1、药剂学课件系列药剂学课件系列2本章学习要求：本章学习要求：掌握生物技术的概念和生物技术药物的特点和理化性质。掌握蛋白质类药物的处方与工艺。熟悉掌握蛋白质类药物新型给药系统和评价方法。3主要内容主要内容1.生物技术的基本概念 2.蛋白质类药物的结构特点与稳定性 3.蛋白质类药物制剂的处方设计与工艺 4.蛋白质类药物的释放系统 5.蛋白质类药物制剂质量评价的方法 4生物技术的基本概念生物技术的基本概念 生物技术（生物技术（BiotechnologyBiotechnology）是应用生物体（包括微生物、动物细胞、植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术
2、。v现代生物技术主要包括：基因工程基因工程、细胞工程细胞工程、酶工程酶工程，此外还有发酵工程、生化工程、蛋白质工程、抗体工程等。5基因工程技术基因工程技术 是生物技术的核心技术，就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。该技术为人类获取大量有价值的多肽类蛋白质大量有价值的多肽类蛋白质开辟了一条新途径。6细胞工程细胞工程 是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术有目的地设计、操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的以及使细胞增加或重新获
3、得产生某种特定产物的能力，在离体条件下大量培养、增殖、并提取出对人类有用的产品。细胞工程是生产单克隆抗体类试剂或药物的主细胞工程是生产单克隆抗体类试剂或药物的主要手段。要手段。7酶工程（酶工程（Enzyme EngineeringEnzyme Engineering）是酶和工程学相互结合、发展而形成的一门新技术科学，它是从应用的目的出发，研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。8生物技术药物生物技术药物 生物技术药物生物技术药物是指采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的药品，一般来说采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的
4、蛋白质或核酸类药物，可称为生物技术药物。近年来，生物技术药物特别是基因工程药物发展迅速，特别是美国和日本，大部分都是重组蛋白质药物和重组DNA药物。92013全球十大畅销药物排行榜10我国已批准上市的生物技术药物产品我国已批准上市的生物技术药物产品 药物名称适应症批准时间-1b干扰素（外用）-b干扰素-2a干扰素-2b干扰素-干扰素白细胞介素-2病毒性角膜炎HBV、HCV等尖锐湿疣、疱疹等HBV、HCV类风湿癌症辅助治疗198919961996199619941995粒细胞集落刺激因子粒细胞巨细胞集落刺激因子重组链激酶人促红细胞生成素碱性成纤维细胞生长因子乙型肝炎疫苗化疗升白细胞化疗升白细胞心
5、梗溶栓再障贫血创伤、烧伤乙型肝炎19971997199619971996199211 发展概况发展概况 自1982年第一个重组药物：人工胰岛素上市以来，第二代生物技术药物正在取代第一代多肽、蛋白质类替代治疗剂。第一代重组药物是一级结构与天然产物完全一致的药物；第二代生物技术药物是应用蛋白质工程技术制造的自然界不存在的新的重组药物。生物技术药物及其制剂的发展前景生物技术药物及其制剂的发展前景12 美国一直稳居生物技术药物研发榜首，已上市 116个药物，治疗数百种疾病，2000年产值超过200亿美元；已有723种生物技术药物正在通过FDA审批。德国已超过日本，到2001年底已有68种药物上市，正在
6、临床试验的有100多个。日本多数药物是与美国合作的产物，已上市的有50个药物。我国已批准上市的品种有21种，主要通过跟踪研究与创仿相结合的方法，目前已步入自主创新阶段，并以“新型生物技术药物和疫苗”作为发展重点。13目前生物技术药物制剂发展存在的瓶颈问题是：（1）生物技术药物多为多肽、蛋白质药物类，性能不稳定不稳定、极易变质失活（2）该类药物对酶敏感不易穿透胃肠粘膜，故对酶敏感不易穿透胃肠粘膜，故 多以注射途径给药多以注射途径给药，使用不便。因此，应 用制剂手段将其制成口服或其他途径给药 （亦即研究新的给药系统）也是一项迫切而 十分艰巨的任务。14蛋白质类药物的结构蛋白质类药物的结构特点特点蛋
7、白质的基本结构单元是氨基酸氨基酸。氨基酸按排列顺序通过肽键相连接而成肽链，分子量较大分子量较大，一般在51035106不同种类的蛋白质氨基酸在肽链上的序列不同，蛋白质的生理功能常与取决于氨基酸在肽链中的序列序列。蛋白质的四级结构四级结构。15蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构：一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置。二、三、四级结构为高级结构或空间结构，高级结构和二硫键与蛋白质的生物活性有重要关系。16 蛋白质的高级结构 蛋白质的高级结构包括二级，三级与四级结构：二级结构二级结构指蛋白质分子中多肽链骨架的折叠方式，即肽链主链有规律的空间排布，一般有螺旋
8、结构与折叠形式。三级结构三级结构是指一条螺旋肽链，即已折叠的肽链在分子中的空间构型，即分子中的三维空间排列或组合的方式，系一条多肽链中所有原子的空间排部。四级结构四级结构是指具有三级结构的蛋白质的各亚基聚合而成的大分子蛋白质。17蛋白质分子的构象蛋白质分子的构象又叫空间结构、高级结构、立体结构、三维构象等，它是指蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布。这种空间排布的变化，仅涉及到氢键等次级键的生成与断裂，但不涉及共价键的生成与断裂。18蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象（conformation)时才有生物活性，形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键氢键、疏水作用力疏水作用力（hydrop
9、hobic force)hydrophobic force)、离子键离子键、范德华力范德华力、二二硫键硫键与与配位键配位键。除二硫键二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构象是弱作用力。19蛋白质分子中二级结构螺旋、折叠的形成依靠氢键，可以说蛋白质分子内部布满了氢键。疏水作用力也称疏水键，系两个疏水基为了避开水相而群集在一起的作用力，在维持蛋白质三级结构起重要作用，也是形成生物膜的主要作用力。20范德华力对稳定和维持三级，四级结构十分重要。离子键对于维持蛋白质四级结构是不可缺少的。不少蛋白质含有金属离子，而金属离子是通过配位键与蛋白质结合，故结合蛋白质是由氨基酸成分与非氨基酸通过配位组
10、成。21蛋白质的结构示意图蛋白质的结构示意图 肽键的形成2223蛋白质的不稳定性蛋白质的不稳定性 蛋白质只有在立体结构是特定构象时才有生物活性，稳定蛋白质构象的作用力有疏水键、离子键、二硫键与配位键，除二硫键其余均为非共价键，说明维持蛋白质构象的作用力较弱，这些弱的作用力一旦被破坏，就会引起蛋白质构象的变化，由此伴随蛋白质生理活性的破坏。24研制开发蛋白质类药物制剂的困难之一是处理蛋白质类药物的不稳定性。蛋白质药物的不稳定也是蛋白质通常需注射给药而不象大多数小分子药物口服给药的主要原因之一。25蛋白质的不稳定的表现可分为两种:共价键引起的不稳定性共价键引起的不稳定性又称化学不稳定：化学不稳定：
11、指蛋白质分子通过共价键的形成和断裂形成了新的化学实体。非共价键引起的不稳定非共价键引起的不稳定又称物理不稳定物理不稳定：蛋白质分子的高级结构的物理转变，无共价键改变。物理不稳定包括变性、聚集、沉淀变性、聚集、沉淀和表面吸附表面吸附。26蛋白质药物的降解过程蛋白质药物的降解过程 27化学不稳定化学不稳定 水解水解 蛋白质的水解反应可导致蛋白质或肽链的断裂，可降低或破坏其活性。蛋白质通常在极端条件下更易发生水解反应,如长时间置于极端的pH或高温下或蛋白质置于蛋白水解酶中。2829氧化氧化 很多肽和蛋白质易发生氧化降解反应，其中很多反应在大气氧中温和的条件下即可发生（自氧化）。影响氧化反应速率的因素
12、有pH值、温度、金属离子、缓冲液等。典型的氧化反应如硫醇基（甲硫氨酸、谷氨酸等）氧化成磺酸，RSH RSOH RSSH RSO2H RSO3H 30含有组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和酪氨酸组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和酪氨酸侧链的蛋白质易于发生氧化降解，其中甲硫氨酸甲硫氨酸尤其敏感，在酸性介质中，甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜。由此导致生物活性的损失或丧失。31外消旋化外消旋化 旋光性物质在化学反应中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生了转移，使D-或L-氨基酸转变成D，L-混合物，旋光性消失的过程。蛋白质碱性水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用，使氨基酸产生易于受蛋白水解酶破坏的肽键。通常外消
13、旋作用可改变蛋白质的生物活性。影响氨基酸消旋作用的因素有温度、pH、离子强度和金属离子螯合作用。32二硫键的交换二硫键的交换 二硫键（-S-S-）是由两个半胱氨酸侧链上的巯基脱氢相连而成，是很强的化学键，二硫键的交换能导致不正确的配合，而导致活性快速丧失。33 H-S-RR-S-S-R R-S-S-R+H-S-R34物理不稳定性物理不稳定性 变性变性 变性是蛋白质不稳定性研究最广泛的方面。它是指天然分子球状折叠的改变。变性根本上是指蛋白质物理结构的改变而不是它的化学组成的改变。影响蛋白质变性的因素有温度、pH值和有机溶质的加入（如尿素、胍盐、乙酰胺）或有机溶剂（如乙醇、丙酮）。35变性可以是可
14、逆的可逆的或或不可逆不可逆的，可逆的变性定义为除去变性剂后可恢复肽链的伸展。不可逆变性定义为原有结构不可能恢复的任何伸展过程。变性蛋白质一般水溶液中不溶不溶。变性除降低溶解度外，还可导致活性损失、结晶能力下降，分子形状改变、对酶水解敏感和组分基团反应活性的改变。36表面吸附表面吸附 蛋白质表面吸附是指蛋白质粘附于与其接触的界面。如果在生产中有大量的蛋白质暴露于表面，则由吸附引起的损失不是很严重，因为表面的吸附很快饱和，但如果是少量蛋白质，尤其是低浓度，则损失不可忽视。使用表面活性剂、加入载体蛋白如血清白蛋白可减少吸附。37聚集聚集 蛋白质分子置于水溶液中，会自缔合形成二聚体、三聚体、六聚体以及
15、大分子的聚集体，自缔合与pH、溶剂组成，离子强度和溶剂的介电性有关。加入适量的变性剂也可导致蛋白质的聚集。38沉淀沉淀 沉淀是宏观量的聚集，通常与变性共轭发生。当胰岛素长期放于输液袋装置或剂型溶剂中时，可在装置或容器壁上沉淀。胰岛素的释放系统经常由于蛋白质沉淀而阻塞，因此，要求经常清洗和灌流，胰岛素与环糊精的复合物沉淀较少。39蛋白质类药物制剂的处方设计与工艺蛋白质类药物制剂的处方设计与工艺 大分子多肽类药物相对于小分子药物来说，其稳定性较差，因此在蛋白质类药物制剂研制中，主要解决问题是药物稳定性药物稳定性。q液体制剂：制备简便，易于应用，稳定性较差。q冷冻干燥制剂：药物的稳定性较好，工艺复杂
16、。40液体蛋白质类药物的稳定化与制剂液体蛋白质类药物的稳定化与制剂 液体蛋白质类药物的稳定化方法分两类：1.改造其结构。2.通过加入辅料，改变液体蛋白类药物溶剂的性质。41稳定蛋白质类药物常加入的辅料有以下几类：糖和多元醇、氨基酸、盐、大分子化合物、表面活性剂等。这些辅料提高蛋白质的稳定化程度与其浓度及蛋白质的种类有关。42稳定蛋白质类药物的常用辅料稳定蛋白质类药物的常用辅料 缓冲液缓冲液 选择缓冲液是液体蛋白质制剂研制中重要的一步，因为pH值和蛋白质的物理化学稳定性均有关，通常蛋白质的稳定PH 范围很窄，准确控制制剂pH值是蛋白质稳定化的第一步。常用的有磷酸盐、醋酸盐和枸橼酸盐缓冲盐。最常用
17、的是磷酸盐磷酸盐。缓冲盐的种类和浓度均对蛋白质的稳定性有影响。43表面活性剂表面活性剂 表面活性剂可降低蛋白质溶液的表面张力，抑制蛋白质在疏水性表面的聚集、沉淀和吸附，或阻止蛋白质的化学降解。非离子型表面活性剂：聚山梨酯类、泊洛沙姆等。阴离子表面活性剂：十二烷基硫酸钠（不常用不常用）44糖和多元醇糖和多元醇 糖和多元醇属于非特异性蛋白质稳定剂。糖中蔗糖蔗糖和海藻糖海藻糖最常用，避免选用还原糖避免选用还原糖，因其与氨基酸有相互作用的可能。多元醇常用的有甘油，甘露醇，山梨醇，其中甘油甘油最为常用。糖和多元醇类的稳定作用与其使用浓度密切相关，一般认为0.3M（或5%）浓度是其作为稳定剂使用的最小量。
18、45盐类盐类 盐可以起到稳定蛋白质的作用，也可以破坏蛋白质的稳定性，还有可能毫无影响。这主要取决于盐的种类、浓度、离子相互作用的性质及蛋白质的电荷。低浓度的盐低浓度的盐通过非特异性静电作用提高蛋白质的稳定性。NaCl、KCl是常用的蛋白质类药物稳定剂。46聚乙二醇类聚乙二醇类 高浓度的PEG 类，常作为蛋白质的低温保护剂和沉淀/结晶剂，它可与蛋白质的疏水链作用。PEG类的稳定作用的机制仍不清楚。47大分子化合物大分子化合物 很多大分子化合物已表明具有稳定蛋白质的作用。白蛋白白蛋白(HSA)是稳定蛋白质常用的大分子物质。羟丙基羟丙基-环糊精（环糊精（HP-CD）是较有前途的蛋白质稳定剂。48金属
19、离子金属离子 一些金属离子如钙、镁、锌与蛋白质结合，使整个蛋白质结构更加紧密、结实、稳定，从而使蛋白质稳定。氨基酸氨基酸 一些氨基酸单独或与其它辅料并用通过优先排除机制稳定蛋白质。如组氨酸、甘氨酸、天冬氨酸钠、谷氨酸及赖氨酸盐酸盐等。49防腐剂防腐剂 常用的防腐剂有：苯酚、苯甲醇、氯丁醇、间甲酚和尼泊金类和汞撒利等。等渗调节剂等渗调节剂 静脉注射剂必须等渗，常用品种有葡萄糖、氯化钠、氯化钾。用糖比用盐的效果更好。50包装容器的选择、过滤膜的选择、振荡、剪切包装容器的选择、过滤膜的选择、振荡、剪切应力的大小应力的大小容器的选择膜的选择振荡、剪切应力的大小51固体状态蛋白质类药物的稳定性与固体状态
20、蛋白质类药物的稳定性与制备工艺制备工艺 选择固体剂型可提高蛋白质类药物的稳定性。常用蛋白质类药物的干燥方法有冷冻干燥冷冻干燥与喷雾喷雾干燥干燥。52冷冻干燥蛋白质药物制剂冷冻干燥蛋白质药物制剂 两个主要问题：（1）选择适宜的辅料，提高蛋白质类药物在干燥过程和贮藏中的稳定性。（2）冷冻干燥工艺参数的优化，如最低、最高干燥温度，干燥时间、真空度等。53冷冻干燥蛋白质制剂中典型的添加剂冷冻干燥蛋白质制剂中典型的添加剂 54喷雾干燥蛋白质制剂喷雾干燥蛋白质制剂 喷雾干燥工艺是将液体经雾化后，与热空气接触，由于表面积很大，水分迅速汽化，干燥时间短，所得产品粒子大小可控制且流动性较好。因此，该方法制得的蛋
21、白质干燥粉末已广泛用于吸入途径给药的蛋白质制剂中，在制备蛋白质类药物的控释制剂、开发新的给药系统，该方法极为有用。55喷雾干燥的缺点是损失大，回收率不高，水分含量高，对一些蛋白质活性有影响，但只需选择合适的工艺参数及稳定剂，也可生产出粒经为35m，水分含量为5%6%的活性产品。56德国christ冻干机瑞士Buchi小型喷雾干燥机57蛋白质类药物的给药途径蛋白质类药物的给药途径 1 1、注射给药、注射给药 蛋白质、多肽类药物由于口服吸收的限制因素，临床多采用注射途径给药，但蛋白质、多肽类药物一般体内血浆半衰期较短，清除率高，因此，注射途径给药往往需通过其它方法延长体内半衰期。主要有三种方法可以
22、延长其体内半衰期。改为肌肉注射或皮下注射给药 采取新的给药系统延缓药物的释放 生物降解微球、复乳、脂质体 对蛋白质分子用PEG进行修饰抑制其清除582 2、口服途径给药、口服途径给药 蛋白质类药物的口服给药存在以下限制：蛋白质类药物的胃肠道降解。胃肠粘膜的穿透性差。形成多聚体。593 3、其它给药途径、其它给药途径 包括鼻粘膜、肺部、直肠、口腔粘膜、皮肤给药系统等。在这些给药系统中，除肺部给药可能有较高的生物利用度，其余方法如不加吸收促进剂的生物利用度一般较低。蛋白质的非注射给药途径中，鼻腔给药鼻腔给药似乎最具前景。60其它途径给药系统的优缺点其它途径给药系统的优缺点 61蛋白质类药物制剂质量
23、评价方法蛋白质类药物制剂质量评价方法 蛋白类药物通常需要评价的项目有六个方面：1.1.制剂中药物的含量测定制剂中药物的含量测定 一般采用紫外分光光度法紫外分光光度法和反相高效液相色谱反相高效液相色谱法法测定溶液中蛋白质的浓度，前提是处方中其他物质不干扰药物的测定。622.2.制剂中药物的活性测定制剂中药物的活性测定 该项目是评价制剂工艺可行性的重要方面，方法有药效学药效学和放射免疫法放射免疫法。还可以采用SDS-PAGESDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法）测定蛋白质类药物的活性。633.3.制剂中药物的体外释药速率测定制剂中药物的体外释药速率测定 由于考虑到药物在溶出介质中不
24、稳定，多采用测定制剂中未释放药物量的方法。蛋白质从微球中的释放受介质pH值、离子强度、赋形剂以及转速、温度等条件的影响。644.4.制剂的稳定性研究制剂的稳定性研究 物理稳定性：包括制剂中药物的溶解度、释放速率以及药典规定的制剂常规指标。化学稳定性：包括药物的聚集稳定性、降解稳定性和生物活性测定。655.5.体内药动学研究体内药动学研究 方法灵敏度要求高，非静脉给药的制剂可考虑采用放射标记法测定血浆中药物的量。6.6.刺激性及生物相容性研究刺激性及生物相容性研究 我国SFDA药品注册管理办法规定，皮肤、黏膜以及各类腔道用药需进行局部毒性和刺激性试验，各类注射途径给药剂型除进行局部毒性和刺激性试验外还需进行所用辅料的生物相容性研究，以确保所用辅料的安全性。66over
