1、抗体酶核酶极端医学抗体酶核酶极端医学知识知识10.1 模拟酶11.1.1 模拟酶的概念模拟酶的概念 模拟酶又称人工酶或酶模型，是在分子模拟酶又称人工酶或酶模型，是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机制和立体环境等结构特征，以及酶的作用机制和立体化学的一门学科，是从分子水平上模拟生物化学的一门学科，是从分子水平上模拟生物功能的一门边缘学科。功能的一门边缘学科。模拟酶是模拟酶是20世纪世纪60年代发展起来的一个新的研年代发展起来的一个新的研究领域，是仿生高分子的一个重要的内容。究领域，是仿生高分子的一个重要的内容。2抗体酶
2、核酶极端医学知识用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程。原理以及酶在生物体内的化学反应过程。酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等特点。效率高、专一性强、反应条件温和等特点。酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂。活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。3抗体酶核酶极端医学知识模拟酶的酶学基础模拟酶的酶学基础酶的
3、作用机制：过渡态理论酶的作用机制：过渡态理论对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究2.2.模拟酶理论基础模拟酶理论基础4抗体酶核酶极端医学知识 主主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补电子排列的互补 超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结构和性质的实体，形成超分子构和性质的实体，形成超分子 功能：分
4、子识别、催化、选择性输出功能：分子识别、催化、选择性输出5抗体酶核酶极端医学知识3设计要点设计前：设计前：l酶活性中心酶活性中心-底物复合物的结构底物复合物的结构l酶的专一性及其同底物结合方式的能力酶的专一性及其同底物结合方式的能力l反应的动力学及各中间物的知识反应的动力学及各中间物的知识 6抗体酶核酶极端医学知识3设计要点设计中：设计中：l为底物提供良好的微环境为底物提供良好的微环境l催化基团必须相对于结合点尽可能同底物催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近的功能团相接近l应具有足够的水溶性，并在接近生理条件应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性下保持其催化活性7抗
5、体酶核酶极端医学知识4.4.模拟酶的分类和制备模拟酶的分类和制备单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性重建和改造酶活性机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成合成单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子化活性的简单分子8抗体酶核酶极端医学知识按照模拟酶的属性按照模拟酶的属性l主主-客体酶模型客体酶模型l胶束酶模型胶束酶模型l肽酶肽酶l抗体酶抗体
6、酶l分子印迹酶模型分子印迹酶模型l半合成酶半合成酶9抗体酶核酶极端医学知识主-客体模型1.环糊精模拟酶环糊精模拟酶-水解酶的模拟水解酶的模拟环糊精的分子结构环糊精的分子结构10抗体酶核酶极端医学知识11抗体酶核酶极端医学知识水解酶模型12抗体酶核酶极端医学知识研究热点环糊精（环糊精（CD）分子）分子l原来：在原来：在CD的两面引入催化基团，通过柔性的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善或刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结的疏水结合和催化功能合和催化功能l现在，桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重现在，桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用或多重疏
7、水结合作用和多重识别作用13抗体酶核酶极端医学知识2.2.冠醚化合物的模拟酶冠醚化合物的模拟酶冠醚水解酶模拟物14抗体酶核酶极端医学知识胶束模拟酶胶束模拟酶单单分分子子胶胶束束酶酶模模型型15抗体酶核酶极端医学知识胶束酶模型16抗体酶核酶极端医学知识目前模拟酶的研究主要有以下几方面：目前模拟酶的研究主要有以下几方面：1.1.模拟酶的金属辅基模拟酶的金属辅基:有一类复合酶有一类复合酶,除蛋白质外除蛋白质外,还有含金属的有机小分还有含金属的有机小分子物质或简单的金属，叫做辅酶或辅基。辅基在催子物质或简单的金属，叫做辅酶或辅基。辅基在催化反应中起着重要的作用。有一些研究工作就是模化反应中起着重要的作
8、用。有一些研究工作就是模拟酶分子中的金属辅基。拟酶分子中的金属辅基。例如，模拟过氧化氢酶分子中的铁卟啉辅基，合成例如，模拟过氧化氢酶分子中的铁卟啉辅基，合成了分解过氧化氢的酶模型了分解过氧化氢的酶模型三亚乙基四胺与三价三亚乙基四胺与三价铁离子的络合物。这个模型在铁离子的络合物。这个模型在pH9.5pH9.5和和2525的条件的条件下，其催化速率是血红蛋白或正铁血红素在同样条下，其催化速率是血红蛋白或正铁血红素在同样条件下的一万倍。化学模拟生物固氮同样是模拟固氮件下的一万倍。化学模拟生物固氮同样是模拟固氮酶的金属辅基。酶的金属辅基。17抗体酶核酶极端医学知识2.2.模拟酶的活性功能基酶分子中直接
9、与酶催化反应模拟酶的活性功能基酶分子中直接与酶催化反应有关的活性中心，通常是由几个活性功能基组成。有关的活性中心，通常是由几个活性功能基组成。例如牛胰核糖核酸酶的催化中心是肽链序列中第例如牛胰核糖核酸酶的催化中心是肽链序列中第1212位位和第和第119119位的两个组氨酸。位的两个组氨酸。C.G.C.G.奥弗贝格等根据胰凝乳蛋白酶的催化中心与丝奥弗贝格等根据胰凝乳蛋白酶的催化中心与丝氨酸的羟基、组氨酸的咪唑基和天冬氨酸的羧基有关氨酸的羟基、组氨酸的咪唑基和天冬氨酸的羧基有关的事实，用乙烯基苯酚与乙烯基咪唑进行共聚合，制的事实，用乙烯基苯酚与乙烯基咪唑进行共聚合，制得带有羟基和咪唑基的得带有羟基
10、和咪唑基的-胰凝乳蛋白酶模型胰凝乳蛋白酶模型,用这个模用这个模型聚合物作为型聚合物作为3-3-乙酰氧基乙酰氧基N N三甲基碘化苯胺三甲基碘化苯胺,水解水解的催化剂，当的催化剂，当pHpH为为9.19.1时时,其活性比单一的乙烯基咪唑其活性比单一的乙烯基咪唑高高6363倍。倍。18抗体酶核酶极端医学知识3.3.模拟酶与底物的作用模拟酶与底物的作用酶分子具有一定的空间构型，它与被催化酶分子具有一定的空间构型，它与被催化的底物的作用在构型上有较严格的匹配关的底物的作用在构型上有较严格的匹配关系，体现了酶的专一性。为了模拟酶的结系，体现了酶的专一性。为了模拟酶的结合功能，近年来人们合成了许多冠醚化合合
11、功能，近年来人们合成了许多冠醚化合物来模拟酶。随着冠醚空穴尺寸的不同，物来模拟酶。随着冠醚空穴尺寸的不同，其对底物的选择性也不一样。其对底物的选择性也不一样。19抗体酶核酶极端医学知识4.模拟酶的性状在水溶液中，酶形成巨大的模拟酶的性状在水溶液中，酶形成巨大的分子缔合体（胶束），构成同一分子内的疏水分子缔合体（胶束），构成同一分子内的疏水和亲水微环境。模拟酶的这种微环境中的化学和亲水微环境。模拟酶的这种微环境中的化学反应的特殊性质，也是模拟酶的一个重要方面。反应的特殊性质，也是模拟酶的一个重要方面。有人利用组氨酸的衍生物十四酰组氨酸与十六有人利用组氨酸的衍生物十四酰组氨酸与十六酰烷基三甲基溴化
12、铵组成两种分子的混合微酰烷基三甲基溴化铵组成两种分子的混合微胶束，来催化乙酸对硝基苯酯的水解，其速率胶束，来催化乙酸对硝基苯酯的水解，其速率比组氨酸增加了比组氨酸增加了100倍。倍。20抗体酶核酶极端医学知识5.5.模拟酶的高分子作用方式模拟酶的高分子作用方式酶是一类由氨基酸组成，以多肽链为骨架的酶是一类由氨基酸组成，以多肽链为骨架的生物大分子。人们利用高分子化合物作为模生物大分子。人们利用高分子化合物作为模型化合物的骨架，引入活性功能基来模拟酶型化合物的骨架，引入活性功能基来模拟酶的高分子作用方式。的高分子作用方式。例如，用分子量为例如，用分子量为40000400006000060000的聚
13、亚乙基的聚亚乙基亚胺作为模型化合物的骨架，引入亚胺作为模型化合物的骨架，引入1010摩尔摩尔的十二烷基和的十二烷基和1515摩尔的咪唑基，合成一个摩尔的咪唑基，合成一个硫酸酯酶模型硫酸酯酶模型.用这个模型聚合物催化苯酚用这个模型聚合物催化苯酚硫酸酯类化合物的水解，其活性比天然的硫酸酯类化合物的水解，其活性比天然的型芳基硫酸酯酶高型芳基硫酸酯酶高100100倍。倍。21抗体酶核酶极端医学知识22抗体酶核酶极端医学知识内容抗体酶概念抗体酶概念抗体酶产生的理论基础抗体酶产生的理论基础抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法抗体酶的应用抗体酶的应用23抗体酶核酶极端医学知识抗体抗体由抗原诱导产生的，在结构上与
14、抗原高度由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。蛋白。抗体的最显著的特征是抗体的最显著的特征是多样性和专一性多样性和专一性24抗体酶核酶极端医学知识25抗体酶核酶极端医学知识抗体中的每条链中有恒定区和可变区。抗体中的每条链中有恒定区和可变区。26抗体酶核酶极端医学知识27抗体酶核酶极端医学知识相同点：相同点：都是蛋白质，都有特异性。都是蛋白质，都有特异性。不同点：不同点：1）酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态选择酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质，抗体是和基态分子结合的结合的催化性物质，抗体是和基态分
15、子结合的催化性物质。催化性物质。2）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。抗体与酶的异同：抗体与酶的异同：28抗体酶核酶极端医学知识酶是生物催化剂酶是生物催化剂酶是一类具有催化功能的生物分子酶是一类具有催化功能的生物分子酶反应有两个主要的特征：酶反应有两个主要的特征：l高催化效率、高选择性高催化效率、高选择性19461946年，年，PaulingPauling用过渡态理论阐明酶催化用过渡态理论阐明酶催化的实质的实质l酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合酶之所以具有催化活力是因
16、为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态并稳定化学反应的过渡态(底物激态底物激态)，从而降，从而降低反应能级。低反应能级。29抗体酶核酶极端医学知识对任何化学反应，反应物在对任何化学反应，反应物在变为产物之前，必须获得一变为产物之前，必须获得一定的能量，成为定的能量，成为活化态或活化态或称过渡态称过渡态。过渡态处于最。过渡态处于最高能阶上。高能阶上。过渡态与反应物的能阶之差过渡态与反应物的能阶之差称为称为活化能活化能。获得活化能的多少与反应的获得活化能的多少与反应的速度成正比。速度成正比。S 过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。过渡态理论过渡态理论30抗体
17、酶核酶极端医学知识S过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应所需的活化能。所需的活化能。过渡态理论过渡态理论31抗体酶核酶极端医学知识与反应过渡状态结合作用与反应过渡状态结合作用在酶催化的反应中，与酶的活性中心形在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状成复合物的实际上是底物形成的过渡状态，态，酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。或产物的亲和力。32抗体酶核酶极端医学知识19691969年年Jencks
18、Jencks根据抗体结合抗原的高度根据抗体结合抗原的高度特异性，与天然酶结合底物的高度专一特异性，与天然酶结合底物的高度专一性相类似的特性，在过渡态理论的基础性相类似的特性，在过渡态理论的基础上首先提出设想：上首先提出设想：l能与化学反应中过渡态结合的抗体，可能具能与化学反应中过渡态结合的抗体，可能具有酶的活性，催化反应的进行。有酶的活性，催化反应的进行。19861986年年LernerLerner和和SchultzSchultz证实了这一设想。证实了这一设想。抗体酶设想抗体酶设想33抗体酶核酶极端医学知识抗体酶的发现抗体酶的发现LernerLerner和和SchultzSchultz分别领导
19、各自的研究小组分别领导各自的研究小组首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。19861986年美国年美国LernerLerner和和SchultzSchultz两个实验室同两个实验室同时在时在ScienceScience上发表论文，报道他们成功地上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。得到了具有催化活性的抗体。并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催化催化抗体抗体，即，即抗体酶抗体酶。34抗体酶核酶极端医学知识19861986年年SchultzSchultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPCP
20、NPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快1200012000倍。倍。35抗体酶核酶极端医学知识抗体酶抗体酶抗体酶（抗体酶（AbzymeAbzyme）或催化抗体（）或催化抗体（Catalytic Catalytic antibody)antibody)是抗体的高度选择性和酶的高效是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。催化能力巧妙结合的产物。l本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋 白，在白，在其可变区赋予了酶的属性。其可变区赋予了酶的属性。l它是利
21、用现代生物学与化学的理论与技术交叉研它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是究的成果，是抗体的高度选择性抗体的高度选择性和和酶的高效催化酶的高效催化能力能力巧妙结合的产物。巧妙结合的产物。36抗体酶核酶极端医学知识抗体酶具有典型的酶反应特性抗体酶具有典型的酶反应特性与配体与配体(底物底物)结合的专一性，包括立体专结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；甚至超过天然酶的专一性；具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快度比非催化反应快10102 210106
22、 6倍，有的反应速倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及力学及pHpH依赖性等。依赖性等。37抗体酶核酶极端医学知识过渡态理论与抗体酶过渡态理论与抗体酶如果使抗原最大限度地接近某一特定反如果使抗原最大限度地接近某一特定反应的过渡态，就可能使诱导的抗体在与应的过渡态，就可能使诱导的抗体在与之结合时发挥催化作用。之结合时发挥催化作用。实际所采用的过渡态抗原知识推测而设实际所采用的过渡态抗原知识推测而设计的计的过渡态类似物过渡态类似物。用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反用过渡态类似物诱导的抗
23、体所催化的反应并非该类似物本身，而是与其相似的应并非该类似物本身，而是与其相似的另一种反应。另一种反应。38抗体酶核酶极端医学知识抗体酶的特性抗体酶的特性1、能催化一些天然酶不能催化的反应、能催化一些天然酶不能催化的反应l有许多化学反应还没有已知酶催化进行有许多化学反应还没有已知酶催化进行l抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性多样性l抗体酶可以根据需要人工裁制抗体酶可以根据需要人工裁制一种对酶促反应过渡态特异的抗体一种对酶促反应过渡态特异的抗体l结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一
24、性结合作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。抗原的作用。39抗体酶核酶极端医学知识抗体酶的催化反应类型抗体酶的催化反应类型1 1、转酰基反应、转酰基反应2 2、水解反应、水解反应3 3、ClaisenClaisen重排反应重排反应4 4、酰胺合成反应、酰胺合成反应5 Diels-Alder5 Diels-Alder反应反应6 6、转酯反应、转酯反应7 7、光诱导反应、光诱导反应8 8、氧化还原反应、氧化还原反应9 9、脱羧反应、脱羧反应1010、顺反异构化反应、顺反异构化反应40抗体酶核酶极端医学知识抗体酶的特性抗体酶的特性2、有更强的专一性和稳定性、有更强的专一性和稳定性l抗体的
25、精细识别使其能结合几乎任何天然的抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子或合成的分子l抗体酶催化反应的介质效应抗体酶催化反应的介质效应l酯解反应中介质效应酯解反应中介质效应：抗体酶在有机溶抗体酶在有机溶剂中具稳定性。剂中具稳定性。l脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。反应速率增加。l酰基转移反应中介质效应酰基转移反应中介质效应：在疏水溶剂中，：在疏水溶剂中，活性较高。活性较高。41抗体酶核酶极端医学知识抗体酶的制备抗体酶的制备将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。法、化学
26、修饰法等途径。l诱导法诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。即抗体酶。l拷贝法拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互抗体互补性来设计的。补性来设计的。l引入法引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。其获得催化功能。l化学修饰法化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。催化基团相连。42抗体酶核
27、酶极端医学知识 用设计好的半抗原，通过与载体蛋白用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。43抗体酶核酶极端医学知识44抗体酶核酶极端医学知识用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，得单克隆的抗
28、抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。获得具有原来酶活性的抗体酶。45抗体酶核酶极端医学知识46抗体酶核酶极端医学知识3.引入法n将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术可利用蛋白质工程和基因工程技术47抗体酶核酶极端医学知识四、抗体酶的应用四、抗体酶的应用 1.1.戒毒戒毒:用可卡因水解的过渡态类似物用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的
29、可卡因片断失去可卡因刺激功能。水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。48抗体酶核酶极端医学知识 2.肿瘤治疗肿瘤治疗 抗体介导前药治疗技术抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。49抗体酶核酶极端医学知识第二节 核 酶（Ribozyme)一、核酶的概
30、念二、核酶的种类三、核酶的应用四、核酶面临的问题五、影响核酶活性的因素50抗体酶核酶极端医学知识 具有生物催化功能的RNA。生物催化剂生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶极端酶 extremozyme 抗体酶抗体酶 abzyme 生物工程酶生物工程酶其它：模拟酶其它：模拟酶核酸类核酸类:克隆酶克隆酶遗传修饰酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme51抗体酶核酶极端医学知识 I型内含子剪接型核酶 II型内含子 锤头核酶剪切型核酶 发夹核酶 自体催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 异体催化
31、 二、核酶的分类52抗体酶核酶极端医学知识1.1.剪接型核酶剪接型核酶 剪接型核酶的作用机制是通过既剪剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（又接的方式除去内含子（Intron)Intron)。53抗体酶核酶极端医学知识1 1）I I类内含子的自我剪接类内含子的自我剪接(Self-splicing)(Self-splicing)I I型型IVS(intervening squense,IVS(intervening squense,间隔序列）是与间隔序列）是与四膜虫四膜虫26srRNA26srRNA前体的前体的IVSIVS结构相似的间隔序列，结构相似的间隔序列，具有环状结构。通过转
32、磷酸酯反应，生成成熟的具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA26srRNA及及G-IVSG-IVS，G-IVSG-IVS经两次环化生成经两次环化生成L-19IVSL-19IVS。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。剪接机制剪接机制L-19IVSL-19IVS在体外的多种酶活性在体外的多种酶活性54抗体酶核酶极端医学知识p 3 HO-Gp3 pP-GOHp P-G3HO 类内含子的剪接机制Mg 2+或Mn 2+GMP,GDP,GTP外显子外显子 内含子或居间序列内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS)555
33、抗体酶核酶极端医学知识 U pAG pU535外显子3外显子内含子pG-OHpGpAG pU3U5OH第一次转酯反应第二次转酯反应U5pU3pGpAGOH5356抗体酶核酶极端医学知识58抗体酶核酶极端医学知识1、转核苷酸作用转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、水解作用水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC+pC3、转磷酸作用转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC+Pi5、限制性内切酶作用限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G C
34、pUpCpU +GpN 59抗体酶核酶极端医学知识2 2）类内含子的自我剪接类内含子的自我剪接型型IVSIVS是与细胞核是与细胞核mRNAmRNA前体的前体的IVSIVS结构结构相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，相似的间隔序列。通过转磷酸酯反应，生成成熟的生成成熟的RNARNA及套环状的及套环状的IVSIVS。催化的。催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子仍需要镁离子(Mg(Mg2+2+)。剪接机制剪接机制60抗体酶核酶极端医学知识p 2 HO-Ap p-A p3OHpP-AHO 3类内含子的剪接机制Mg 2+套环的形成套环的形成53外显子连接外
35、显子连接61抗体酶核酶极端医学知识2.2.剪切型核酶剪切型核酶 这类这类RNARNA进行自身催化的反应是只切不接。进行自身催化的反应是只切不接。1 1）自体催化剪切型）自体催化剪切型 剪切机制剪切机制 62抗体酶核酶极端医学知识转酯化过程：转酯化过程：由靠近切割由靠近切割位点位点3 3端的端的2 2OHOH或或氧原子对切割位氧原子对切割位点的磷原子实施点的磷原子实施亲核攻击，产生亲核攻击，产生5 5-OH-OH 和和2 2，3 3-环磷酸二酯环磷酸二酯。剪剪 切切 机机 制制核酶自身剪切反应核酶自身剪切反应63抗体酶核酶极端医学知识锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图三个双螺旋区。三个双
36、螺旋区。1313个核苷酸残基个核苷酸残基保守序列。保守序列。剪切反应在右上剪切反应在右上方方GUXGUX序列的序列的3 3端端自动发生。自动发生。64抗体酶核酶极端医学知识发夹（发夹（hairpin hairpin）结构）结构19891989年汉普（年汉普（HampleHample）研究烟草环斑病毒）研究烟草环斑病毒（sTRSVsTRSV）的负链）的负链RNARNA的自我剪切反应，提的自我剪切反应，提出发夹结构（出发夹结构（hairpin structurehairpin structure）模型。）模型。发夹核酶结构模型发夹核酶结构模型65抗体酶核酶极端医学知识四个螺旋区、三四个螺旋区、三个
37、连接区和两个环。个连接区和两个环。剪切反应发生在剪切反应发生在底物识别序列底物识别序列GUCGUC的的5 5端。端。53 发夹二级结构模型剪切位点剪切位点66抗体酶核酶极端医学知识2)2)异体催化剪切型异体催化剪切型 核糖核酸酶核糖核酸酶P(RNaseP)P(RNaseP)是内切核酸酶，是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNAtRNA前前体的体的5 5端，除去多余的序列，形成端，除去多余的序列，形成3 3-OH-OH 和和 5 5-磷酸末端。磷酸末端。l RNasePRNaseP由由M1RNAM1RNA和蛋白质亚基组成。和蛋白质亚基组成。67抗体酶
38、核酶极端医学知识携带氨基酸携带氨基酸辨认并结合氨基酰辨认并结合氨基酰tRNA合成酶合成酶识别识别mRNA上的密码上的密码识别并结合识别并结合核蛋白体核蛋白体氨基酸臂氨基酸臂DHU臂臂反密码臂反密码臂可变臂可变臂T C臂臂68抗体酶核酶极端医学知识三、核酶的应用三、核酶的应用1.1.基础理论：生命起源的探索基础理论：生命起源的探索2.2.医药：医药：1 1）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，）通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免抑制效率高，专一性强。如抗肝炎病毒、抗人类免疫缺陷病毒疫缺陷病毒型（型（HIV-)HIV-)、抗肿瘤。、抗肿瘤。2 2）
39、免疫原性低，很少引起免疫反应。）免疫原性低，很少引起免疫反应。3.3.植物抗病毒植物抗病毒69抗体酶核酶极端医学知识 四、核酶面临的问题四、核酶面临的问题1 1、核酶催化效率低。、核酶催化效率低。2 2、核酶本身是、核酶本身是RNARNA，很容易被核酸水解酶，很容易被核酸水解酶 RNaseRNase破坏。破坏。70抗体酶核酶极端医学知识五、影响核酶活性的因素五、影响核酶活性的因素1 1、pHpH值对活性的影响：值对活性的影响：pH7.0-7.5pH7.0-7.5时核酶活性最高。时核酶活性最高。2 2、二价金属阳离子对活性的影响、二价金属阳离子对活性的影响:Mg:Mg2+2+Mn Mn2+2+3
40、 3、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应、抗生素对活性的影响：大多数为抑制效应4 4、变性剂对活性的影响、变性剂对活性的影响:5 5、温度对活性的影响、温度对活性的影响:71抗体酶核酶极端医学知识第三节 极端酶（extremozyme）一、极端微生物和极端酶一、极端微生物和极端酶 1.1.极端微生物：极端微生物：又称嗜极菌（又称嗜极菌（extremophilesextremophiles），是在），是在超常生态环境条件下生存的微生物。超常生态环境条件下生存的微生物。72抗体酶核酶极端医学知识 根据所耐受的环境条件不同，分为：根据所耐受的环境条件不同，分为：嗜热菌（嗜热菌（thermophiles）超嗜热菌（超嗜热菌（hyperthermophiles）嗜冷菌（嗜冷菌（psychrophiles）嗜盐菌（嗜盐菌（halophiles）嗜酸菌（嗜酸菌（acidophiles）嗜碱菌嗜碱菌（alkaliphiles）嗜压菌（嗜压菌（barophiles）抗辐射的微生物抗辐射的微生物73抗体酶核酶极端医学知识2.2.极端酶的制备极端酶的制备 1 1）天然极端酶的筛选和生产）天然极端酶的筛选和生产 2 2）蛋白质工程生产极端酶）蛋白质工程生产极端酶74抗体酶核酶极端医学知识
