1、细胞中总 RNA 信使信使 RNA(mRNA):1-5%.RNA(mRNA):1-5%.作为蛋白质合作为蛋白质合成的模板。成的模板。核糖体核糖体 RNA(rRNA):80%.RNA(rRNA):80%.构成核糖体构成核糖体，参与蛋白质翻译，参与蛋白质翻译 转运转运RNARNA(tRNA):10-15%.(tRNA):10-15%.将将mRNAmRNA 中的中的信息翻译成氨基酸（携带正确的氨基酸）信息翻译成氨基酸（携带正确的氨基酸）信使信使RNARNA的表达在生物体内具有组织和时空特异的表达在生物体内具有组织和时空特异性。因此，性。因此，mRNAmRNA对于了解细胞中的信息流非常对于了解细胞中的
2、信息流非常重要重要.Size examine differential splicingSize examine differential splicing（检测可变剪接）检测可变剪接）Sequence Sequence 预测蛋白产物预测蛋白产物 Abundance Abundance 检测表达水平检测表达水平 Dynamics of expression Dynamics of expression 不同的时间、不同的时间、发育阶段和组织的特异性。发育阶段和组织的特异性。mRNAmRNA特点特点RNADNA2 OH group(ribose)2 H(deoxyribose)Uracil bi
3、nds Adenine(A,U,C,G)Thymine binds Adenine(A,T,C,G)Multiple types and rolesOne biological formOften permanently modified via splicingPermanently modificationsare rare(mutation)Usually single-strandedDouble strandedIntermolecular bindingDouble helix structure一、一、mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化RNA 分离 Total RNA from
4、 biological samples Organic extraction Affinity purification mRNA from total RNA Oligo(dT)resins mRNA from biological samples Oligo(dT)resinsRNA 分离从生物体内分离从生物体内分离 total RNAtotal RNA（有机分离法（有机分离法）Lyse/homogenize cells加入酚:氯仿:异戊醇到裂解细胞中并离心Organic phase separates from aqueous phase 有机相在底层 水相在上层(contains to
5、tal RNA)洗白破碎物以及大片段的基因组DNA在两相界面吸取上清至新管乙醇沉淀RNA并用水重新溶解用层析柱分离总用层析柱分离总 RNARNALyse cells,and spin to remove large particulates/cell debrisApply lysate(containing nucleic acids and cellular contaminants)to column with glass membrane用乙醇洗涤柱子，核酸结合在柱子上，其他物质从侄子中流出。用 DNase 处理污染的DNAApply water to the column;purif
6、ied RNA washes off the glass and is collected mRNA的 3 末端具有polyA 尾巴 Oligo(dT)探针用于分离总RNA中的mRNA mRNA can be eluted from oligo(dT)matrix using water or low-salt bufferMessenger RNA IsolationMessenger RNA IsolationG U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAAReverse transcriptasemRNAcDNAT T A G G A GTTTTTTTTTTTTTTT逆转
7、录polyT引物B、基因特异的引物、基因特异的引物C、随机引物、随机引物mRNAmRNAcDNAcDNAAAAAAAAAATTTTTTTTTmRNAmRNAcDNAcDNATTTTTTTTTA A、用已知氨基酸序列来获得简并序列、用已知氨基酸序列来获得简并序列抗原 一抗二抗信号放大特点是：已知蛋白产物，但对其核酸序列或氨基酸序列基本未知利用的基因文库必须是表利用的基因文库必须是表达文库，能够表达抗原达文库，能够表达抗原提取mRNART反应制备标记的cDNART反应获得cDNA获得cDNA文库转膜转膜杂交获得杂交信号杂交获得杂交信号目标基因阳性克隆表达目标基因提取mRNART反应制备标记的cDN
8、A不表达目标基因剪剪切切用生物素标记变性、退火变性、退火和杂交和杂交过柱B基因流出进一步构建文库获得目标基因A B CA CGal4结合域LacZBDBait(X)Bait(X)LacZGal4激活域ADPrey(Y)Prey(Y)LacZGal4激活域Gal4结合域BDADBait(X)Bait(X)Prey(Y)Prey(Y)Bait geneBait geneBD geneBD geneBait Bait plasmidplasmidAD geneAD geneprey geneprey geneprey prey plasmidplasmidBD geneBD geneBait Bai
9、t plasmidplasmidBait geneBait geneAD geneAD geneprey geneprey geneprey prey plasmidplasmid诱饵与靶蛋白之间的相互作用激活了报告基因的表达operatorRepoter geneoperatorRepoter geneoperatorRepoter geneBDX共转化+AD cDNANH2 COOHGal4Leu-cDNA libraryCOOHGal4Trp-NH2PromoterReporterBDXGal4?ADGal4第三节 cDNA表达文库的筛选酵母双杂交系统的小结酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)1、制备规范化的野生型cDNA文库自动制备质粒体外翻译突变体细胞提取物荧光反应底物检测荧光信号12345786A B C D E F G H I J K L12345786A B C D E F G H I J K L
