1、高效液相色谱的维护与保养高效液相色谱的维护与保养 液相色谱仪器的使用及保养样品准备样品完全溶解在流动相中样品没有完全溶解过滤样品，确保样品中不含固体颗粒用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品进样量尽量小色谱泵的保养n流动相要过滤n常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用水冲洗柱塞杆清洗孔n拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为准n更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡.例如:使用无机盐缓冲液时,用前和用后均须用水过渡流动相的脱气流动相的脱气n流动相脱气的目的n使色谱泵的输液准确n输液均匀准确，并且脉动减小n保留时间及色谱峰面积的重现性提高n提高检测的性能n防止气泡引起的尖峰
2、n基线稳定，信噪比增加n溶剂的紫外吸收本底降低n保护色谱柱n减少死体积n防止填料的氧化n加热n简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化n抽真空n同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果n超声波n简单，但效果不理想。n通惰性气体（一般用氦气）n可保持连续脱气，多用于低压梯度n在线脱气机n可保持连续脱气，多用于低压梯度流动相脱气的方法流动相脱气的方法色谱泵的排气操作n使用前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：n将排液阀反时针转2-3圈，用10ml注射器抽，直到出液n按以下方法之一将泵的后面放空n将U6K的C阀打开，或717设在PURGE状态n或，将参比阀打
3、开n或，把色谱柱摘下n打开电源开关n开大流速到 69ml/minn同时用10ml注射器从排液阀注入流动相n直到泵后的流速稳定无气泡为止色谱泵的运行注意用外部控制器与用泵面板控制的区别有些型号的外部控制器与面板不能同时用如需要面板控制，需要断开控制线或关闭控制器排气后的色谱泵即可运行注意排气后，先设流速为 0恢复排气时断开的部分，如 进样器、色谱柱如需要，恢复排气时断开的控制线根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值液相色谱对流动相的要求n除色谱柱对流动相的要求外，还有n与检测器匹配n脱气n避免卤素离子（不锈钢系统）n溶剂的粘度n防止细菌的生长NameAcetic AcidAcetoneAceto
4、nitrileBenzeneButyl AlcoholCarbon TetrachlorideChloroformCyclohexaneCyclopentaneDichloroethaneDichloromethaneDimethylformamideDimethyl SulfoxideDioxanEthylacetateEthyl AlcoholDi-EthyletherHeptaneHexaneMethyl AlcoholMethylethyl KetoneI-OctanePentaneI-Propyl AlcoholTetrachloroethaneTetrahydrofuranTolu
5、eneAcetic AcidAcetoneAcetonitrileBenzeneCarbon TetChloroformCyclopentaneButyl AlcoholCyclohexaneDichloroethaneCH Cl 2 2DMFDMSODioxanEthylacetateEthyl AlcoholDi-EthyletherHeptaneHexaneMethyl AlcoholMEKI-OctanePentaneI-Propyl AlcoholDi-PropyletherC H 2 2 Cl 4 THFTolueneTrichloroethaneWaterXyleneTrichl
6、oroethaneWaterXyleneDi-PropyletherImmiscibleMiscible溶剂的相溶性溶剂的紫外吸收SolventUV Cutoff(nm)Acetonitrile190WaterCyclohexane195Hexane200Methanol210Ethanol210Diethyl Ether220Dichloromethane220Chloroform190240Carbon Tetrachloride265Tetrahydrofuran280(210)Toluene280UV Cutoff is the wavelength at which absorban
7、ce equals 1 AU.流动相的保存n有机溶剂流动相:n室温下密封,避光保存n缓冲盐流动相:n当日现配现用n低温下密封保存,一般不超过3天n防止长菌n有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:n低温密封保存n防止有机相的挥发n选用适宜的容器保存于聚乙烯瓶中的超纯水2 星期1 天1 星期1 小时新鲜配制5101520250保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水1 天1星期新鲜配制5101520250分检测器的保养n如长时间不用检测器可以关掉紫外灯n在4小时以上不用时，太频繁开关也不好n不要让缓冲液长期停滞在检测池内n用纯水冲洗n示差检测器及荧光检测器n注意流动池的耐压，不要在后面加压关于自动进样器的针清
8、洗nPurge Injector 与 Needle Washn洗针溶剂瓶(绿色塑料管)不要放在自动进样器的上部，应放于自动进样同一水平面n洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：流动相洗针溶剂缓冲溶液，反相50%水 50%甲醇纯缓冲溶液100%水非水溶液，反相100%甲醇正相流动相GPC流动相离子交换对离子试剂的水溶液液相色谱系统的清洗与钝化n一般采用30磷酸作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化n清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢n钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜测柱效 良好的色谱实验习惯n拿到一根新色谱柱时，先测柱效n保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试
9、条件n定期检测柱效n定期检测仪器的谱带展宽测柱效的方法n色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同n基本上所有的色谱柱均附有“使用与维护说明书”,可按说明书所述方法测定n以下是Waters反相C18柱的测定方法:n流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/minn样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600l丙酮n进样量5ln检测波长:254nm计算色谱柱的柱效 N理论塔板数计算公式：W 方法Wtan16切线法Wh 5.54 半峰高半峰高W39 3W416 4W525 5色谱柱的正确使用及操作n流动相的转换n特别是GPC柱n流速(压力)的变化幅度：0.1
10、ml/minn凝胶柱（GPC及糖柱）n温度的变化幅度n专用色谱柱 样品及溶剂的要求记记住住拿拿到到一一根根从从未未用用过过的的色色谱谱柱柱时时 一一定定要要先先看看其其使使用用说说明明！色谱柱与仪器的联接n不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时会造成严重后果：n色谱峰展宽（死体积）致使柱效下降或渗漏n解决办法：n自制相应的转换接头n使用“通用”型接头（锥箍及螺母）n这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即stop-depth长度可调。因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从Waters Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头,可用在各种类型的色谱柱上。色谱柱的联接n各种锥箍
11、和管路接头长度示意图:色谱柱安装及连接的机械因素连接不妥，造成漏液连接适当连接不妥由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽，机械问题谱带展宽谱带展宽色谱柱的在线保护装置n给色谱柱提供物理的保护n除去样品及流动相中的颗粒n给色谱柱提供化学的保护n防止分析柱被化学污染n装置n在线过滤器n自装填料保护柱n预装保护柱 nIn-Line Filtern防止颗粒在色谱柱头累积n优点：基本不影响柱效n在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）n可更换的消耗品n更换滤芯n更换垫圈色谱柱的在线保护装置保护柱可避免化学污染新型保护柱可提高整个色谱柱的柱效，甚至可作为色谱柱使用保护柱选择：选用与色谱柱相同的填料真正起到保
12、护作用保证色谱分离结果 使用保护柱延长色谱寿命实例：磺胺药物分析色谱柱的保护色谱柱的保护使用配Symmetry C8保护柱的色谱柱：首次进样相同保护柱与色谱柱：第950次进样更换新Sentry Guard保护柱：第951次进样n对所做的样品要有充分的了解n用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗n硅胶柱的一般方法n先用甲醇洗去极性杂质n用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化n键合相柱(烷基)的一般方法n20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗n若使用缓冲液，需先用不含盐的水溶液清洗色谱柱的清洗色谱柱的清洗记住每种色谱柱可能有特定的方法记住每种色谱柱可能有特定的方法 一定要先看其使用说明
13、！一定要先看其使用说明！色谱柱的存放色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、缓冲盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干涸避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度正确使用色谱柱（一）正确使用色谱柱（一）流动相方面除去微粒纯度的要求 -超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 -缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 -缓冲液（盐）的浓度 -溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 -溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度 -有机溶剂或水的比例正确使用色谱柱(二)色谱柱的在线保护装置 色谱柱的存放 启动液相色谱仪器的流程 常见问题分析混合问题问题：一个有紫外吸收的流动相与一个没有紫外吸收的流动相动态混合产生噪音，增加静态混合器可以
14、降低这种噪音。缺点:增加了死体积+静态混合器基线噪音可能的原因：检测池脏检测池灯能量下降由泵引起的脉冲检测器上的温度效应检测池中有气泡通过Time(min.)基线漂移梯度洗脱引起的温度不稳定（RID）流动相脏柱子没有用流动相平衡系统中污染物溢出鬼峰20%-100%MeOH梯度洗脱没有进样鬼峰没有进样就有色谱峰出现。原因流动相脏601530150371517柱外扩展用较短的、窄内径的毛细管连接进样器和色谱柱以及柱子和检测器。确认连接管的接头都相互匹配。使用死体积小的流动池减小进样量增加柱外死体积峰形柱头塌陷或柱床运动。泵头过滤芯(Frit)部分堵塞。组份共流出1双峰双峰正常双峰柱头塌陷峰形2峰扩
15、展峰扩展所有峰都扩展柱效降低或有柱塌陷进样体积过大流动相粘度大部分峰扩展前一次分析样品的流出物高分子量样品蛋白质或聚合物峰形原因：原因：部分峰拖尾部分峰拖尾正常拖尾正常拖尾二次保留效应残留硅醇的相互作用小峰在大峰后洗脱出来 3拖尾拖尾对称因子对称因子1.2柱头有污染物堆积重金属反应所有峰均拖尾所有峰均拖尾柱外效应柱子失效峰对称ABS=BAExcellentS=1.0-1.05AcceptableS=1.2UnacceptableS=2AwfulS=4 峰形原因：正常前伸柱子过载4前伸峰前伸峰小峰在大峰之前洗脱出来对称因子对称因子 0.9峰形原因正常负峰样品吸收比流动相吸收小。5负峰负峰溶解样品的溶剂通过柱子时平衡被破坏RID中最常见
