1、干旱胁迫对水稻类囊体膜蛋干旱胁迫对水稻类囊体膜蛋白质组的变化研究白质组的变化研究导导 师：梁建生师：梁建生 研究生：王研究生：王 琳琳目目 录录水稻是世界上最重要的三大粮食作物之一，养活了世界一半以上的人口。水稻也是我国的第一大农作物，在粮食生产和国民经济中起着极其重要的作用。影响水稻产量的因素影响水稻产量的因素产产 量量 增增 加加培育高产新品培育高产新品适宜生长条件适宜生长条件加强管理加强管理病虫害病虫害恶劣环境恶劣环境疏于管理疏于管理产产 量量 降降 低低 水水 稻稻水分亏缺造成的植物生长减缓和作物减产的损失超过了其他逆境因素减产的总和。干旱胁迫对水稻生理生化的影响干旱胁迫对水稻生理生化
2、的影响 当干旱等逆境来临时，植物可以主动感知环境刺激信号并激发各种抗旱反应。干旱影响光合作用主要是通过气孔限制和非气孔限制两个因素造成的。干旱干旱干旱对水稻光合作用的影响干旱对水稻光合作用的影响类囊体光合作用的光反应场所四种复合体四种复合体（光合系统IPSI，光合系统IIPSII，ATP合成酶系，细胞色素b6/f复合体）至少含有70种蛋白质用以完成光合反应。蛋白质在质体基因组与核基因组的协同表达，蛋白质积累和合成许多辅助蛋白的协同作用机制都是需要解决的问题。本实验选用基因组测序完成的日本晴作为材料，将干旱胁迫对水稻叶片的光合特性的影响和对水稻类囊体膜蛋白质组的影响相结合进行研究，以期从微观的蛋
3、白质组水平上阐明宏观上干旱影响水稻光合生理的机制。为培育抗干旱的高产水稻新品种提供理论依据和实验依据。研究意义研究意义1、干旱胁迫对水稻生理活性的影响干旱胁迫对水稻生理活性的影响2、干旱胁迫对水稻类囊体膜蛋白质组的干旱胁迫对水稻类囊体膜蛋白质组的影响影响 3、干旱胁迫对水稻光合生理变化的调控干旱胁迫对水稻光合生理变化的调控机理机理 2.1 研究内容研究内容 2.1.1 2.1.1 干旱胁迫对水稻生理活性的影响干旱胁迫对水稻生理活性的影响干旱不但明显降低了植株的净光合速率，使叶绿体超微结构损坏，叶绿素含量降低，而且降低了Rubisco酶和碳酸酐酶等酶的活性。干旱也影响了其他与光合作用有关的生理生
4、化过程，如降低气孔导度，使光合产物运输受阻等。当干旱达到一定程度，植物的光合机构就会遭到破坏，使光合能力出现大幅的下降。收集处理和收集处理和对照叶片对照叶片处理处理移栽移栽育秧育秧选种选种测光合速率，测光合速率，荧光等生理荧光等生理指标指标移栽于移栽于水培池水培池中中干旱处理干旱处理 类囊体膜有四种复合体（光合系统IPSI，光合系统IIPSII，ATP合成酶系，细胞色素b6/f复合体），它们各自又都有着辅助蛋白。这四种复合体至少含有70种蛋白质用以完成光合反应。干旱会引起类囊体膜上光能的吸收、传递和ATP合成的抑制。2.1.2 干旱胁迫对水稻类囊体膜蛋白质组的影响 2.1.3 干旱胁迫对水稻光
5、合生理变化的调控机理 干旱是导致水稻光合潜能不能充分发挥、进而导致产量降低的最重要的环境因素。从蛋白质组水平可以更好地阐明干旱胁迫影响水稻光合生理的机制，如对光合作用光能利用效率和碳同化作用调节机理的认识等。2.2 研究目标研究目标（1）干旱处理条件下水稻生理生化特性（2）建立或完善一套符合本实验室的叶绿体（及其亚组分）膜蛋白的提取和鉴定方法（3）建立干旱处理的类囊体膜蛋白质组的变化图谱（4）初步阐明干旱胁迫影响水稻光合生理的机制2.3 拟解决的关键问题拟解决的关键问题（1）如何简单有效分离高纯度的类囊体膜蛋白 （比如寻找适合水稻类囊体膜蛋白质组研究的 裂解液配方等）（2）水稻类囊体膜蛋白质组
6、图谱的建立（3）推断水稻光合作用受干旱胁迫的响应机理以 及植物对干旱环境的适应机制3.1 生理指标的测定方法生理指标的测定方法（1 1）土壤含水量的测定）土壤含水量的测定 土壤含水量（）（土壤湿重土壤干重）/土壤湿重100（2 2）叶片水势的测定）叶片水势的测定叶片水势用压力室法（Soilmoisture）测定。（3 3）叶片光合速率、气孔导度和叶绿素荧光参数）叶片光合速率、气孔导度和叶绿素荧光参数的测定的测定用LI-6400P光合仪测水稻倒二叶的光合速率和气孔导度。用叶绿素荧光仪测水稻倒二叶叶绿素荧光参数。完整叶绿体沉淀破碎叶绿体1.2mol/L蔗糖梯度液1.5mol/L蔗糖梯度液图2 蔗糖
7、密度梯度离心后各梯度的组分示意加入加入1010倍体积的倍体积的含含0.070.07巯基乙醇巯基乙醇的丙酮的丙酮类囊体膜类囊体膜-20-20沉沉淀淀45min45min44，3500035000g g离心离心15min15min1010倍体积的含倍体积的含1010TCATCA的的丙酮溶液丙酮溶液加入加入44，3500035000g g离心离心15min15min沉淀物沉淀物适量适量LysisLysis Solution Solution I I加入加入3737，水浴，水浴1hr1hr同时同时充分搅拌且超声波充分搅拌且超声波震荡震荡3 3次次2020，1900019000g g离心离心15min1
8、5min取上清液取上清液沉淀物沉淀物1010倍体积倍体积的含的含0.070.07巯巯基乙醇的基乙醇的丙酮丙酮-20-20沉沉淀淀1hr1hr加入加入44，3500035000g g离心离心15min15min重复重复2323次次真空冻干真空冻干图图2 2 蛋白质提取流程图蛋白质提取流程图3.2 类囊体膜蛋白质的提取类囊体膜蛋白质的提取3.3 Western blotting法鉴定类囊体膜法鉴定类囊体膜 类囊体膜蛋白质组的类囊体膜蛋白质组的Western blottingWestern blotting结果结果1.1.A A、B B分别是用抗分别是用抗PSIPSI抗体、抗抗体、抗LHCIILHC
9、II抗体检测的结果；抗体检测的结果；2.2.泳道泳道1 1、2 2的上样量分别为的上样量分别为50g50g、100g100g；A AB B1 12 21 12 2118kD118kDa a90kDa90kDa49kDa49kDa35kDa35kDa26kDa26kDa19kDa19kDaPSIPSILHCIILHCII图3 水平半干式电泳印迹示意水平半干式电泳印迹示意水平半干式电泳印迹示意蛋白质组学研究方法蛋白质组学研究方法样品全息制备样品全息制备双向凝胶电泳双向凝胶电泳图像分析图像分析质谱和蛋白质鉴定质谱和蛋白质鉴定The Complete Proteomics Solution Sampl
10、e PrepImage acquisitionImage analysisSample labelling2D SeparationAutomated spot pickingAutomated spot digestionAutomated MALDI spottingMSLaboratory workflow system样品制备固相pH 梯度胶条的水化第一向等电聚焦第二向SDS-PAGE检测染色3.4 双向电泳双向电泳硝酸银染色硝酸银染色电泳后的凝胶电泳后的凝胶 固定液固定，脱色摇床振荡固定液固定，脱色摇床振荡1h1h敏化液增敏敏化液增敏 30min 30min银染液摇床振荡银染液摇床振
11、荡 20min 20min显色液显色，显色液显色，大约大约3min3min终止液停显终止液停显10min 10min 水洗水洗5min,5min,重复重复3 3次次水洗水洗5min,5min,重复重复3 3次次染色后的凝胶染色后的凝胶 3.5 图像分析图像分析n凝胶图像的扫描：n图像加工：n斑点检测和定量：n凝胶配比：n数据分析：n数据呈递和解释：n2-DE数据库的建立：3.6 数据库比对差异蛋白质数据库比对差异蛋白质Mascot Wizard软件（Matrix Science Ltd.），设置适当的参数和数据库，对目的蛋白质的PMF进行网上数据库匹配。根据实际等电点和分子量以及匹配的结果确定
12、与目的蛋白质的PMF最相符的蛋白质。3.7 可行性分析可行性分析（1）本实验所提出的技术路线和实验方案是 切实可行的；（2）本研究所涉及的一些关键技术和研究方法 都是本实验室的常规方法；（3）本实验是由工作多年的青年教师完成，长期从事蛋白质化学和蛋白质组学方面的 研究工作，积累了比较丰富的经验。建立水稻蛋白质组学研究的技术平台建立了一套分离纯化水稻叶绿体和类囊 体膜蛋白并对其鉴定的系统方法。建立研究水稻（日本晴）响应干旱后类 囊体膜蛋白质组的变化以及阐明干旱胁 迫影响水稻光合生理的机制的系统方案第一阶段：栽培获取材料和生理数据的测定。第二阶段：类囊体膜的分离、提取蛋白第三阶段：双向电泳和图像分
13、析第四阶段：差异点进行质谱鉴定，网上搜库比对第五阶段：整理数据，完成论文5.1 研究计划研究计划5.2 预期研究结果预期研究结果（1）测定干旱处理条件下水稻生理生化特性（2）建立或完善一套符合本实验室的叶绿体 （及其亚组分）膜蛋白质组学的研究方法（3）建立干旱处理的水稻类囊体膜蛋白质组 的双向电泳图谱，初步阐明干旱胁迫影响 水稻光合生理的机制6.1 工作基础工作基础土壤干旱处理水稻样品培育技术土壤含水量的测定技术水稻蛋白质的提取和定量技术蛋白质免疫印迹技术 双向电泳技术银染和考染技术图象分析技术水稻蛋白质的原位酶解技术质谱分析技术6.2 前期研究工作的积累前期研究工作的积累 随着干旱进行，土壤
14、含水量迅速下降，但两品种的土壤含水量下降的速度和程度存在比较大的差异。9311的土壤含水量的下降速度和程度大于日本晴的土壤含水量图图3 停止灌水后土壤含水量的变化停止灌水后土壤含水量的变化（1 1）土壤干旱对土壤含水量）土壤干旱对土壤含水量(SWC)的影响的影响（2 2）土壤干旱对水稻叶片水势的影响）土壤干旱对水稻叶片水势的影响 随着停止灌溉时间的延长，9311和日本晴叶片水势均呈现明显下降趋势，品种间差异与土壤含水量的变化相似。（3 3）土壤干旱和强光处理对叶片光合速率的影响）土壤干旱和强光处理对叶片光合速率的影响叶片的光合速率随着土壤干旱程度的不断加剧而下降，两水稻品种表现出类似的变化趋势
15、。复水后叶片的光合速率又恢复到干旱前的水平。强光对两品种叶片光合速率有显著的抑制作用（即光抑制），且抑制的程度随干旱程度的加剧而加重。（4 4）干旱和强光对叶片叶绿素荧光特性的影响）干旱和强光对叶片叶绿素荧光特性的影响随着干旱程度的加深，日本晴的Fv/Fm迅速下降，复水以后重新回升。光抑制的情况下，Fv/Fm下降更为显著。Fv/Fm呈现相似的变化趋势，但是强光处理对Fv/Fm的变化影响不大图图6 6 土壤干旱和强光对水稻日本晴叶片土壤干旱和强光对水稻日本晴叶片PS IIPS II光化学量子产量的影响光化学量子产量的影响（5 5）水稻叶片叶绿体提取和完整率的鉴定）水稻叶片叶绿体提取和完整率的鉴定 采用差速离心和蔗糖密度梯度离心等方法所获得的叶绿体 经过荧光显微镜和光学显微镜检测，完整率和纯度高。6.3 工作条件工作条件 现有的主要仪器设备现有的主要仪器设备LI-6400P型光合仪FMS-2型荧光仪5810 R型冷冻离心机Novalyple-NL500真空冻干仪Virsonic 100型超声波破碎仪PROTEAN型电泳槽IPGphor等电聚焦仪循环水浴箱清华紫光扫描仪U-2000型紫外-可见分光光度计
