1、液质联用基础知识 不同质荷比的离子经质量分析器分离,而后被检测并记录下来的谱图叫作质谱图.简称质谱 质谱图的横坐标是质荷比(m/z)，纵坐标是离子强度 质谱法(Mass Spectrometry)即质谱分析法,一般亦简称为质谱 质谱中采用的质量单位 Da=Dalton(道尔顿)质量单位,等于一个碳原子(12C)质量的十二分之一，约为1.6610-24克;一克约为610 23道尔顿 amu=atomic mass unit,原子质量单位 1amu=1Da 同位素:具有相同的原子序数而又具有不同的质量数 的原子叫作同位素 同位素丰度:自然界中某同位素原子所占的百分数叫做该同 位素的天然丰度 C12
2、6C136 质量数质量数=质子质子+中子中子原子序数原子序数=质子数质子数 具有相同的元素符号具有相同的元素符号,在元素符号的左上角表明其质量数在元素符号的左上角表明其质量数氮氮 14N 14.0031 99.64 15N 15.0001 0.36硫硫32S31.972195.033S32.97150.7634S33.96794.22氯氯35Cl34.968975.7737Cl36.9659 24.23溴溴79Br78.918350.6981Br80.916349.31 原子符号原子符号质量质量,amu%天然丰度天然丰度名义质量数 采用元素质量数的整数进行计算,例如:C=12,H=1,O=16
3、单同位素质量数或准确质量数 用丰度最大的同位素准确质量数计算 例如：C=12，1H=1.0078，16O=15.9948 平均质量数或化学质量数 考虑到所有天然同位素丰度的该元素原子量来计算 例如：C=12.001，H=1.00794，O=15.9994质谱获得的单电荷离子的m/z值，是单同位素质量数利血平利血平,C33H40N2O9,的的MW的计算的计算 使用原子量使用原子量:使用单一同位素质量使用单一同位素质量:C:33 x 12.011=396.363 C:33 x 12.0000=396.000 H:40 x 1.0079=40.316 H:40 x 1.0078=40.312 N:2
4、 x 14.0067=28.013 N:2 x 14.0031=28.006 O:9 x 15.9994=143.995 O:9 x 15.9949=143.954 608.687 608.272质荷比(mass charge ratio):离子的质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,叫作质荷比,简写为m/z质荷比是质谱图的横坐标质荷比是质谱定性分析的基础 离子丰度(Abundance of ions):检测器检测到的离子信号强度 离子相对丰度(Relative abundance of ions):以质谱图中指定质荷比范围内最强峰(基峰)的强度为100,其它离子
5、峰对其归一化所得的强度 标准质谱图均以离子相对丰度值为纵坐标 谱峰的离子丰度与物质的含量相关,因此是质谱定量的基础 质谱仪之所以在高真空下工作是为了.尽量减少离子-分子之间的碰撞(即,得到最大平均自由程)o 碰撞可能导致离子偏离所期望的由离子源到检测器的通道o 碰撞可能导致产生意外的离子或反应o 平均自由程:1 atm10-6 m;10-4 torr 0.5 m 防止在高电压(用于某些离子聚焦)下生成电弧 减少污染/化学噪音1910年 世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥 Cavendish实验室出现1917年 电喷雾(Electrospray)物理现象被发现(并非 为了 MS)1918年 世
6、界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥 大学实验室出现(扇型磁场MS)1943年 世界上第一台商业质谱仪1953年 四极杆质量分析器质谱仪1955年 飞行时间质量分析器质谱仪1960s 开发GC/MS60s-70s 大气压电离(APcI)源被发现(但并未被广泛 应用)70s-80s 开始广泛研究 LC/MS1979年 传送带式 LC/MS 接口成为商业产品1982年 离子束LC/MS接口出现1984年 第一台电喷雾 MS仪宣告诞生 1988年 电喷雾离子源 MS 首次应用于蛋白质的分析.按离子源的种类分 EI(电子轰击源)质谱(常用于GC-MS系统)API(大气压电离源)质谱(常用于LC-MS系
7、统)MALDI(基质辅助激光解吸电离源)质谱(常用于生物大分子分析)按质量分析器的种类分 四极杆(Quadrupole)质谱 离子阱(Ion Trap)质谱 飞行时间(Time of Flight,TOF)质谱 扇形磁场(Magnetic Sector)质谱 LC/MS=LC+MSHigh Performance Liquid Chromatography(HPLC)-高效液相色谱Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)-超高效液相色谱 液质联用的前提和基础=进样+分离 根据化合物的化学特性分离样品(比如极性化合物，非极性化合物，酸性化合物，碱
8、性化合物等等)LC的特点:分离技术 分离效率高 流动相参与分离 连续流出,峰宽有限 有时需要使用缓冲盐提高分离度 高压环境工作(1000 psi)Mass Spectrometry-质谱 质量是物质固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱 分析物被转化为气相离子而被分析 这些离子按其质荷比(m/z)被分离而被检测 质谱图即是相关的离子流对m/z的图MS的特点 灵敏度高 定性/定量本领高 脉冲扫描采集数据 高真空环境工作 溶剂参与反应(API电离源)TIC色谱色谱HO HOOO HO HG a m a b u f o t a lin (III)m/z100150200250300350911071
9、2314517519132379201341402384366M-18M+M-36M-79M-162241保留时间TICMin12141618202224262830 124357500600700800695100 200 300 400 500 600 700 800219.0696.7EI HOCH CH O222COCH CH 22NHCONaugardAPI5 个数量级的动态线性范围(0.1pg-1000pg)实验系数=0.9975,样品:磺胺二甲氧哒嗪上柱分析为什么使用为什么使用 LC/MS?如果让您来选择，如果让您来选择，您满意那一种分您满意那一种分离度离度?LC_MS_OK5.
10、0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.00Time0100%0100%TaiyuanLC_MS52:Diode Array 254 1.00Da1.71e6x36TaiyuanLC_MS51:Scan AP+BPI8.29e45.844.812.912.272.044.007.229.1211.599.9814.8713.1519.1217.4025.1621.42 22.5233.7833.3228.8426.8235.0438.2639.52液质联用接口液质联用接口 至真空至真空离子源离子源质量分析器质量分析器 检测器检测器离子源离子源液质联用接口液质联用接
11、口至真空至真空质量分析器质量分析器检测器检测器高真空部分高真空部分高真空部分高真空部分样品引入样品引入样品引入样品引入EI电离源电离源API电离源电离源 进样方式比较进样方式比较 对真空泵的要求对真空泵的要求*(liters/sec)毛细管毛细管 GC,1mL/min(气体气体)400 微柱微柱 LC,10 L/min 5,000 填充柱填充柱 LC,1 mL/min 50,000 *为了保持为了保持 3 x 10-6 torr(4 x 10-6 mbar)的真空的真空 LC/MS 接口必须使LC流出的液流达到 MS 可接受的压力(10-5-10-6 torr)同时以极小的谱带展宽尽可能多地输
12、送样品离子到MS液相色谱的出口情况:从液相色谱流出的组分存在于大气压条件下的溶液之中 质谱的入口情况:在高真空工作条件下的质谱仅接受气相离子 因此液质联用的接口必须完成三个转变:物态转变:液态-气态 带电状态:“中性”-离子 真空变化:760 torr-10-5-10-8 torr(乇)要求:雾化,去溶剂和电离同时完成第第 1 次进样次进样第第 509次进样次进样25小时小时苯海拉明,10mM 磷酸盐缓冲液质量过滤器质量过滤器样品引入样品引入GCLCCEFlow InjProbePB/EIESIAPCITSPFABMALDIQuadrupoleMagnetic SectorTime of Fl
13、ightIon TrapFT-MSElectron MultiplierPhotomultiplierMicrochannel PlateTurbo Mechanical离子分离模式离子分离模式质量分析器质量分析器离子检测离子检测数据的采集及处理数据的采集及处理样品的引入模式样品的引入模式溶剂的去除或抽溶剂的去除或抽 真空方式真空方式质子化模式质子化模式Sample Description80859095100105110115120125130135140145150m/z0100%SALICYLAMIDE 1(0.067)Cn(Cen,2,80.00,Ar)Scan ES+1.19e813
14、8.0137.0121.2100.290.188.185.293.995.8114.0110.2102.0133.0123.9138.9143.0149.32-Hydroxybenzamide MW:137 Form:C7H7 NO2 CAS Reg No:65-45-2255075100125150175200225250162839658092120137CONH2OHFigure 1.Wiley Library Reference Spectrum of Salicylamide EI源：电子轰击电离源可得经典的质谱谱图可查询质谱库，质谱结果可用工业标准谱库检索，是绝对的化合物鉴定相对易
15、得，耐受性好谱图可解析,阐明结构信息但是,电离效率较差，测定的分子量范围、流速范围有限；可测的化合物类型有限M样品进入样品进入灯丝灯丝集电极集电极离子聚离子聚焦透镜焦透镜离子去离子去分析器分析器-挡板挡板+HOHOOOHOHGamabufotalin(III)M -18+M+M -36+3414023843669110712314517519179201135M -162+2419110712314517519179201341384366M -18+M+M -36+M -162+241402High Res Mass Spec,Brown,Kamano,Pettit,Org.Mass Spe
16、c.,1972Waters Integrity LC/MS System,Pfizer,2019 电喷雾电离 Electrospray Ionization ESI 大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization-APCI 电喷雾离子化可分为三个过程:形成带电小液滴 溶剂蒸发和小液滴碎裂 最终形成气相离子 低分子量化合物一般产生单电荷离子(失去或得到一个质子)高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子 几乎没有碎片离子 可能生成加合物和/或多聚体 常见的是溶剂加合物和NH4+(M+18),Na+(M+23),和K+(M+39)加合物 灵敏度取决于
17、化合物本身和基质1201401601802002202402602800100%163163185 M+H M+H+M+N a M+N a+M+K M+K+CH3SCH3NOCH3O灭多虫灭多虫MW 162产生产生 M+H+准分子离子峰准分子离子峰 大气压化学电离可分为以下两个步骤:快速蒸发 气相化学电离(电晕放电)一般而言,只生成单电荷离子 几乎没有碎片离子 可能生成加合物和/或多聚体;一般是溶剂加合物及NH4+(M+18),Na+(M+23),和 K+(M+39)加合物 基质影响较小(相对于ESI),质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的影响液质联用接口液质联用接口 至至真空真空离子源离子源质量
18、分析器质量分析器 检测器检测器离子源离子源液质联用接口液质联用接口至至真空真空质量分析器质量分析器检测器检测器高真空部分高真空部分高真空部分高真空部分样品引入样品引入样品引入样品引入EI电离源电离源API电离源电离源 分子量分子量化合物极性化合物极性API(APcI-ESI)ParticleBeam(EI-CI)GC/MS(EI-CI)非极性非极性极性极性(离子离子)102103104105APPI质量过滤器质量过滤器样品引入样品引入 通过磁场和电场来传输和选择离子+离子源离子源电场电场磁场磁场 所有离子一同起跑所有离子一同起跑 质量小的跑得快质量小的跑得快 时间分辨时间分辨+离离子子源源So
19、urceDetectorNonresonant IonResonant Iondc and Rf voltages被分析离子由被分析离子由DC和和RF电压控制电压控制 原理与四极杆类似 离子被 RF&DC 电场所储存 扫描电场可以释放特定的m/z离子 分析器分析器 m/z范围范围 分辨率分辨率 质量精度质量精度 动态范围动态范围 真空真空 四极杆四极杆 103 103 0.1%105 10-5 离子阱离子阱 103 103-104 0.1%104 10-3 飞行时间飞行时间 106 103-104 0.1-0.01%104 10-6 扇形磁场扇形磁场 104 105 5ppm107 10-6
20、回旋共振回旋共振 105 106 10ppm104 10-9传统分辨率的计算公式传统分辨率的计算公式:分辨率分辨率R=m/m m于于 5%峰谷处测定峰谷处测定 现今现今:m=FWHM处处分辨率:质谱上是指分开相邻离子的能力 分辨率越高,越能区分小的质量差m/m=133/0.6=222 m/m=1009/0.5=2018Peak width at half height=0.6Peak width at half height=0.5半峰高处的峰宽为半峰高处的峰宽为 0.5-0.8 amu Low Rp High Rp质量过滤器质量过滤器样品引入样品引入dynodephosphorphotomultiplier 配有高压打拿极的光电倍增器，灵敏度高，线性范围广，可快速地检测正、负离子 10年的使用寿命
