.灵敏度问题灵敏度问题不及酶标法和酶发光免疫测定法3.3.临床应用：临床应用：定性或半定量试验 主要用于正常体液中不存在的物质 正常含量极低特殊情况下异常升高的物质（人HCG）第二节第二节 其他膜载体免疫分析技术其他膜载体免疫分析技术以酶作为标记物的固相膜免疫分析技术 斑点酶免疫吸附试验斑点酶免疫吸附试验 免疫印迹试验免疫印迹试验一、斑点酶吸附试验一、斑点酶吸附试验（dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA）（一）原理（一）原理 原理同常规的ELISA 不同之处
21、：载体为硝酸纤维素膜载体为硝酸纤维素膜（NC）吸附蛋白能力强，取代聚苯乙烯阳性：有色沉淀物斑点酶吸附试验原理示意图洗涤洗涤洗涤洗涤包被抗原包被抗原1.1.抗原包被膜抗原包被膜 12 L抗原于膜上包被后进行封闭2.2.抗原抗体反应抗原抗体反应 滴加样品血清，待检抗体与膜上抗原反应 洗涤后加酶标记二抗。3.3.确定酶结合物最佳稀释度确定酶结合物最佳稀释度 阴性样品不显色，阳性样品显色最强的酶结合物稀释度4.4.显色显色 加底物（HRP：盐酸联苯胺）形成不溶有色物不溶有色物 阳性：肉眼可见的染色斑点 （二）技术要点（二）技术要点优点优点灵敏度高：NC吸附能力强，微量抗原吸附完全，故灵敏度比普通ELI
22、SA高68倍试剂用量少：比ELISA节约10倍实验及结果判断简单：不需仪器试剂稳定：吸附抗原（抗体）或已有结果的膜可长期保存可同时检测多种抗体（三）方法学评价（三）方法学评价二、免疫印迹试验（二、免疫印迹试验（immunoblot test，IBT）（一）原理（一）原理凝胶电泳凝胶电泳+免疫化学分析技术免疫化学分析技术 又称又称Western blot技术技术 检测蛋白质特性、表达与分布的最常用方法检测蛋白质特性、表达与分布的最常用方法 按分子大小分离按分子大小分离 SDS-PAG：分离待检抗原：分离待检抗原 电转移条带至电转移条带至NC:100 v，12 A，通电，通电45 min 酶免疫定
23、位酶免疫定位:+特异性抗体；特异性抗体；+二抗二抗:HRP标记标记；显色：；显色：二氨基联苯胺（棕色）或二氨基联苯胺（棕色）或4-氯氯-1-萘酚（蓝紫色）萘酚（蓝紫色）根据根据SDS-PAGE时加入分子量标准确定各组分的分子量时加入分子量标准确定各组分的分子量引自王少辉博士论文引自王少辉博士论文（二）分类（二）分类 蛋白免疫印迹试验蛋白免疫印迹试验 重组免疫印迹试验重组免疫印迹试验混合抗原样品单向或双向电泳分离转印到固相载体上（NC膜，尼龙膜等），保持生物学活性不变作为抗原检测相应抗体（如酶、发光剂）与标记的而抗体反应（显色、发光检测）实现对特异性抗体进行检测如HIV抗体确认试验利用基因重组的
24、方法，将各种抗原表达、纯化后，包被在NC膜上，直接作为检测试剂条；或者直接合成抗原多肽用于病原体确认试验、复杂抗原成分的病原体分析、自身抗体的检测等特异性较ELISA高，灵敏度稍差HIVHIV确证试验仪器和试剂确证试验仪器和试剂1.抗体的性质抗体的性质：多选多克隆（识别耐变性表位），单克隆不能与变性抗原反应2.灵敏度提高方法灵敏度提高方法:浓度低先浓缩或使用化学发光试剂、荧光试剂3.应用局限性应用局限性：易出现假阳性或误差；一般不识别对构象依赖的表位的抗体，造成漏检。（三）方法学评价（三）方法学评价1.特异性强特异性强：可定性或定量检测第含量的抗原2.吸附蛋白能力强吸附蛋白能力强:NC膜吸附能力强，保存时间长3.操作简单，适合基层单位使用操作简单，适合基层单位使用4.膜条可重复检测应用膜条可重复检测应用（三）方法学评价（三）方法学评价
