1、1.5 1.5 基因工程复习课基因工程复习课基因工程基因工程一、基因工程的概念一、基因工程的概念 。二、基因工程的基本工具二、基因工程的基本工具1.“1.“分子手术刀分子手术刀”（1 1）来）来源：主要是从源：主要是从 中分离纯化出来的。（中分离纯化出来的。（2 2）功能：使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的功能：使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 键断开键断开.（3 3）结果：经限制酶切割产生的）结果：经限制酶切割产生的DNADNA片段片段末端通常有两种形式：末端通常有两种形式：和和 .2.“2.“分子缝合针分子缝合针”。与。与DNADNA聚合聚合酶作用的异同酶作用的异同:DNA:DN
2、A聚合酶只能将聚合酶只能将 加到加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNADNA连接酶是连接连接酶是连接 的末端，形成磷酸的末端，形成磷酸二酯键。二酯键。限制性内切酶限制性内切酶原核生物原核生物磷酸二酯磷酸二酯黏性末端黏性末端平末端平末端DNADNA连接酶连接酶 单个核苷酸单个核苷酸 两个两个DNADNA片段片段 自主检测自主检测3.“3.“分子运输车分子运输车”。（1 1）载体具备的条件：）载体具备的条件：。（2 2）最常用的载体是）最常用的载体是 ,它是一种裸露的、结构简单它是一种裸露的、结构简单的、独立于的、独立于 ，并具有，并具有 的的双
3、链双链 DNADNA分子。分子。（3 3）其它载体：）其它载体：。三、基因工程的基本操作程序三、基因工程的基本操作程序第一步：第一步：。1.1.目的基因是指：目的基因是指：。2.2.人工合成目的基因常用方法有人工合成目的基因常用方法有 和和 。载体载体能在受体细胞中复制并稳定保存能在受体细胞中复制并稳定保存 具有一至多个限制酶切点，供外源具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入片段插入 具有标记基因，供重组具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择的鉴定和选择 质粒质粒细菌染色体细菌染色体DNA之外之外 自我复制能力自我复制能力 环状环状 噬菌体的衍生物、动植物病毒噬菌体的衍生物、动植物病毒
4、目的基因的获取目的基因的获取 编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因 反转录法反转录法化学合成化学合成第二步：第二步：。1.1.组成：组成：。（1 1）启动子：是一段有特殊结构的）启动子：是一段有特殊结构的 ，位于基因，位于基因的的 ，是，是 识别和结合的部位，能驱动基因识别和结合的部位，能驱动基因转录出转录出 ，最终获得所需的，最终获得所需的 。（2 2）终止子：也是一段有特殊结构的）终止子：也是一段有特殊结构的 ，位于，位于基因的基因的 。（3 3）标记基因：是为了鉴定受体细胞中是否含有）标记基因：是为了鉴定受体细胞中是否含有 ，从而将从而将 筛选出来。常用的标记基因筛选出来。常用的标记
5、基因是是 。基因表达载体的构建基因表达载体的构建 目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因DNADNA片段片段首端首端RNARNA聚合酶聚合酶mRNAmRNA蛋白质蛋白质DNADNA片段片段尾端尾端目的基因目的基因含目的基因的细胞含目的基因的细胞抗生素基因抗生素基因第三步：第三步：。1.1.转化的概念：转化的概念：.。将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 是目的基因进入受体细胞内，并且在受体是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程细胞内维持稳定和表达的过程2.2.常用的转化方法：常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是将目的基因导入植
6、物细胞采用最多的方法是 。农杆菌特点，易感染农杆菌特点，易感染 植物和裸子植物，而对大多植物和裸子植物，而对大多数数 植物没有感染力；植物没有感染力；将目的基因导入动物细胞：最常用的方法将目的基因导入动物细胞：最常用的方法 。此方法的受体细胞多是此方法的受体细胞多是 。第四步：第四步：。1.1.首先要检测转基因生物的染色体首先要检测转基因生物的染色体DNADNA上是否插入上是否插入 ，方法是采用方法是采用 。2.2.其次还要检测目的基因是否转录出了其次还要检测目的基因是否转录出了 ，方法是采，方法是采用用 。3.3.最后检测最后检测 ，方法是从转基因，方法是从转基因生物中提取生物中提取 ，用相
7、应的，用相应的 进行进行 。4.4.有时还需进行有时还需进行 的鉴定。的鉴定。农杆菌转化法农杆菌转化法 单子叶单子叶双子叶双子叶显微注射技术显微注射技术 受精卵受精卵 目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达 目的基因目的基因 DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 mRNAmRNA 用标记的目的基因作探针与用标记的目的基因作探针与mRNAmRNA杂交杂交 目的基因是否翻译成蛋白质目的基因是否翻译成蛋白质 蛋白质蛋白质抗体抗体抗原抗体杂交抗原抗体杂交 个体生物学水平个体生物学水平磷酸二酯键作用部位：作用部位：_磷酸二酯键磷酸二酯键 B.DNA连接酶连接酶（3）主干知识）主干知识磷酸二酯键磷酸二酯
8、键A.限制性内切酶限制性内切酶点拨点拨:黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoR2.2.：常用：常用1 1、细菌染色体外很小的双链、细菌染色体外很小的双链环状环状DNADNA分子分子2 2、能自我复制并在受体细胞、能自我复制并在受体细胞中稳定存在中稳定存在3 3、有一个或多个限制酶切点、有一个或多个限制酶切点4 4、有特殊的遗传标记基因、有特殊的遗传标记基因注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。点拨点拨:（4 4）易错点提醒）易错点提醒运载体运载体不是酶。不是酶。限制性内切酶和限制性内切酶和DNA连接酶的作用部位都是连接酶的作用部位都是磷酸二酯
9、键磷酸二酯键。目的基因与运载体结合需要的工具酶：目的基因与运载体结合需要的工具酶：_。B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合的结果可能有：目的基因与运载体结合的结果可能有：_。同种限制性内切酶和同种限制性内切酶和DNA连接酶连接酶目的基因与目的基因结合；质粒与质目的基因与目的基因结合；质粒与质粒结合；目的基因与质粒结合粒结合；目的基因与质粒结合（4）易错点提醒）易错点提醒分子水平分子水平:检测检测基因是否导入了细胞基因是否导入了细胞DNA分子杂交分子杂交；检测检测基因是否转录出了基因是否转录出了mRNA用基因探针与用基因探针与mRNA杂交杂交；检测检测基因是否表达出蛋
10、白质基因是否表达出蛋白质提取蛋白质，用抗提取蛋白质，用抗体与抗原特异性结合。体与抗原特异性结合。个体水平个体水平:如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。A.检测方法检测方法:B.基因工程步骤中，只有基因工程步骤中，只有第一、二、四步第一、二、四步发生发生碱基碱基互补配对互补配对。A.基因诊断的原理：基因诊断的原理：_DNA分子杂交分子杂交（3）主干知识点）主干知识点B.基因治疗的原理：基因治疗的原理：把把_导导入有入有_的细胞中，达到治疗疾病的细胞中，达到治疗疾病的目的的目的。正常的外源基因正常的外源基因基因缺陷基因缺陷（4）易错点提醒）易错点提醒若若受精卵受精卵
11、时进行基因治疗，则个体中时进行基因治疗，则个体中每个细每个细胞都含有正常基因胞都含有正常基因。若对患者。若对患者局部局部进行基因治进行基因治疗，则疗，则只有该部位有正常基因只有该部位有正常基因。基因治疗不能使基因治疗不能使缺陷基因改变为正常基因缺陷基因改变为正常基因。DNA DNA黏性末端黏合，黏性末端黏合，不属于不属于DNADNA分子杂交分子杂交。如下图所示，两个核酸片段在适宜的条件如下图所示，两个核酸片段在适宜的条件下，经下，经X X酶的催化作用，发生下述变化，酶的催化作用，发生下述变化，则则X X酶是（酶是（）A ADNADNA连接酶连接酶 B BRNARNA聚合酶聚合酶 C CDNAD
12、NA聚合酶聚合酶 D D限制酶限制酶A A例题例题1 继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答下列问题：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是 。（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入 .中，原因 .。（3）通常采用 技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的 .细胞中特异表达。（5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠体细胞的 转入 细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。该技术称为
13、。显微注射法显微注射法受精卵（或早期胚胎）受精卵（或早期胚胎）DNA分子杂交（核酸探针分子杂交（核酸探针）去核的卵去核的卵膀胱上皮膀胱上皮细胞核细胞核核移植（或克隆）核移植（或克隆）受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达相应组织细胞表达（1 1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNADNA分子所用的限制性内切分子所用的限制性内切酶作用于图中的酶作用于图中的 处，处，DNADNA连接酶作用于连接酶作用于 处。处。（填（填“a”“a”或或“b”“b”）（2 2）将重组）将重组DNADNA分子导入水稻受体
14、细胞的常用方法有农杆菌分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和转化法和 法。法。为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。盐水稻新品系。aa基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）（3 3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用的技术是）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用的技术是 ，该技术的核心是，该技术的核心是 。（4 4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位）为了确定耐盐转基
15、因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的素标记的 作探针进行分子杂交检测，又作探针进行分子杂交检测，又要用要用 方法从个体水平方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。鉴定水稻植株的耐盐性。植物组织培养植物组织培养脱分化（去分化）和再分化脱分化（去分化）和再分化耐盐基因（目的基因）耐盐基因（目的基因）一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。盐水稻新品系。科
16、学家从预期人的生长激素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，科学家从预期人的生长激素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了双链并人工合成了双链DNADNA片段，获得双链片段，获得双链DNADNA。将人的生长激素基因与大肠杆。将人的生长激素基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。已知限制酶菌的质粒进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。已知限制酶的识的识别序列和切点是别序列和切点是GGATCC GGATCC，限制酶，限制酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATC GATC 据图回答：据图回答：(1)(1)建构基因表达载体时，必须有建构基因表达载体时，必须有_、
17、目的基因、终止子以及、目的基因、终止子以及_。（2 2）为精确获取图中的目的基因，所用的限制酶是）为精确获取图中的目的基因，所用的限制酶是_。启动子启动子 标记基因标记基因限制酶限制酶和限制酶和限制酶 例例题题分分析析(3)(3)将基因表达载体导入细菌将基因表达载体导入细菌B B之前，要将细菌之前，要将细菌B B放入一定浓度的放入一定浓度的_溶溶液中处理，使之成为感受态的细菌。人的基因之所以能与大肠杆菌的质粒液中处理，使之成为感受态的细菌。人的基因之所以能与大肠杆菌的质粒进行重组并发挥其功能，是因为二者的空间结构都是进行重组并发挥其功能，是因为二者的空间结构都是_。(4)(4)人体的生长激素基
18、因能在细菌体内成功表达是因为人体的生长激素基因能在细菌体内成功表达是因为:_。(5)(5)将得到的大肠杆菌将得到的大肠杆菌B B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的，说明已导入了的，说明已导入了_，反之则没有导入。，反之则没有导入。(6)(6)上述制备人的生长激素，运用的现代生物工程技术是上述制备人的生长激素，运用的现代生物工程技术是_。例例题题分分析析CaClCaCl2 2 规则的双螺旋结构规则的双螺旋结构 共用一套（遗传）密码子共用一套（遗传）密码子 质粒或重组质粒质粒或重组质粒 蛋白质工程蛋白质工程绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因细胞
19、核细胞核猪胎儿猪胎儿成纤维细胞成纤维细胞TiTi质粒质粒重组质粒重组质粒水母水母重组细胞重组细胞猪卵母猪卵母细胞细胞细胞核细胞核早期胚胎早期胚胎受体母猪受体母猪绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白转基因克隆猪转基因克隆猪妊娠妊娠 分娩分娩去核卵去核卵母细胞母细胞 我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪在东北农业大学的种猪场自然分娩产我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪在东北农业大学的种猪场自然分娩产出，这标志着我国在转基因克隆猪技术领域已达到世界领先水平。下图为我国出，这标志着我国在转基因克隆猪技术领域已达到世界领先水平。下图为我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪的培育过程示意图，请据图回答：首例绿色荧光蛋白转基因克隆
20、猪的培育过程示意图，请据图回答：（1 1）过程必需用到的酶是）过程必需用到的酶是 。（2 2）重组质粒除了带有绿色荧光蛋白基因以外，还必须含有启动子、终止子）重组质粒除了带有绿色荧光蛋白基因以外，还必须含有启动子、终止子和和 _才能构成一个完整的基因表达载体。才能构成一个完整的基因表达载体。限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶）标记基因标记基因 例题分析例题分析（3 3）过程将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多也最有效的方法）过程将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多也最有效的方法是是 。然后还要通过。然后还要通过 技术来检测绿色荧光蛋白基因技术来检测绿色荧光蛋白基因是否已重组到猪胎儿成纤维细胞的染色体是否已重组到猪胎儿成纤维细胞的染色体DNADNA上。上。显微注射技术显微注射技术 DNA DNA分子杂交分子杂交
