1、液相色谱原理应用尚尚 飞飞液相色谱原理应用尚 飞液相色谱基础知识部分 液相色谱简介 液相色谱理论基础液相色谱基础知识部分高效液相色谱简介高效液相色谱简介色谱的发明人 俄国科学家：M.M.S.S.TswettTswett 正式命名“色谱”的文献色谱的发明人经典液相色谱ReviewStop叶绿素中的有色物质石油醚淋洗剂叶绿素碳酸钙颗粒经典液相色谱R e v i e w 石油醚色谱法简介 色谱法（ChromatographyChromatography）溯源 俄国科学家19031903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 19061906年正式命名（见诸文献
2、）色谱法；ChromatographyChromatography 5050年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于7070年代色谱法简介什么是高效液相色谱 HighHigh PerformancePerformance LiquidLiquid ChromatographyChromatography 高效液相色谱法，简称：HPLCHPLC 是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 在技术，理论及应用上处于迅速发展阶段什么是高效液相色谱应用领域食品、饮料化工生物技术、医药环境应用领
3、域应用领域食品、饮料化工生物技术、医药环境应用领域HPLCHPLC技术的发展趋势 高速化、高效化 高精度的高压泵、能走梯度洗脱；高灵敏度的检测器、紫外/可见光检测器,二极管阵列检测器（DADDAD），荧光检测器，电喷雾检测器（CADCAD）以及示差、蒸发光散射检测器等。微粒硅胶为LCLC发展奠定了基础，现在的填料粒度大多为1010m m、5 5m m 甚至3 3 m m、亚2 2 m m，填料的微粒化产生了快速柱，微粒柱提高了分离效率和分析速度。键合相填料的出现拓宽了LCLC在多领域的实用能力。微径柱，毛细管柱，NanoNano柱提高灵敏度和分离效率 特种柱，专用柱增强了色谱分离的选择性H P
4、 L C 技术的发展趋势HPLCHPLC技术的发展趋势 自动化、智能化 由色谱工作站单点控制泵、自动进样器、检测器的操作程序并作色谱数据处理和光谱信息处理，从而实现2424小时无人操作。二极管阵列检测器的作用可在色谱分析的同时作光谱确认 HPLCHPLC与质谱仪的联用技术H P L C 技术的发展趋势液相色谱系统：总体设计泵（含脱气机）自动进样器色谱柱（放于柱温箱中）检测器系统控制软件（电脑）控制软件泵自动进样器色谱柱检测器液相色谱系统：总体设计 泵（含脱气机）控制软件泵自动进样器色Thermo UltiMateThermo UltiMate 30003000仪器配置梯度泵独特的柱温箱可放置两
5、个柱切换阀脱气机和溶剂架带温控选项的自动进样器可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测器T h e r m o U l t i Ma t e 3 0 0 0 仪器配置脱气机和溶剂高效液相色谱基础理论高效液相色谱基础理论色谱分离过程流动相色谱柱流动相流动方向色谱分离过程固定相固定相根据不同的相互作用原理和强度保留分析物由于不同化合物与固定相和流动相之间的相互作用强度和机理不同，所以当化合物流经色谱柱时就会被分分开。色谱分离过程流动相色谱柱流动相流动方向固定相根据不同的相互363 1-5,573 2-68,863 3-84-12,930液相色谱图简介600140,01-Parabene_Summit_0
6、7102-Parabene_Summit_0710mAUUV_VIS_Pump_PressbarParabene isocratic 70B SumParabene isocratic 70B Sum保留时间检测器信号峰高压力信号及波动100500400300200130,0120,0110,0峰面积-5090,0100,0min12Methanol:70,0%Flow:0,50 ml/min%D:0,0%C:0,0%基线0,01,02,03,04,05,06,07,08,09,010,011,012,013,014,015,015色谱图：即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线
7、图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。3 6 3 1 -5,5 7 3 2 -6 8,8 6 3 3 -8基础理论：术语介绍 色谱峰 PeakPeak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 PeakPeak BaseBase 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 PeakPeak HeightHeight 峰最大值到峰底的距离 峰宽 PeakPeak WidthWidth 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 PeakPeak WidthWidth atat HalfHalf HeightHeight 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相
8、交两点之间的距离基础理论：术语介绍基础理论：术语介绍 峰面积 PeakPeak AreaArea 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差；StandardStandard ErrorError 0.6070.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 TailingTailing PeakPeak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 LeadingLeading PeakPeak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 GhostGhost PeakPeak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰基础理论：术语介绍基础理论：术语介绍 基线BaselineBaseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信
9、号的曲线 基线飘移 BaselineBaseline DriftDrift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N N BaselineBaseline NoiseNoise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 BandBand BroadeningBroadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象基础理论：术语介绍基础理论：术语介绍 死时间，t0t0 DeadDead timetime 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间，tRtR RetentionRetention timetime 组分从进样到出现峰最大值
10、所需的时间 调整保留时间，tRtR AdjustAdjust retentionretention timetime 保留时间减去死时间 死体积，V0V0 DeadDead volumevolume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积，VRVR RetentionRetention volumevolume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 调整保留体积，VRVR AdjustAdjust retentionretention volumevolume 保留体积减去死体积基础理论：术语介绍不对称因子计算示意图峰高EP/USPEP/USP标准：AIAAI
11、A标准：LWLWRWRWLWLW10%10%LWLW5%5%RWRW10%10%RWRW5%5%A=A=0.951.050.951.05：正常峰AA 1.051.05：拖尾峰不对称因子计算示意图峰高E P/U S P 标准：L WR WL W1 0%色谱的分离度色谱峰的完全分离是每一个色谱方法的目标。色谱的分离度色谱峰的完全分离是每一个色谱方法的目标。分离度方程 kk 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 是选择因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度分离度方程 k 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料基础理论：塔板理论固
12、流动塔板模型假设色谱柱是由大量分离层构成的，这些分离层称之为理论塔板这些塔板实际是不存在的，他们只是一种假设用来帮助描述色谱柱里所发生的一切定相相在这些塔板里面，固定相和流动相之间存在着一种平衡分析物在这种平衡里面存在着一种平衡系数K K，定义为：K K=C C固定相/C C流动相随着K K的增加，分析物从色谱柱中的流出时间就越长，即分析物的在色谱柱内的保留时间越长基础理论：塔板理论固流动塔板模型假设色谱柱是由大量分离定相相concenconcenntrationntration塔板理论数与柱效的关系 理论塔板数用来衡量色谱柱质量好坏 理论塔板数(N)(N)：理论塔板数越高，柱效越高或者 理论
13、塔板高度(H)(H)：理论塔板高度越大，柱效越低 高柱效色谱柱比低柱效色谱柱在同一保留时间峰更窄 理论塔板数越高，柱效越高w wh hw wh h色谱柱长timetime(length)(length)LHN=理论塔板数理论塔板高度c o n c e n n t r a t i o n塔板理论数与柱效的关系w h 色谱液相色谱基础理论t=0 2 4 6 8 10 常用kk值范围改变 kk 值的方法 调节流动相的极性（比例）、pHpH 、容量因子对分离度的影响t0ttR=k=固定相流动相t R-t0t0 kk值小 组分流出快，接25tR近死时间 分离度差 kk值大 分离度好 kk值更大 保留时间
14、更长 峰会展宽，损失20151050minutes 灵敏度 2 2 kk 1 1且 =1.011.01 R Rs s=1 1若将 R R提高到 2 2，以达到基线分离方法 1 1 增加 N N方法 2 2 提高 需要提高N N 6400%6400%（N N=640,000640,000）需要提高 1%1%（=1.02=1.02）提高分离度最有效的方法就是更换不同固定相类型的色谱柱选择性是分离度的关键R 分离度例如:方法 1 增加 RsRs与N N、KK及 的关系图示R s 与N、K 及 的关系图示液相色谱应用技术戴安中国有限公司液相色谱应用技术戴安中国有限公司使用文献方法注意点 色谱柱填料的种
15、类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）使用文献方法注意点如何建立一个HPLCHPLC方法必须具备如下条件 流动相类型 运行程序 梯度方法 等度方法 流速 进样量 色谱柱及柱温 检测器如何建立一个H P L C 方法必须具备如下条件完整的HPLCHPLC方法（色谱条件）所需的基本方法参数 液相色谱实验所需的基本参数检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相：种类及配比，等度或梯度流动相输送系统参数：流速温度控制进样量完整的H
16、 P L C 方法（色谱条件）所需的基本方法参数 检测器方法参数的选择及其影响方法参数的选择及其影响方法参数的选择及其影响 选择HPLCHPLC检测器 选择合适的色谱柱 反相色谱常用流动相方法参数的选择及其影响一）选择HPLCHPLC检测器 没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相色谱分离！HPLCHPLC检测器可以分为：溶质性质检测器（选择型）对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流动相的变化（选择型）整体性质检测器（通用型）不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化作出响应（通用型）一）选择H P L C 检测器选择液相色谱的检测器通用检测器灵敏度线性范围流速敏感温度敏感破坏性选择性检测
17、器灵敏度线性范围流速敏感温度敏感破坏性RIRIugug10104 4是是否ABSABSngng10105 5否否否ELSDELSDngng否否否是FLFLpgpg10103 3否否否CADCADngng10104 4否否是ECECfgfg10106 6是是是CondCondpgpg10105 5是是否MSMSpgpg10103 3是是是选择液相色谱的检测器通用检测器R I E L S DC A D C o理想的HPLCHPLC检测器 高灵敏度；可忽略基线噪音 宽的线性范围 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性理想的H P L C 检测器6:1灵敏度：信
18、噪比 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/NS/N）检测限（LODLOD）：S/NS/N=3 3 定量限（LOQLOQ）：S/NS/N=1010 好的信噪比有利于：S 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性N6:1 灵敏度：信噪比N选择液相色谱的检测器要考虑的因素：你要分离的化合物/样品的化学特性 化学结构、分子量及紫外光谱等等 流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等）梯度还是等度 灵敏度需求 采样频率 是否有双检测的需求选择液相色谱的检测器吸光度（UV/VisUV/Vis）检测原理 原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，A A
19、KCLKCL 优点：1 1）对温度和流速不敏感2 2）可用于梯度洗脱3 3）灵敏度较高，ngng级检测 缺点：选择性检测器，仅适用于测定有紫外吸收的物质吸光度（U V/V i s）检测原理吸光度（UV/VisUV/Vis）检测的应用 大多数有机化合物有一定程度的吸光度，可以测定大多数的化合物，是目前实验室中使用最多的检测器 多数公司售出的检测器中75%75%以上是吸光度检测器（包括紫外/可见检测器和二极管阵列检测器DADDAD）吸光度（U V/V i s）检测的应用光电二极管矩阵（PhotoPhoto DiodeDiode ArrayArray）Photo DiodeArray简称：PDA或D
20、AD光电二极管矩阵（P h o t o D i o d e A r r a y）P h o t光电二极管矩阵检测器（DADDAD）的特点和用途 一种三维水平的吸光度检测器采集三维谱图兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息 在收集色谱图的同时，得到光谱图 提供许多有用的功能 色谱峰的纯度鉴定，色谱峰的确认 可以发现单波长检测时未测到的峰 任意波长的色谱再处理 光谱信息 光谱库的建立检索和拟合光电二极管矩阵检测器（D A D ）的特点和用途兼顾紫外检测器及荧光（FluorescenceFluorescence）检测原理 原理：发荧光的化合物吸收光（UVUV或VISVIS）使其分子达到激发态，当其返回
21、到基态时发射光的现象即荧光 优点：荧光检测器灵敏度高,pgpg级检测 缺点：不是所有化合物都有荧光，必要时需要衍生荧光（F l u o r e s c e n c e）检测原理 原理：发荧光的化荧光检测器原理荧光检测器原理多环芳烃（PAH）荧光检测器的应用 环境中的污染物 多环芳烃(PAH)(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、饮料CH3H3CCH3CH3 食品中的毒素；例如：黄曲霉毒素OH维生素 染料 维生素及衍生氨基酸 生物技术及制药OOCH3OOOOONHCH3H3COCH3O黄曲霉毒素CH3氨基甲酸酯类杀虫剂多环芳烃（P A H）荧光检测器的应用 食品、饮料C H 3 H示差折光（Re
22、fractiveRefractive IndexIndex）检测 示差折光检测器（RIRI）是第一个商品化的液相色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质 非特异性 任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质中与真空中的速度之比值SR示差折光（R e f r a c t i v e I n d e x）检测S R示差折光（RIRI）检测 的原理 原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样各组分浓度 优点：通用型检测器 缺点：1 1）对温度变化敏感2 2）不能用于梯度检测3 3）灵敏度低，ugug级检测示差折光（R I ）检测 的原理示差检测器
23、的应用 示差折光检测器是通用型检测器,如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都可以检测 特别适用于检测没有紫外吸收的化合物,例如糖类,醇类,酯类以及脂肪酸等 高分子化合物GPC,GFCGPC,GFC分析以及复杂样品纯化示差检测器的应用蒸发光散射（ELSDELSD）原理用氮气把流动相吹成细雾状流动相的液滴通过一个预加热的腔体后被蒸发掉蒸发的溶剂被从检测器中除去溶质的挥发性小于流动相，因此产生颗粒束与光束相交被颗粒散射的光由光电倍增管（PMTPMT）收集PMTPMT的输出与溶质的存在量呈比例关系蒸发光散射（E L S D）原理 用氮气把流动相吹成细雾状ELSDELSD 优点及应用领域 通用型 比流动相
24、挥发性小的物质都能被检测 可以作梯度实验；检测下限可到纳克级水平 对环境条件不敏感；可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相 应用领域：碳水化合物 油脂及脂肪酸 未衍生的氨基酸 制药行业 表面活性剂 天然产物E L S D 优点及应用领域ELSDELSD 缺点不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐）要求使用雾化气源（典型的是氮气或空气）不同的色谱条件下雾化及除溶剂的参数需要重新优化破坏性技术蒸发出的溶剂要引到户外或通风橱里对挥发性化合物的检测不理想一般得到的是非线性校正曲线某些化合物的检测灵敏度不如其他检测器E L S D 缺点 不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐）新型液相色谱通用型检测器：Co
25、rona电喷雾检测器 CAD(ChargedCAD(Charged AerosolAerosol Detectors)Detectors)是 ESAESA独特的专利技术 近期发展最快的HPLCHPLC通用型检测技术 目前，世界上许多制药、化学、食品饮料和化妆品行业使用该检测器，应用于开发和生产环节新型液相色谱通用型检测器：C o r o n a 电喷雾检测器CADCAD检测器CoronaCorona“classic”“classic”CoronaCorona UltraUltraC A D 检测器C o r o n a “c l a s s i c”C o r o n a U10CoronaC
26、orona CADCAD电喷雾检测器原理图1324689571 0 C o r o n a C A D 电喷雾检测器原理图4 6 8 9 5 7二）选择合适的色谱柱 色谱柱类型 反相柱C18C18、C8C8、苯基、内嵌极性基团等 正相柱硅胶、氨基柱、氰基、乙二醇柱等 离子交换色谱柱 WAXWAX、WCXWCX、SCXSCX等 特殊色谱柱：手性色谱柱(刷型、淀粉类、纤维素类、环糊精类等)；凝胶色谱柱；免疫亲和色谱柱等 规格 长度、内径、粒径、孔径等 品牌、批号 AcclaimAcclaim系列、ZorbaxZorbax系列、AtlantisAtlantis系列、国产色谱柱等二）选择合适的色谱柱对
27、色谱柱要有足够的了解掌握柱子分离机理自己建立开发方法对色谱柱要有足够的了解掌握柱子分离机理根据分析物的分离机理分类 吸附色谱（正相色谱）分配色谱（反相色谱）离子交换色谱 体积排阻色谱 亲和色谱根据分析物的分离机理分类正相色谱柱 吸附色谱（正相色谱）常见固定相类型C=N氰基柱NH2氨基柱Si-OH硅胶柱HO OHCHCH2乙二醇柱以吸附为主要保留机理(相似相容)常用非极性流动相，如正己烷、四氢呋喃等极性小的化合物先被洗脱下来正相色谱柱N H 2 S i-O HH O O H以吸附为主要反相色谱柱 分配色谱（反相色谱）常见固定相类型OMeNOOSCNO以“液-液分配”为主要分离机理常用极性流动相，
28、如甲醇、乙腈和水等等极性大的化合物先被洗脱下来反相色谱柱O Me OO C N O以“液-液分配”为主要分离反相键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的70-80%优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点 pH值不能小于2或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同反相键合相色谱柱不同类型色谱选择性差异色谱柱:规格:如色谱图,5-5-m m150150 mmmm x x 4.64.6 mmmm465流动相:温度:流速:进样量:CHCH3 3CN/25CN/25 mmol/Lmmo
29、l/L 磷酸盐,pHpH 3.33.3(60/40(60/40 v/v)v/v)3030C C1 1 mL/minmL/min5 5 L L检测:UV,UV,206206 nmnm4AU峰:3561.1.尿嘧啶2.2.嘧啶3.3.苯酚4.4.N,NN,N-二甲基苯胺5.5.甲苯7.57.5 g/mLg/mL50505050505060606.6.4 4-丁基苯甲酸 5050028104 Minutes6不同类型色谱选择性差异色谱柱:如色谱图,5-m 4 6 5 流动不同品牌C18C18区别42 3Column:Eluant:Flow rate:如图所示90%MeOH1 mL/min品牌 B B
30、23421Temperature:Peaks:30 C1.品牌 A A1342.3.02468104.Minutes不同品牌C 1 8 区别4 2 3 C o l u m n:如图所示品牌 B 2离子交换色谱柱 离子交换色谱常见固定相类型弱阴离子交换：结合阴离子弱阳离子交换 结合阳离子流动相常为不同pHpH的缓冲盐常用来分析离子型化合物溶质必须为带电状态才能具有离子交换的能力离子交换色谱柱小分子分析面临的挑战 RPRP 柱(如C18)C18)用途最广泛,但：存在残余硅羟基作用,在中性淋洗液条件下，碱性化合物拖尾 对高极性（亲水性）化合物保留很弱 选择性有限 RPRP柱+离子对试剂 分离亲水性带
31、电化合物 平衡时间长 流动相复杂(MS(MS 不兼容)IEXIEX 柱-分离带电化合物 疏水性差，限制了使用 HILIC/NPHILIC/NP柱-分离高度亲水的化合物 疏水性差，限制了使用小分子分析面临的挑战混合模式固定相 定义 疏水性相互作用+离子交换作用 类型 WAX/RP,WAX/RP,SAX/RPSAX/RP WCX/RP,WCX/RP,SCX/RPSCX/RP 两性离子/RP,/RP,两性/RP/RP 优势 选择性可调节 流动相组成简单 可同时分离不同类型的化合物混合模式固定相各种不同的混合基质制作方式硅胶硅胶硅胶I.I.混合填料Hypersil Duet C18/SAX(Therm
32、o Scientific)II.II.混合键合Alltech Mixed-Mode(Grace)III.III.“内嵌”Primesep Mixed-Mode(SIELC)IV.IV.“封尾”Acclaim Mixed-Mode(Dionex)反相 蓝色;离子交换 红色各种不同的混合基质制作方式硅胶硅胶硅胶I.混合填料I I体积排阻色谱柱 体积排阻色谱常见固定相类型凝胶过滤色谱（GFCGFC）：亲水性固定相-聚乙烯醇、硅胶等凝胶渗透色谱（GPCGPC）：疏水性固定相-聚苯乙烯-二乙烯基苯化合物保留主要受色谱柱填料和尺寸影响具有很好的预测效果，分子量大的化合物先出峰，分子量小的化合物后出峰常用于
33、测定高分子化合物的聚合度常用于生物活性分子的分离体积排阻色谱柱亲和色谱柱 亲和色谱常见固定相类型如右图所示，通过固体载体连接一个具有识别能力的配体“LockLock andand Key”(Key”(锁与匙)的识别机理，专一性很强常用于生化样品的纯化、分离亲和色谱柱三）反相色谱及常用流动相 反相色谱的主要类型，基于样品分子的极性分离 反相色谱的固定相（填料）为非极性，流动相为极性。用得最多约占70-70-80%80%洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱三）反相色谱及常用流动相流动相极性溶剂极性非极性水甲醇 异丙醇 乙腈THF乙酸乙酯CH2Cl2CHCl3己烷NH3X/ArOH/RCOOHC
34、NH2ROHRCN 醛/酮 N(R)2NO2卤代烷烃 烷烃COOCH3样品的官能团CH3流动相极性溶剂极性非极性水甲醇 异丙醇 乙腈T H流动相洗脱强度 反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：水 甲醇 乙腈 乙醇 丙醇 异丙醇 四氢呋喃 最常用的流动相组成“乙腈-水；甲醇-水”正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：正己烷 乙醚 乙酸乙酯 异丙醇*应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法流动相洗脱强度 反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：流动相的选择原则样品易溶，且溶解度尽可能大化学性质稳定，不损坏柱子不妨碍检测器检测，所选波长处无吸收*黏度低，流动性好*无毒或低毒，易于操作易于从其中回收样品易于制成高
35、纯度，即色谱纯废液易处理，不污染环境流动相的选择原则 样品易溶，且溶解度尽可能大常用流动相 反相体系 有机相：ACNACN、MeOHMeOH等 水相：H2OH2O、磷酸缓冲盐(pH2(pH2、7 7、12)12)、醋酸缓冲盐(pH4.5)(pH4.5)、硼酸缓冲盐(pH9(pH9、13)13)、三羟甲基氨基甲烷(Tris(Tris，pH8)pH8)等 改性剂：三氟乙酸(TFA)(TFA)、三乙胺(TEA)(TEA)等 正相体系 正己烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯等 乙醇、异丙醇等常用流动相缓冲盐的选择 缓冲盐类型 挥发性：TFATFA、醋酸盐、甲酸盐、TEATEA等 非挥发性：磷酸盐、硼酸盐
36、等 离子强度 弱极性化合物分离：0 0 1010 mMmM 中、高极性化合物分离：2020 3030 mMmM 离子交换：6060 100100 mMmM pHpH值缓冲盐的选择流动相pHpH对分析的影响AcidsBase中性化合物的保留与pHpH无关酸、碱性化合物的保留受pHpH影响可通过调节pHpH确定未知化合物的酸、碱性流动相p H 对分析的影响A c i d s B a s e中性化合物的保留与苯胺 2mAU啶 1 尿嘧胺 4 对乙基苯苯酚 3-甲苯 5 6 乙苯流动相pHpH对分析的影响WVL:254 nm9075635038251300.01.02.03.04.05.06.07.0
37、8.09.0min10.0-10中性化合物：甲苯碱性化合物：苯胺 pKa=9.9酸性化合物：苯酚 pKa=2.7苯胺 2 m A U 啶 1 尿嘧胺 4 对乙基苯苯酚 3 mAU流动相pHpH对分析的影响50NHNH 2 2403020pH 6pH 5pH 4pH 7pH 8T=40C,F=1mL/minACN/20mM Phosphate buffer/H2O35/35/30 v/v/v1000,00,51,01,52,02,53,03,5t minm A U 流动相p H 对分析的影响5 0 N H 2 4 0p H 6 p H ce mAU AbsorbancAU bsorbance m
38、 Ab12MeOHMeOH vs.vs.ACNACN600250MPBMPB：MeOHMeOH1-1003.003.504.004.505.00550Retention Time min122502MPBMPB：ACNACN3.003.504.004.505.00-50Retention Time min压力：MeOH-132barMeOH-132bar；ACN-76barACN-76bar；ACNACN洗脱能力更强；ACNACN选择性更好峰1-1-邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)(BBP)；峰2-2-邻苯二甲酸丁酯(DBP)(DBP)c e m A U A b s o r b a n c A U
39、 b s o r b a n c粘度曲线2525o oC C2020o oC C7979Proprietary&Confidential系统压力与流动相粘度直接有关粘度曲线2 5 o C 2 0 o C 7 9 P r o p r i e t a r y&C o样品溶剂对分析的影响 样品溶剂洗脱能力须等于或小于流动相初始洗脱能力3 32 24 4 5 5 6 61 1A)A)样品溶剂：ACNACN12341 12 23 34 4 5 5 6 601234B)B)样品溶剂：ACN/H2OACN/H2O 50/5050/50(v/v)(v/v)1 12 23 36 64 4 5 501234C)C
40、)样品溶剂：ACN/H2OACN/H2O 30/7030/70(v/v)(v/v)t min样品溶剂洗脱能力须等于或小于流动相初始洗脱能力样品溶剂对分析的影响3 2 4 5 6 1 A)样品溶剂mAU Absorbance流动相比例2001 12 24+54+53 3WVL:210 nmACN：H2O=30：701506 67 7100121+21+24 45026 65 53 37 7ACN：H2O=40：604.06.08.010.012.014.016.018.020.0-10Retention Time min有机相比例增加，出峰更快、压力不同、选择性不同 m A U A b s o
41、r b a n c e 流动相比例2 0 0 1 2 4+5 3流速对分析结果的影响04503001501 1 mL/minmL/minC5C4C1 C2C3Uracil4500123445030015001.51.5 mL/minmL/min0123445030015002 2 mL/minmL/min0123445030015002.52.5 mL/minmL/min0123430015003 3 mL/minmL/minTime min01234流速增加，出峰更早，一般选择性不变流速对分析结果的影响0 4 5 0 1 m L/m i n C 5 C 4 C 1 柱温对分析结果的影响121
42、C72345613+46+7051015202530C2501020252613515740C5405101520t min 25柱温增加，出峰更早，选择性变化柱温对分析结果的影响1 2 1 C 7 2 3 4 5 6 1 3+4 6+7 0 5方法开发的具体步骤方法开发的具体步骤方法开发和优化的具体步骤选定一根色谱柱（先用较短的柱子）先用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节kk 值改变保留值（普通反相-简单常用的方法）调节a a值改变选择性（方法优化）通过改变流动相的pHpH值，使样品成中性 加入“对离子”，使样品呈中性 选择更合适的柱子 调节柱长度，流速，梯度，改变
43、柱效及分离速度 请记住每次改变一个参数方法开发和优化的具体步骤 选定一根色谱柱（先用较短的柱子）液相色谱的方法开发（一）改变流动相比例及组成（非极性和弱极性化合物）液相色谱的方法开发（一）改变流动相比例及组成（实例1 1）非极性和弱极性化合物 色谱条件 流动相：洗脱强度由强到弱，改变容量因子 KK1.1.有机相从100%100%开始逐渐降低2.2.走梯度 举例中：乙腈/水，流速：1ml/min1ml/min 用不同的溶剂强度以 60/4060/40、50/5050/50、40/6040/60，由强渐弱 色谱柱：C18C18，4.6mm4.6mm15mm15mm 样品：对羟基苯甲酸甲酯(Meth
44、yl(Methyl Paraben)Paraben)对羟基苯甲酸丙酯(Propyl(Propyl Paraben)Paraben)对羟基苯甲酸丁酯(Butyl(Butyl Paraben)Paraben)改变流动相比例及组成（实例1）色谱条件改变容量因子 KK谱图50/5040/6060/40改变容量因子 K 谱图5 0/5 0 4 0/6 0 调节值改变选择性同样强度的不同有机溶剂，改变了流动相值CH3CN/H2O 38:62THF/H2O28:72 MeOH/H2O 58:42调节 值改变选择性C H 3 C N /H 2 O 3 8:6液相色谱的方法开发（二）方法优化离子型化合物的色谱分
45、离液相色谱的方法开发（二）方法优化 离子型化合物 离子抑制法 离子对色谱法 离子交换色谱柱 色谱峰拖尾 添加改性剂 使用梯度方法优化方法优化离子型化合物的色谱分离 多数化合物是离子型的！使用反相柱 离子抑制色谱法：通过改变流动相的pHpH值，使样品成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性 使用离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用疏水和离子交换混合模式柱子 主要用于“弱”阴、阳离子方法优化离子型化合物的色谱分离 多数化合物是离子型的！方法优化离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pHpH值，抑制样品离子的电离使样品成中性 适用于弱酸性化合物的分离
46、 加入TFA,TFA,磷酸盐等降低流动相的pHpH值，使样品降低离子化 仍使用硅胶基质C18C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pHpH在2-82-8（较保险值3-73-7）内方法优化离子抑制色谱方法优化 离子抑制O OR-C-O-HR-C-O-H109876543kk弱碱弱酸210O OR-C-OR-C-O-2486pHpH=pKapKapHpH离子抑制色谱法方法优化 离子抑制O 1 0 6 k 弱碱2O 2 4 8 6 p H 方法优化 离子抑制O OR R C C O O H H +H H2 2O OO OR R C C O O +H H3 3O O+保留最弱保留最强O O
47、R R C C O O和O OR R C C O O H HpHpH=pKpKa aO OR R C C O O高 pHpHO OR R C C O O H H低pHpH方法优化 离子抑制OO 保留最弱保留最强OOO液相色谱的方法开发离子抑制色谱（实例2 2）CHOCOONaCHOCOOH而在乙腈/水并且pH=7pH=7时，OHOCH3OCH31234苯甲酸纳 苯甲醛 对甲氧基苯甲酸多数组份保留时间很短，无法完全分离。三甲氧基-四羟基苯甲醛液相色谱的方法开发离子抑制色谱（实例2）C H O C O O N a C方法优化离子抑制色谱的使用范围 下列情况下不能使用离子抑制方法：一些酸在pHpH低
48、于2 2时还保持离子化 一些碱在pHpH高于7 7时还保持离子化 可以有以下的选择 使用“离子对色谱法”离子交换色谱柱 甚至要采用离子色谱仪分析方法优化离子抑制色谱的使用范围方法优化离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子”在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型 季铵盐、叔胺盐（正离子），适用于弱酸 烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同方法优化离子对色谱法方法优化 离子对+N NSOSO3 3 NaNa+键合相离子对试剂+N NH H2 2POPO4 4R RSOSO3 3样品+H HO OO O
49、C C R RR RN NR R用季胺烷基三乙基胺分离酸三乙胺(TEA)(TEA)磷酸四甲基铵(TMA)(TMA)四丁基溴化铵用烷基磺酸盐分离碱三氟乙酸(TFA)(TFA)七氟丁酸(HFTBA)(HFTBA)己烷磺酸钠十二烷基硫酸钠方法优化 离子对+S O 3 N a+键合相离子对试剂+H容量因子方法优化 离子对 优化参数 离子对试剂的种类 离子对试剂的浓度2015十二烷基 流动相组成，包括pHpH、有机相含量等10辛基50己基丁基0204060烷基硫酸钠 mM容量因子方法优化 离子对2 0 十二烷基 流动相组成，包括NaO 3SNaO 3SSO3NaSO3Na液相色谱的方法建立离子对色谱（实
50、例3 3）光敏物质 1,3,6,8-芘四磺酸四钠盐 长激发态寿命，与其他物质组成光敏物质 未见相关色谱分析报道 离子型化合物 在C18柱上无保留，如右图 色谱分析 离子抑制法（不合适）阴离子交换法（不理想）8-离子对色谱法（好）1,3,6,8 芘四磺酸四钠盐N a O 3 S S O 3 N a 液相色谱的方法建立离子对色谱（实例3e mAU Absorbance方法优化 离子对600NaO 3SSO 3Na色谱柱:流动相A:A:AcclaimAcclaim C18C18，120120，4.64.6*150150 mmmm*5 5 m m atat 4040 C C2525 mMmM 四丁基溴
