1、公开课分解纤维素的微生物的分离JLSSYJLSSYBYHBYH一、基础知识一、基础知识 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过物每年产生的纤维素超过7070亿吨，其中亿吨，其中40%-60%40%-60%能被能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。累。在草食性动物等的消化道内，也在草食性动物等的消化道内，也共生有分解共生有分解纤维素的微生物纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。分解纤维素，而人没有分解纤维素
2、的能力。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素C1酶：酶：外切酶，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖外切酶，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖 分子，产生纤维二糖分子，产生纤维二糖CX酶：酶：内切酶，使纤维素断裂成片断。内切酶，使纤维素断裂成片断。葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：将纤维二糖分解成葡萄糖。将纤维二糖分解成葡萄糖。取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的的醋酸醋酸钠缓冲液醋
3、酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？么？提示：提示：本实验的本实验的自变量是纤维素酶的有无自变量是纤维素酶的有无，自变，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添
4、加纤维）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的水，否则会影响溶液的pHpH。实验分析：实验分析：P P2727的小实验是如何构成对照的？的小实验是如何构成对照的？刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选 当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成刚果红能与培养基中的纤
5、维素形成红色复合物红色复合物。当。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为以纤维素分解菌为中心的透明圈中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。明圈来筛选纤维素分解菌。二、实二、实 验验 设设 计计 请你根据实验流程图和提供的三个资料以及请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提操作提示示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。方案。土壤取样土壤取样选择培
6、养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品涂布在鉴别纤将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上维素分解菌的培养基上 筛选产生透筛选产生透 明圈的菌落明圈的菌落 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。得目的微生物的几率要高于普通环境。将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约环境。一般
7、应将滤纸埋于深约10cm10cm左右的土壤中。左右的土壤中。培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。提示：自变量为培养基的种类，
8、即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄或者将纤维素改为葡萄糖。糖。有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。解纤维素的微生物可以大量繁殖。葡萄糖苷酶：将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml果pH升高指示剂会变红思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？有些微生物能降解
9、色素，形成明显的透明圈。观察菌落周围是否有着色的C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用中，细菌合成的脲酶将尿素植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉
10、做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养思考：本实验的流程与课题思考：本实验的流程与课题2 2中的实验流程有哪些异同？中的实验流程有哪些异同？本实验流程与课题本实验流程与课题2 2的流程的区别如下。课题的流程的区别如下。课题2 2是将土样制成的菌悬液直接涂布在是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通得到菌落。本课题通过过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌再将菌液涂布在选择培养基上。
11、其他步骤基本一致。液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。101102103104105106培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸上述物质溶解后，加蒸馏水定容至馏水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解
12、菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入养基中加入酚红指示剂酚红指示剂，如，如果果pHpH升高指示剂会升高指示剂会变红变红刚果红刚果红可以与纤维素形成可以与纤维素形成红色复合物红色复合物，当纤维素被，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就
13、会出现以纤维素分解菌为中心的菌为中心的透明圈透明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解小，实际上刚果红是结合到培养基
14、的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。维素分解菌的培养基上（1）制备鉴别培养基:A、
15、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？分解纤维素的微生物的分离土豆汁 100mL一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。水解酵素 0.纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。本实验流程与课题2的流程的区别如下。增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。四、结果分析与评价
16、四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。纤维素的微生物。2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样
17、的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。的分离结果。为了确定分离得到的是纤维素分解菌，为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行还需要进行_ _实验，纤维素酶实验，纤维素酶的发酵方法有的发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的纤维素所产生的_ _ 含量进行定量测定含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 五、课题延伸五、课题延伸分解分解纤纤维素的维素的微生物微生物的分离的分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结
