1、(完整)组织学基本技术ppt1.组织学（组织学（Histology）概念）概念 研究机体的研究机体的微细结构微细结构及其相关及其相关功能功能的科学。的科学。2.研究内容研究内容 是在细胞水平、亚细胞水平和分子水平上对是在细胞水平、亚细胞水平和分子水平上对机体进行研究。机体进行研究。一、组织学概念及研究内容一、组织学概念及研究内容尼康E-600光学显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜由二由二部分构成：部分构成：光学部分光学部分：包括聚：包括聚光镜、物镜和目镜；光镜、物镜和目镜；机械部分机械部分：包括镜：包括镜臂、载物台等。臂、载物台等。尼康尼康E-600光学显微镜光学显微镜尼康尼康E800荧光显微
2、镜荧光显微镜 莱卡倒置显微镜莱卡倒置显微镜 倒置显微镜：倒置显微镜：组成和普通显组成和普通显微镜一样，不同处物镜与照微镜一样，不同处物镜与照明系统颠倒，前者在载物台明系统颠倒，前者在载物台之上，后者在载物台之下。之上，后者在载物台之下。研究内容：研究内容：观察细胞培养中观察细胞培养中活细胞的形态结构和生长变活细胞的形态结构和生长变化情况。化情况。倒置相差显微镜：倒置相差显微镜：具有相差具有相差物镜，使活细胞的不同结构物镜，使活细胞的不同结构出现显著的明暗反差，并具出现显著的明暗反差，并具有立体感。有立体感。u 透射电镜透射电镜u 扫描电镜扫描电镜 透射电镜透射电镜观察细胞的内部结构观察细胞的内
3、部结构 观察细胞表面的立体结构观察细胞表面的立体结构扫描电镜扫描电镜透射电镜标本制备步骤透射电镜标本制备步骤扫描电镜标本制备步骤扫描电镜标本制备步骤三、显微组织标本的制备三、显微组织标本的制备组织制片的意义和目的组织制片的意义和目的组织制片技术是随着生命科学的发展而不断进步组织制片技术是随着生命科学的发展而不断进步的。利用组织切片染色的。利用组织切片染色(staining)的方法所制出的的方法所制出的标本显示了各种组织细胞的标本显示了各种组织细胞的不同结构和形态不同结构和形态，它，它们之间的相互连接及它们之中的某些化学成分的们之间的相互连接及它们之中的某些化学成分的种类和含量的变化，为细胞分子
4、学的研究提供了种类和含量的变化，为细胞分子学的研究提供了最直观的依据。因此，组织制片是研究医学和生最直观的依据。因此，组织制片是研究医学和生物学的一个物学的一个最基本和最重要最基本和最重要的手段。的手段。组织标本制作的方法组织标本制作的方法 组织切片法：组织切片法：利用利用化学试剂化学试剂将组织经过一系列的将组织经过一系列的固定固定(fixation)、脱水、透明后，再利用石蜡或火棉、脱水、透明后，再利用石蜡或火棉胶和明胶等支持物渗透进组织内部，使组织保持胶和明胶等支持物渗透进组织内部，使组织保持一定的硬度，并包埋一定的硬度，并包埋(embedding)成块，然后依靠成块，然后依靠切片机切片机
5、(microtome)将包埋好的组织块切成以微米将包埋好的组织块切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色得到的供显计的薄片，再根据需要进行各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法。包括：微镜下观察的标本的方法。包括：石蜡切片、火石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片，冰冻切片。棉胶切片、明胶切片，冰冻切片。组织组织不经过切片手续不经过切片手续制成的观察标本的方法为制成的观察标本的方法为非非组织切片法组织切片法。包括：涂片、压片、铺片、磨片、。包括：涂片、压片、铺片、磨片、消化分离、活体标本、整装标本、血管注射标本。消化分离、活体标本、整装标本、血管注射标本。涂片：涂片：将所采的血液或骨髓样品涂抹于载
6、玻片上将所采的血液或骨髓样品涂抹于载玻片上经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。压片：压片：先将组织处理成小块物质，然后经化学药先将组织处理成小块物质，然后经化学药品软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片上的标品软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片上的标本。例如运动终板等。本。例如运动终板等。非组织切片法非组织切片法铺片：铺片：将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于载玻片上，然后经过固定、染色等程序制成的标本。例载玻片上，然后经过固定、染色等程序制成的标本。例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等
7、。磨片：磨片：骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，直接在磨骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，直接在磨石上用手工磨成大约石上用手工磨成大约50微米左右的薄片，然后再进行染微米左右的薄片，然后再进行染色封固在载玻片上的标本。色封固在载玻片上的标本。消化分离：消化分离：将组织分离成小块，然后利用相应的化学将组织分离成小块，然后利用相应的化学药品水溶液将其细胞间质消化溶去，再用机械分离的方药品水溶液将其细胞间质消化溶去，再用机械分离的方法，如利用水的震荡冲击力等，使小块组织分离成单个法，如利用水的震荡冲击力等，使小块组织分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上封固的标本。而又完整的细胞，经染色后涂于载
8、玻片上封固的标本。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。活体标本：活体标本：将所采的观察标本加生理盐水后直接滴于载将所采的观察标本加生理盐水后直接滴于载玻片上在显微镜下观察。玻片上在显微镜下观察。整装标本：整装标本：一种是将胚胎或小动物经前期固定后整体封一种是将胚胎或小动物经前期固定后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中。另一种是将发育至某一阶藏于盛满固定剂的透明容器中。另一种是将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经固定、染色、脱水、透明后封固于段的鸡胚整体取出，经固定、染色、脱水、透明后封固于载玻片上的标本。载玻片上的标本。血管注射标本：血管注射标本：一
9、种是将有色物质注射进血管，用酸或一种是将有色物质注射进血管，用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血管标本。硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血管标本。另一种是将有色物质注射进血管后，经一系列制片技术处另一种是将有色物质注射进血管后，经一系列制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。切片：用于具有一定硬度的组织，例如肝、肾等切片：用于具有一定硬度的组织，例如肝、肾等涂片涂片:用于液态组织，如血液，精液和唾液。用于液态组织，如血液，精液和唾液。铺片铺片:用于很薄的组织，如肠系膜。用于很薄的组织，如肠系膜。磨片磨片:用于很坚硬的组织，如
10、骨和牙。用于很坚硬的组织，如骨和牙。（二）固定（二）固定使组织内的蛋白质迅速凝固或使组织内的蛋白质迅速凝固或沉淀，防止细胞自溶或组织腐败，尽沉淀，防止细胞自溶或组织腐败，尽量保持组织的原有结构和化学组成。量保持组织的原有结构和化学组成。u 单纯固定液单纯固定液 4%中性甲醛：用中性甲醛：用PH7.2-7.4的的PBS配制，配制后配制，配制后密封、密封、4保存，保存时间不超过一个月。适用保存，保存时间不超过一个月。适用HE染色和免疫组化。染色和免疫组化。4%多聚甲醛：用多聚甲醛：用PH7.2-7.4的的PBS配制。配制。乙醇混合固定液乙醇混合固定液u 复合固定液复合固定液 AF（乙醇（乙醇-甲醛
11、）固定液甲醛）固定液 Bouin固定液固定液 Carnoy固定液固定液 Zenker固定液固定液1.及时固定：最好动物死后半小时内固定，一般及时固定：最好动物死后半小时内固定，一般不超过不超过2小时。小时。2.固定液选择：根据组织的特点、染色方法选择固定液选择：根据组织的特点、染色方法选择合适的固定液。合适的固定液。3.固定液的量：一般为组织体积的固定液的量：一般为组织体积的6-10倍。倍。4.固定时间：在保存组织形态结构的同时，尽可固定时间：在保存组织形态结构的同时，尽可能较好保存组织细胞的抗原。能较好保存组织细胞的抗原。5.固定温度：低温可以保持好的结构。固定温度：低温可以保持好的结构。大
12、肠肌动蛋白actin阳性所用的抗体特异性差，与其它无关的抗原有交叉反应，特别是在应用多克隆抗体时更易出现。糖类 过碘酸-Schiff反应（PAS反应）Nucleus and Actin尼康E-600光学显微镜Cellular Structures铺片:用于很薄的组织，如肠系膜。酶类：例如辣根过氧化物酶，用光镜或电镜观察。包括：石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片，冰冻切片。（一）普通光学显微镜 （二）荧光显微镜单克隆抗体特异性强，灵敏度较低；苏木精-伊红染色的程序灌注固定：一般采用心脏灌注固定。直接法 间接法冰冻切片对脂类物质保持较好。一抗选择：选择单克隆抗体还是多克隆抗体。固定时间：在保存组织形态
13、结构的同时，尽可能较好保存组织细胞的抗原。多数细胞的细胞质（三）染色（三）染色u HE染色染色（hematoxylin-eosin staining）：组：组织学最常用的染色方法。织学最常用的染色方法。u 特殊染色：特殊染色：硝酸银染色、醛复红染色、甲苯胺硝酸银染色、醛复红染色、甲苯胺蓝染色等。蓝染色等。镀银染色镀银染色神经元神经元染色染色四四、组织化学与免疫组织化学术组织化学与免疫组织化学术组织细胞中的组织细胞中的物质物质（核酸、糖类、（核酸、糖类、脂类、蛋白质等）与脂类、蛋白质等）与相应试剂反应相应试剂反应，最后形，最后形成有色终产物，通过有色终产物在细胞中的成有色终产物，通过有色终产物在
14、细胞中的定位定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。的分布和含量。能在组织学标本上，定位、定性和能在组织学标本上，定位、定性和定量地显示分布于组织或细胞内某些物质。定量地显示分布于组织或细胞内某些物质。糖类糖类 过碘酸过碘酸-Schiff反应（反应（PAS反应）反应）DNA 福尔根反应（福尔根反应（Feulgen reaction）DNA 和和RNA甲基绿甲基绿-派若宁反应派若宁反应 脂类脂类脂溶性染料（苏丹红、油红脂溶性染料（苏丹红、油红O等）等）酶类酶类生化反应生化反应（二）免疫组织化学术（二）免疫组织化学术（immunohistochemis
15、try）根据根据抗原和抗体抗原和抗体特异性结合原理，特异性结合原理，检测组织、细胞中多肽和蛋白质等大分子物质的一检测组织、细胞中多肽和蛋白质等大分子物质的一种技术。用标记的抗体与组织中的抗原结合，然后种技术。用标记的抗体与组织中的抗原结合，然后通过通过化学反应化学反应，将抗原抗体结合部位显示出来，借，将抗原抗体结合部位显示出来，借助显微镜观察，确定检测物质的助显微镜观察，确定检测物质的分布、含量分布、含量。免疫组织化学原理模式图免疫组织化学原理模式图 抗原抗原 抗体抗体 抗原抗体复合物抗原抗体复合物 荧光素荧光素辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶胶体金胶体金根据根据染色步骤染色步骤分：分：u 直接法
16、直接法：直接标记第一抗体。该法简单，特异：直接标记第一抗体。该法简单，特异性强，但敏感性较差。性强，但敏感性较差。u 间接法间接法：不标记第一抗体，标记第二抗体。该：不标记第一抗体，标记第二抗体。该法敏感性较高。法敏感性较高。u 特殊的间接法特殊的间接法：第一抗体和第二抗体均不标记，：第一抗体和第二抗体均不标记，而是用酶标记与第二抗体结合的物质。该法敏感而是用酶标记与第二抗体结合的物质。该法敏感性高。包括性高。包括PAP法、法、ABC法、法、SABC法等。法等。荧光标记免疫组织化学荧光标记免疫组织化学 直接法直接法 间接法间接法免疫组织化学（荧光素标记）免疫组织化学（荧光素标记）毛细血管内皮细
17、胞呈毛细血管内皮细胞呈vWF阳性阳性血管性假血友病因子血管性假血友病因子 Nucleus and ActinEndoplasmic ReticulumNucleus and MicrotubulesActin and MicrotubulesCellular StructuresThe Golgi ApparatusStages of Mitosis酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学u ABC法：一抗生物法：一抗生物素化二抗素化二抗abc复合物复合物u S-P法法：一抗生物：一抗生物素化二抗素化二抗HRP标记的标记的链霉卵白素链霉卵白素u 选择合适抗体。选择合适抗体。u 抗体使用注意事项。抗体使
18、用注意事项。u PBS的冲洗：的冲洗：PBS的要求：的要求：PH 7.2-7.6；浓度：；浓度：0.02M。单独冲洗单独冲洗 温柔冲洗温柔冲洗 冲洗彻底冲洗彻底u DAB显色注意事项：显色注意事项：DAB是一种致癌物，严禁倒入水池，同时是一种致癌物，严禁倒入水池，同时注意自我保护。注意自我保护。新鲜配制：显色前新鲜配制：显色前10-15分钟配制。分钟配制。室温显色，需要在镜下控制显色时间，一室温显色，需要在镜下控制显色时间，一般在般在5-30分钟。分钟。洗涤剂清洗洗涤剂清洗泡泡 酸酸临用前防脱处理临用前防脱处理（明胶、多聚赖氨酸、（明胶、多聚赖氨酸、APES）流水冲洗流水冲洗烤箱烤干烤箱烤干流
19、水冲洗流水冲洗蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗烤箱烤干烤箱烤干37干燥备用干燥备用免疫组织载玻片特殊处理步骤免疫组织载玻片特殊处理步骤1.一抗选择：选择单克隆抗体还是多克隆抗体。一抗选择：选择单克隆抗体还是多克隆抗体。单克隆抗体特异性强，灵敏度较低；多克隆抗单克隆抗体特异性强，灵敏度较低；多克隆抗体特异性稍弱，灵敏度高，易出现非特异性染体特异性稍弱，灵敏度高，易出现非特异性染色。通过实验动物选择种属来源。能否做免疫色。通过实验动物选择种属来源。能否做免疫组化。检测标本类型：石蜡切片、冰冻切片生组化。检测标本类型：石蜡切片、冰冻切片生产厂家：国内、国外。产厂家：国内、国外。2.二抗选择：根据一抗种属选择二抗
20、种属来源二抗选择：根据一抗种属选择二抗种属来源。抗体选择抗体选择1.抗体保存：浓缩液于抗体保存：浓缩液于-80可保存三年左右。购买后，可保存三年左右。购买后，应在无菌条件下，将抗体分装成小包装，蜡膜密封。应在无菌条件下，将抗体分装成小包装，蜡膜密封。禁忌反复冻融。禁忌反复冻融。2.选择最佳抗体稀释度：抗体稀释液用山羊血清、选择最佳抗体稀释度：抗体稀释液用山羊血清、BSA或脱脂奶粉等。或脱脂奶粉等。3.抗体的加入：切片湿润，滴入抗体量以一滴抗体的加入：切片湿润，滴入抗体量以一滴50ul为好。为好。4.选择合适的孵育时间：选择合适的孵育时间：4孵育过夜，室温孵育过夜，室温2小时，小时，37 30-
21、60分钟。分钟。抗体使用注意事项抗体使用注意事项，与其它无关的抗原有交叉反，与其它无关的抗原有交叉反应，特别是在应用多克隆抗体时更易出现。应，特别是在应用多克隆抗体时更易出现。，导致抗体与，导致抗体与组织产组织产 生非特异性结合。生非特异性结合。出血和坏死：出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。实验操作不当：实验操作不当：边缘效应；切片脱蜡不彻底；边缘效应；切片脱蜡不彻底；PBS冲冲洗不彻底；底物显色时间过长等。洗不彻底；底物显色时间过长等。假阴性出现的原因假阴性出现的原因五、组织学的学习方法五、组织学的学习方法u 注意结构与功能的联系注意结构与功能的联系u 建立立体与动态的概念建立立体与动态的概念u 重视理论与实践的结合重视理论与实践的结合谢谢观看谢谢观看
