1、液相色谱基础知识液相色谱基础知识Waters LC School 培训教材蒸馏离心电泳过滤超滤.色谱常见的分离方式常见的分离方式色谱法的分类色谱法的分类色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱高效液相色谱HPLCHPLC气相色谱HPLC分离的机理分离的机理分离是一个物理的过程。典型的仪器配置典型的仪器配置色谱泵及控制器色谱泵及控制器数据处理及控制数据处理及控制进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器W ate rs 486液相色谱的应用（一）液相色谱的应用（一）“分析型液相色谱”定性及定量分析.灵敏度的要求.样品的复杂性.样品量的要求.精度及准确度的要求.容易使用液相色谱的应用（二）液相色谱的
2、应用（二）“制备型液相色谱”分离及纯化.化合物的稳定性.样品的复杂性.制备量的要求.纯度的要求，及纯度的鉴定.方法的安全性开发液相色谱方法开发液相色谱方法问题 什么样的分离结果是好的?分辨率?什么是色谱的分辨率？什么是色谱的分辨率？分辨率的公式：)(211212WWVVR影响分辨率的因素：影响分辨率的因素：K，a a，N分辨率的方程.k 是容量因子，表达了样品与柱填料的作用强弱。.a 是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度。是化学因素。.N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。411 NkkRaa色谱柱的柱效色谱柱的柱效 N理论塔板数计算公式：Ws 方法Wtan16切线法Wh5.54半峰
3、高W3s9 3sW4s16 4sW5s25 5s21WVNs18.70RV plates 8742 20.8018.7016 4Ns0.80W InjectInject0.68W 16.63RV plates 9569 268.063.16164Ns用用“切线切线”法计算柱效法计算柱效 不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来7018.RVplates 8240 1.0318.7025N25 1.03W height4.4%height4.4%plates 3334 N5 s s2441631625.6316.RV1.44W Good ColumnBad ColumnIn
4、jectInject用用“5s s”法计算柱效法计算柱效提高柱效的方法提高柱效的方法色谱柱本身.减小填料的颗粒度.找到最佳的流速(根据不同内径).合适的温度.降低溶剂的粘度.增加柱长其他影响柱效的因素其他影响柱效的因素柱外效应.连接管路.进样器、检测器进样体积进样量容量因子容量因子 k改变k值的方法.调节流动相的极性、pH、离子强度等.梯度淋洗与峰高的关系与R的关系选择性系数选择性系数 a a定义.a=1 时两组分分不开，改变a的途径.改变固定相.改变流动相.改变温度.改变样品的本身性质120102 kkttttRRaaa1Ra a ，k，N 如何控制分辨率如何控制分辨率?液相色谱的检测模式液相色谱的检测模式示差折光示差折光电导电导紫外紫外荧光荧光电化学电化学响应响应通用选择性选择性选择性选择性灵敏度灵敏度毫克纳克纳克PicogramPicogram线性范围线性范围流速敏感流速敏感是是否否是温度敏感温度敏感是是否否是梯度淋洗梯度淋洗不可有限制可以可以脉冲的可以10410610510103106灵敏度、选择性、及适应能力色谱条件的优化色谱条件的优化分离度速 度容 量开发液相色谱方法开发液相色谱方法分辨率是色谱分离中主要考虑的因素在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下几个因素都要考虑。.灵敏度.载样量.分析速度.溶剂损耗.成本.容易使用.色谱柱寿命.效率
