1、第六章第六章 小 结l 植物体细胞杂交即原生质体融合，是获得胞质杂种的理想途径l 体细胞杂交在远缘育种与新物种、新资源创造中具有深远意义l 原生质体融合技术主要有PEG融合和电融合l 杂种的成功培养是建立在原生质体的培养技术上的，选择和鉴定是获得细胞杂种的关键l 提高融合效率和培养重复性是该技术研究的重点l 细胞杂种是体细胞遗传研究的良好体系思考题思考题1 1、原生质体定义、原生质体定义2 2、原生质体分离、纯化方法、原生质体分离、纯化方法3 3、原生质体融合方法及原理、原生质体融合方法及原理4 4、原生质体融合的意义、原生质体融合的意义5 5、植物原生质体培养的方法、植物原生质体培养的方法6
2、 6、植物体细胞杂交的概念和类型、植物体细胞杂交的概念和类型7 7、体细胞杂种鉴定方法、体细胞杂种鉴定方法8 8、体细胞杂种应用、体细胞杂种应用l 植物基因转化技术植物基因转化技术 载体介导法载体介导法,如农杆菌介导转化法如农杆菌介导转化法 DNA直接转移法直接转移法l 植物生物反应器植物生物反应器第八章第八章 植物转基因技术植物转基因技术 转基因研究技术的中心环节即为转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术重组技术，其最终目的是将其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。而使该生物体具有表现某种性状。转基因通过转基因通过获取基因获取基
3、因、重组基因重组基因和和表达基因表达基因等过等过程来实现。程来实现。转基因打破了转基因打破了物种物种的界限，使不同种的生物的遗的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。8.1 植物基因转化技术植物基因转化技术目的基因克隆的基本步骤 分离获得目的基因；分离获得目的基因；在体外进行在体外进行DNA重组，将外源重组，将外源DNA连接到能连接到能自我复制又带有选择标记的载体上；自我复制又带有选择标记的载体上；将重组将重组DNA转移入受体细胞；转移入
4、受体细胞；筛选出含有目的筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；的受体细胞克隆；(1)载体介导法载体介导法,如农杆菌介导转化法如农杆菌介导转化法根瘤根瘤存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。）。Ti质粒质粒 转移转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是，是Ti质质粒最重要的部分。粒最重要的部分。lT-DNA（transferred-DNA
5、）冠瘿碱（冠瘿碱（opine）的作用）的作用冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。不能利用冠瘿碱。l毒性基因（毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的的转移，转移，进入和整合。进入和整合。l冠瘿碱代谢基因冠瘿碱代谢基因分别编码代谢冠瘿碱的酶。维持农分别编码代谢冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。杆菌生长。第一步第一步:植物受伤植物受伤植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、酮、羟基
6、乙酰丁香酮），诱导羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的质粒上的毒性基因表达。毒性基因表达。农杆菌的感染和生存农杆菌的感染和生存第二步第二步 感染植物感染植物农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。基部）。第三步第三步 毒性基因（毒性基因（vir）表达）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。virA、virG、virD、virB第四步第四步 T-DNA转移转移第五步第五步 诱导冠瘿瘤诱导冠瘿瘤T-DNA被被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞基因产物切下来，
7、并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。核里，整合到植物基因组中。第六步第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。土壤农杆菌代谢冠瘿碱。改造后的改造后的Ti质粒载体模式质粒载体模式leftrightMCSAMProriVirselect叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡筛选培养基筛选培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗优点优点:u多为单拷贝或寡拷贝整合，转基因遗传较多为单拷贝或寡拷贝整合，转基因遗传较稳定，减少了共抑制等基因沉默现象稳定，减少了共抑制等基因沉默现象u属于单细胞转化，不存在嵌合体现象；属于单细胞转化，不存在嵌合体现象；u成本较低，转化效率较高。成本较低，转化效率较高。植
8、物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶和纤维素酶和果胶酶果胶酶DNA混合入电击缓混合入电击缓冲液冲液1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化(2)DNA直接转移法直接转移法电击法电击法u转化效率较低，且仅限于能由原生质体转化效率较低，且仅限于能由原生质体再生出植株的植物。再生出植株的植物。基因枪法（基因枪法（gene gun）基因枪法最早是由美国康奈基因枪法最早是由美国康奈尔大学的尔大学的Sanford最先提出的。最先提出的。它它通过高速飞行的金属颗粒通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的将包被其外的目的基因直接目的基因直接导入到受体细胞导入到受体细胞内，从而实内，从而实现
9、基因转化的方法。现基因转化的方法。1992年，年，世界首例转基因小鼠就是通世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。过该法获得的。又称又称高速微粒轰击法（高速微粒轰击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m钨弹头钨弹头吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入u但进去的但进去的DNA片段整合效率极低，不片段整合效率极低，不易获得再生植株，可能发生共抑制现象易获得再生植株，可能发生共抑制现象.基因枪法（基因枪法（gene gun）8.2 植物生物反应器植物生物反应器l 植物生物反应器是指植物生物反应器是指通过基因工程通过基因工程途径，以常见途径，以常见
10、的的农作物作为农作物作为“化学工厂化学工厂”，通过大规模种植通过大规模种植生产生产具有高经济附加值的具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物些次生代谢产物等等生物制剂生物制剂的方法。的方法。l 在植物生物反应器研究中，最受人们关注同时研在植物生物反应器研究中，最受人们关注同时研究进展也最快的是究进展也最快的是生产各种疫苗用的抗原蛋白生产各种疫苗用的抗原蛋白。l 疫苗的形式也由疫苗的形式也由菌体疫苗菌体疫苗发展到发展到亚单位疫苗亚单位疫苗（Subunit vaccine），
11、甚至还产生了），甚至还产生了DNA疫苗疫苗。8.2 植物生物反应器植物生物反应器l 1992年，美国人年，美国人C.J.Arntzen和和H.S.Mason率先提出了用率先提出了用转基因植物生产疫苗转基因植物生产疫苗的新思路。的新思路。l 此后，国内外多个实验室相继在烟草、马铃薯、番茄、苜此后，国内外多个实验室相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中蓿和莴苣中表达表达了了乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏毒素乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏毒素B亚亚基、霍乱毒素基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒G蛋蛋白白等等抗原抗原，并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人体，并利用
12、在植物中表达的抗原进行了动物和人体的免疫实验，获得了大量有价值的研究数据，为今后利用的免疫实验，获得了大量有价值的研究数据，为今后利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础转基因植物生产疫苗奠定了良好基础。l 植物来源的重组药用蛋白第一次临床应用研究是由星球生植物来源的重组药用蛋白第一次临床应用研究是由星球生物技术有限公司（物技术有限公司（Planet Biotechnology,Inc）.l 美国著名的孟山都公司（美国著名的孟山都公司（Monsanto）已经培育出一种）已经培育出一种转转基因玉米基因玉米，每公顷玉米可以产生，每公顷玉米可以产生3.7公斤达到药用蛋白标公斤达到药用蛋白标准的人类抗体。
13、准的人类抗体。l 植物来源的抗体在体外的稳定性和体内的生物活性与动物植物来源的抗体在体外的稳定性和体内的生物活性与动物细胞培养来源的抗体是相同的，利用它将开发出一种低成细胞培养来源的抗体是相同的，利用它将开发出一种低成本的治疗方法来防治某些由性传播的疾病。本的治疗方法来防治某些由性传播的疾病。l Large Scale Biology公司和斯坦福大学已经合作开发公司和斯坦福大学已经合作开发了一种肿瘤特异性疫苗，可用于阻止细胞的恶性生长，它了一种肿瘤特异性疫苗，可用于阻止细胞的恶性生长，它们利用植物病毒作为瞬时表达系统。们利用植物病毒作为瞬时表达系统。l 治疗的目的是在患者体内产生特殊的抗体，它
14、能特异性识治疗的目的是在患者体内产生特殊的抗体，它能特异性识别恶性生长的别恶性生长的B细胞表面特异性位点，使靶细胞最终受到细胞表面特异性位点，使靶细胞最终受到破坏，而正常的细胞不会受到任何影响。破坏，而正常的细胞不会受到任何影响。l 另外一个引起全球关注的研究成果是，另外一个引起全球关注的研究成果是，瑞士瑞士联邦技术研联邦技术研究所究所,在在2000年将年将水仙水仙的的八氢番茄红素合成酶和番茄红素八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶基因环化酶基因导入水稻导入水稻，研制出一种富含，研制出一种富含胡萝卜素（维生胡萝卜素（维生素素A前体）的水稻，品种名称前体）的水稻，品种名称T309，每克稻米含，每克
15、稻米含1.6mg胡胡萝卜素，由于萝卜素，由于稻米色泽金黄稻米色泽金黄，故称为，故称为“金色大米金色大米”。l 我国植物生物反应器的研究始于上世纪我国植物生物反应器的研究始于上世纪90年代初期，虽年代初期，虽然在构建高效植物表达载体和培育转基因植物等主要技术然在构建高效植物表达载体和培育转基因植物等主要技术环节上与国外相差无几，但在环节上与国外相差无几，但在研究的广度和深度上研究的广度和深度上与发达与发达国家相比却国家相比却存在很大差距存在很大差距。l 幸运的是，在制订幸运的是，在制订“九五九五”，“十五十五”“863”计划时，选择了计划时，选择了“利用转基因植物生产口服疫苗和生物可降解塑料利用
16、转基因植物生产口服疫苗和生物可降解塑料”等研究等研究课题予以资助。已取得较多的研究成果。课题予以资助。已取得较多的研究成果。l 我国我国植物生物反应器的研究和利用还植物生物反应器的研究和利用还主要集中在药用蛋白主要集中在药用蛋白的研究和应用方面。而利用转基因植物生产特殊饱和或不的研究和应用方面。而利用转基因植物生产特殊饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶制剂的研究仍然没有引起国家足够的重视，其工农业用酶制剂的研究仍然没有引起国家足够的重视，其实，这些生物制剂的市场潜力也是非常可观的。实，这些生物制剂的市场潜力也是
17、非常可观的。l 如利用转基因玉米生产植酸酶，在加工成动物饲料添加剂如利用转基因玉米生产植酸酶，在加工成动物饲料添加剂后，可有效降低家畜排泄物中的磷含量，这对于降低水污后，可有效降低家畜排泄物中的磷含量，这对于降低水污染和保护生态环境方面很有意义。染和保护生态环境方面很有意义。l 目前，利用重组目前，利用重组DNA技术生产的大多数治疗用技术生产的大多数治疗用血液蛋白血液蛋白几乎都是在几乎都是在哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统中生产出来的。该系统中生产出来的。该系统的主要优点是所表达的重组蛋白能够进行正确的折叠及完的主要优点是所表达的重组蛋白能够进行正确的折叠及完成其他翻译后加工过程的机会
18、比较高，然而，有许多因素成其他翻译后加工过程的机会比较高，然而，有许多因素仍然限制哺乳动物细胞表达系统的广泛应用，这些因素包仍然限制哺乳动物细胞表达系统的广泛应用，这些因素包括：括：1）即使在最适的培养条件下，重组蛋白在哺乳动物）即使在最适的培养条件下，重组蛋白在哺乳动物细胞中的细胞中的表达水平仍很低表达水平仍很低，通常为每天每升数十毫克；，通常为每天每升数十毫克；2）重组蛋白最后必需从培养液中）重组蛋白最后必需从培养液中分离提纯分离提纯出来，这出来，这会进一步导致产量损失和增加生产成本；会进一步导致产量损失和增加生产成本；3）哺乳动物细胞表达系统日常）哺乳动物细胞表达系统日常维护费用非常高维
19、护费用非常高，这也使，这也使产品的生产成本居高不下；产品的生产成本居高不下；4）哺乳动物细胞对外力比较敏感，而振荡培养通常又是）哺乳动物细胞对外力比较敏感，而振荡培养通常又是工业化大规模生产所不可缺少的，这就使扩大生产规模变得工业化大规模生产所不可缺少的，这就使扩大生产规模变得相当困难；相当困难；5）胎牛血清是哺乳动物细胞生长所不可缺少的，它的价）胎牛血清是哺乳动物细胞生长所不可缺少的，它的价格昂贵，而且不同批次之间成份相差很大，这些变化会导致格昂贵，而且不同批次之间成份相差很大，这些变化会导致细胞的生长情况不一致，进而影响到细胞发酵过程及下游的细胞的生长情况不一致，进而影响到细胞发酵过程及下
20、游的提纯加工过程；提纯加工过程；6）哺乳动物细胞对一些环境因素如温度、）哺乳动物细胞对一些环境因素如温度、pH值、含氧值、含氧量和次生代谢产物的变化非常的敏感，因此需要对培养条件量和次生代谢产物的变化非常的敏感，因此需要对培养条件进行精确的监控；进行精确的监控；7）利用哺乳动物细胞培养表达系统不能避免病原生物）利用哺乳动物细胞培养表达系统不能避免病原生物的污染。的污染。l 由于存在着上述限制因素，利用由于存在着上述限制因素，利用植物作为生物反植物作为生物反应器应器生产生产具有临床应用价值的具有临床应用价值的药用蛋白药用蛋白日益引起日益引起人们的关注。人们的关注。l 尤其是当重组蛋白需求量比较大，供给时间又是尤其是当重组蛋白需求量比较大，供给时间又是长期的话，利用植物表达系统很显然是一个不错长期的话，利用植物表达系统很显然是一个不错的选择，它除了具备其它真核生物表达系统共有的选择，它除了具备其它真核生物表达系统共有的那些优点外，还有一些是其它表达系统所不具的那些优点外，还有一些是其它表达系统所不具备的。备的。
