1、RhD(-)血型的研究进展 合肥市红十字会中心血站 吕蓉 2008-5RH血型的研究历史n19世纪40年代发现了人类红细胞RH血型n19世纪60年代,发现了RH血型不合的有效治疗方法n19世纪80年代,成功分离了RH蛋白n19世纪90年代,认识了RH基因结构n20世纪90年代,清楚了RHD和RHCE的氨基酸序列RH血型系统的发现n1940年,发现多数人红细胞上有一种血型抗原物质,与恒河猴（Rhesus monkey)红细胞的抗原物质是相同的.n1940年还发现,三例ABO血型相同，同种输血后却发生了严重的输血反应.n同一年，一名O型孕妇产后大出血，输入O型丈夫的血液后发生了溶血性输血反应，这是
2、人类由于妊娠产生的同种免疫作用的第一例报告n这就表明除ABO血型系统外,还存在另外的血型系统.RH血型系统的命名n“Rh”是根据恒河猴英语单词的前两位字母而由来n我们现在通常把红细胞上含有D抗原的称为RH阳性，而不含有D抗原的称为RH阴性nRH系统还有C、c、E、e 四种抗原，也有用1、2、3、4、5来表示，D+红细胞有用RH1表示，而D-细胞用RH-1来表示，相应的等位基因用R1和R-1来表示RH血型的意义n临床意义很大!nRH阴性的个体在亚洲汉族人当中很稀有,比率为0.3%左右,在欧美等白种人中,比例较高为15%左右.nRH血型不合的输血,有可能产生危及生命的溶血性输血反应,母子RH血型不
3、合的妊娠有可能发生新生儿溶血病,严重者可导致新生儿死亡,或是使胎儿死于子宫内.nRH血型的检查和ABO血型同等重要,已被列为血型的常规检查之一.RH血型是如何遗传的?nRH(-)基因是隐性基因.n当RH阳性的父母都带有RH阴性基因,且同时遗传给后代时,其后代即表现为RH阴性.n当双亲中有一人是RH(-)时,其子女为RH(-)的机会增大.RHD(-)有何意义?n正常RH阴性者，血浆中不含抗-D抗体，所以当RH阴性的人第一次输入RHD阳性血液时，不会发生凝集反应，但此时RH阴性者却会由于各种免疫而产生抗D抗体，当再次输入RHD阳性的血液时，就发生严重的输血反应甚至造成死亡.nRH阴性的妇女怀有RH
4、阳性的胎儿,胎儿的红细胞就会刺激母体产生抗-D抗体,当再次怀有RHD阳性的胎儿时,就会导致新生儿溶血性贫血而死亡.RHD(-)者如何自我保护?nRH阴性者在任何情况下都不能输入RH阳性的血液，必须输注相同的RH阴性血，以免由于RH不合而发生输血反应。80%的RH阴性病人在输入200MLD阳性红细胞后,在2-5个月后,血浆中可检测到抗体.nRH阴性的妇女应注意婚后避免流产，保证第一胎正常分娩，以防发生RH新生儿溶血病。有资料统计14.3%的多次妊娠的D阴性孕妇产生抗-D抗体，导致新生儿溶血病。血站为RHD(-)者做哪些工作?n常年在数以万计的供血人群中筛选RHD(-)的供者n对有流产史的RH阴性
5、的妇女，在妊娠初期做一些关于RH血型系统的产前免疫检查。n一旦发生RH新生儿溶血病，在新生儿刚生下来就要立即用RH阴性的同型血液进行换血治疗，挽救新生儿的生命。表型与D抗原nRh阳性和Rh阴性n弱D和部分D（弱D表现型）nD放散型（Del、DEL）弱D型(Weak D)n血清学表现为盐水介质阴性,IAT检测为阳性.nD抗原数量的减少,但抗原表位数目基本不变.抗原的质量不变n碱基突变形成，改变的氨基酸位于细胞膜层的中间或细胞膜层内部分D(Partial D)n红细胞缺少某些（部份）的抗原表位n与正常抗原相比，抗原的质量发生了变化.(正常红细胞上抗原包含个表位）n形成原因：基因单或多核苷酸碱基取代
6、、杂交基因。n所改变的氨基酸位于抗原分子的细胞膜外部分.部分的危险在哪？n许多部分的红细胞与抗直接反应，但有些需要用才能鉴定，细胞的反应强度不一样，取决于试剂的制造商n部分的个体是可以产生抗，因此必须接收的血液，在日常工作中许多部分都被定为，往往在产生抗体以后才被发现DEL型(D 放散型)n盐水介质阴性,IAT检测阴性,但吸收放散试验阳性.n红细胞上D抗原数目比弱还要少,红细胞上D抗原的质量也有变化的n某些型红细胞抗原缺失某些表位，可以产生抗抗体.n第九外显子碱基突变形成.典型的抗原密度比较抗原型别红细胞上抗原数正常阳性个体10.000-30.000部分型个体Weak D 型个体DEL 型个体
7、RHD基因进化nRHAGnRHcenRHce和RHce复制体nRHCE基因和RHD基因RHD基因的进化nRHD基因的祖先基因是Rh 相关糖蛋白基因(RHAG 基因),该蛋白有一条N多糖链.RHAG和RHD、RHCE有38%的同源性，在红细胞上具有相同的拓扑结构，由位于6号染色体上的单个基因编码。RHAG不具有多态性，所以它不携带血型抗原，但是它对RHD和RHCE定向到膜上有重要作用。没有RHAG，RHCE和RHD都不能表达到红细胞膜上.在红系的分化中先表达RHAG,然后表达RHCE,再表达RHD.nRHAG基因首先复制形成Rhce基因,第二次复制发生在同一染色体短臂,形成“Rhce 复制体”,
8、随后Rhce基因 和其复制体沿不同的途径进化,最终形成现今人类的RHD基因,而RHce 基因经过突变或与RHD基因发生交换形成常见的Rhce RHcE RHCe RHCE基因.RhD基因结构nRH基因结构目前已确定:位于染色体1p34.3-36.1,主要由RHD和RHCE两个基因组成.这两个基因的 3,端相对,相隔约有 3万bp.在它们之间为小膜蛋白1基因(SMP1),即SMP1基因.n在RHD基因两侧各有一段约9000bp 的侧翼序列片段,称为RH盒子(Rhesus box )序列,5端为上游R盒子(Upstream),长9142bp ,3端为下游R盒子(Downstream Rhesus
9、box),长为9145bp,上下游盒子方向相同,与RHD基因一致.nRHD和RHCE基因各由10个外显子组成,二者有43个碱基有差异,其中第1、2、8外显子序列基本一致，所以绝大多数RHD基因测定中，引物选择扩增RHD基因的3-7以及9-10外显子。n通常只有D抗原阳性个体拥有一或二条RHD基因，而D阴性个体则缺失RHD基因，RHD阴性个体的RHD基因缺失发生在上下游盒子之间，并形式一个融合（Hybrid Rhesus box)。RHD基因locus 着丝点 1 号染色体短臂 端粒 RHD 阳性单倍体阳性单倍体 RHD 阴性单倍体阴性单倍体 RHD 基因与 RHCE 基因在 RH 座位上方向相
10、反，但与 SMP1 基因方向相同（图中空心箭头）；RHD 阴性单倍体 RHD 基因缺失发生在上下游盒子的接合区之间。5 3 3 5 3 5 3 5 下游盒子 示 Rh 盒子序列的接合区 融合盒子 序列 序列 序列 RHCE SMP1 RHD 上游盒子 RHCE SMP1 RH 和基因结构图1p36.11RHD等位基因的形成n基因缺失：RHD基因完全缺失形成RHD(-)单倍体；n基因交换：由于RHD基因和RHCE基因在RH座位上方向相反，二个同源基因之间发生交换的机率增大，通常RHCE基因为供者基因，RHD为受者基因；n碱基变异：包括突变、缺失、mRNA拼接位点变异等。近几年的研究发现n D基因
11、结构存在种族差异,RhD(-)白种人中,D基因是完全缺失的.n在黑人中,RHD（-）个体，D基因却完整存在，66%的D基因在第3内含子和第4外显子之间有37bp的插入片断，导致了抗原的不表达。n黄种人中RhD(-)个体表现出明显的多态性.黄种人D基因的多态性nD基因完全缺失(10个外显子全部缺失)导致了D抗原的不表达.nD基因的部分缺失,(有两边缺失和中间缺失)导致D抗原的不表达.nD基因完整存在,(碱基突变),导致D抗原不表达.RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因 基因交换形成的融合等位基因RHCE(1-9)-D RHD-CE(2-9)-D1 RHD-CE(2-9)-D2 RHD-CE(2-7
12、)-D1 RHD-CE(2-7)-D2 RHD-CE(3-7)-D RHD-CE(4-7)-D1 RHD-CE(4-7)-D2 RHD-CE(8-9)-D RHD基因阳性、D抗原阴性等位基因 碱基变异形成的等位基因RHD(Q14X)RHD(W16X)RHD RHD(488del4)RHD(G212V)RHD(Y330X)RHD(IVS8+1GA)Del等位基因 RHD(IVS3+1GA)RHD(M295I)RHD(K409K)all DEL alleles are associated with CeK409K又叫1227A,指第九外显子最后一个基因GA突变，也是第九外显子与第九内含子拼接位点
13、的碱基突变，虽然位置氨基酸末改变，但是剪接点突变导致产生了不正常的抗原弱D等位基因（种）弱 D 型 碱基突变 型 1 809TG 型 2 1154GC 型 3 8CG 型 4 602CG,667TG,819GA 型 5 446CA 型 6 29GA 型 7 1016GA 型 8 919GA 型 9 880GC 型 10 1177TC 型 11 885GT 型 12 830GA 型 13 826GC 型 14 544TA,594AT,602CG 型 15 845GA 型 16 658TC 型 17 340CT 型 18 19CT 型 21 938CT 型 22 1224GC 型 23 634GT
14、 型 24 1013TC 部分D等位基因D 类别 基因变异 D I （该型别已取消）D II 1061CA D IIIa 455AC,602CG,667TG D IIIb RHD-CE(2)-D D IIIc RHD-CE(3)-D D IIId 186GT,410CT,455AC D IVa 186GT,455AC,1048GC D IVb 1048GC 至 1193AT D IVc RHD-CE(6-9)-D D IVd RHD-CE(7)-D D Va(Kou)667TG 至 697GC D Va(Hus)667TG 至 800AT D Va(TO)697GC 至 712GA D Va(
15、YH)667TG 至 744CT D Vb （该型别已取消）D Vc （该型别已取消）D VIa RHD-CE(4-5)-D D VIb RHD-CE(4-6)-D D VIc RHD-CE(3-6)-D D VId RHD-CE(2-5)-D D VII 329TC 中国人RhD分子背景PCR 技术对中国人不同 D 表型个体的 RHD 基因的检测 RHD(+)*RHD(-)合计 RHD(+)率(%)D 阳性 80 0 80 100 D 弱表现型 16 0 16 100 Del 95 0 95 100 相对 D 阴性 192 351 543 35.4 真实 D 阴性 29 280 309 9.
16、4 中国人RhD分子背景nD阳性个体的RHD基因与在其它民族中报道的正常RHD基因序列相同；n真实D阴性中国人中以RHD-CE(2-9)-D2等位基因为主，比率为10.5%；n同时还存在比率不低的个体因碱基变异导致RHD基因ORF错位，导致正常D抗原不能表达。n在真实D阴性中国人中RHD基因总阳性率为15.8%中国人RhD分子背景n中国人Del个体主要携带RHD 1227A等位基因(K409K)。该等位基因是Genbank收录的第一个Del等位基因(GenBank记录AF390110)，但也是中国人中唯一发现的Del等位基因，而在欧洲人中除RHD1227A等位基因外，还观察到另外几种Del等位
17、基因n弱D表型个体目前发现主要是弱D15型、还发现了2例RHD 1227A等位基因携带者；n部分D表型观察到DVa(Hus)和DVI III型。中国人RHD等位基因中国人相对 D 阴性群体中 RHD 等位基因及频率 等位基因 在相对 D 阴性人群 在整体人群 D 表型 RHD-CE(2-9)-D2 0.039216 0.002081 D 阴性8 RHD 270A 0.004902 0.000260 D 阴性8 RHD 710delC 0.004902 0.000260 D 阴性8 RHD IVS6+1-4delGTAA,904-905insGGCTT 0.004902 0.000260 D 阴
18、性8 RHCE-D(6)-CE 0.004902 0.000260 D 阴性8 RHD1227A 0.171569 0.009102 Del表型8 RHD1227A 未知 未知 弱 D 表型8 RHD(del 1013bp)未知 未知 Del表型13 RHD 845GA 未知 未知 弱 D15 型8 RHD(667TG 至 800AT)未知 未知 DVa(Hus)*RHD-CE(3-6)-D 未知 未知 DVI III 型*RHD(-)单倍体#0.769608 0.040831 D 阴性8 RHD(+)单倍体#0.230392 0.012223 D 阴性/Del 8 RHD基因分型技术的应用n
19、血清学定型结果难以判定,为了防止某些弱D被误定为RH-,用分子生物学检测作为辅助手段；nD抗原弱阳性个体的弱D型或部分D型别的鉴定；n通过羊水预测胎儿的D表型；n慢性多次输血患者、大量输血患者、同种免疫或自身免疫溶血性贫血患者、以及红细胞直接抗球蛋白实验阳性患者的D抗原表型的检测和纠正；n对于中国人，鉴定Del表型 附表附表 Rh 国际命名举例和常见碱基变异及等位基因的表示方式 内容 输写方式 Rh 血型系统基因 RHD 和 RHCE D 抗原基因 RH1 或 RHD 或 RH*D 或 RH D RHD 碱基变异：第 67 位 C 突变为 A 67CA RHD 碱基变异：第 67 位 G 缺失
20、 67delG RHD 碱基变异：第 67-69 位 ACT 缺失 67-69delACT RHD 碱基变异：第 67-68 位插入 T 67-68insT#RHD 碱基变异：第 67 位 AT 重复 4-8 次 67（AT）4-8#RHD 碱基变异：第 6 内含子 3末端 G 突变为 A IVS6-1GA 或 c.XX-1GA#等位基因：RHD 第 270 位碱基突变位 A RHD 270A 等位基因：RhD 蛋白第 212 位氨基酸 G 被 V 替换 RHD(G212V)等位基因：RhD 蛋白在第 16 位氨基酸（W）终止 RHD(W16X)等位基因：RHD 第 3-7 外显子被 RHCE
21、 基因交换 RHD-CE(3-7)-D 中国人中国人RHDRHD的未来研究方向的未来研究方向 n真实D阴性个体RHD基因序列研究，进一步了解产生中国人D抗原阴性的特性分子机制，发现更多的RHD等位基因：nD抗原弱表现型个体的分子背景研究，用以了解中国人弱D和部分D表型的常见型及频率。目前在中国人中观察到的弱D型是弱型和二种部分D型，而国际上报道的弱D型确有很多种，而不同分子机制形成的其它部分D表型也很多中国人中国人RHDRHD的未来研究方向的未来研究方向n有关Del研究，Del在中国人中比率非常高，综合近几年的文献，在经IAT确认的D阴性群体中平均为28.1%。尽管目前国家没有要求DEL型血液不能供应给临床,但是从理论上来讲,DEL型是有可能刺激机体产生抗体的。n稀有血型的分子生物学研究和调查。感谢各位专家和同感谢各位专家和同行！行！
