1、第七章第七章 细胞周期与肿瘤细胞周期与肿瘤 肿瘤共同特征肿瘤共同特征:细胞周期调控机制的破坏细胞周期调控机制的破坏,细胞失控性生长。细胞失控性生长。第一节第一节 历史回顾历史回顾 一、生命复制之迷被一层层揭开一、生命复制之迷被一层层揭开 第一次看见细胞；第一次看见细胞；细胞理论细胞理论;细胞生长过程细胞生长过程:有丝分裂期、细胞间期；有丝分裂期、细胞间期；1951年，细胞周期年，细胞周期G1期、期、S期、期、G2期、期、M期。期。传统细胞周期分析：细胞的同步化；传统细胞周期分析：细胞的同步化；S期或期或M期始末时间的观察。期始末时间的观察。流式细胞术流式细胞术 多参数流式细胞术多参数流式细胞术
2、 DNA/RNA同步分析法同步分析法成熟促进因子成熟促进因子MPF:正常有丝分裂的启动因子正常有丝分裂的启动因子细胞分裂周期基因细胞分裂周期基因cdc MPF:p34cdc2/28，CDKs(细胞周期素依赖性蛋白激酶细胞周期素依赖性蛋白激酶)细胞周期素细胞周期素 Cyclins 二二.肿瘤发生、发展研究与生命复制研究的会合肿瘤发生、发展研究与生命复制研究的会合 癌基因时代癌基因时代 抑癌基因时代抑癌基因时代 多基因时代、癌基因蛋白网络时代多基因时代、癌基因蛋白网络时代 肿瘤多步骤理论、肿瘤多步骤理论、DNA修复理论、细胞凋亡理论修复理论、细胞凋亡理论 细胞周期核心理论细胞周期核心理论三、肿瘤与
3、细胞周期研究的重大突破三、肿瘤与细胞周期研究的重大突破 肿瘤是多基因变化导致细胞周期紊乱，细肿瘤是多基因变化导致细胞周期紊乱，细胞失控性生长所致的一类疾病。胞失控性生长所致的一类疾病。肿瘤是多步骤发生、多基因突变的进化性肿瘤是多步骤发生、多基因突变的进化性疾病。疾病。1.“二次打击学说二次打击学说”：视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤 具有一种遗传缺陷的子代只是易患肿瘤，具有一种遗传缺陷的子代只是易患肿瘤，还需要另外的基因缺陷，才发生肿瘤。还需要另外的基因缺陷，才发生肿瘤。肿瘤抑制基因从结构破坏到功能丧失。肿瘤抑制基因从结构破坏到功能丧失。2.肿瘤发生发展是一个肿瘤发生发展是一个细胞克隆进化细胞克隆
4、进化的过程的过程 结肠癌：结肠癌：APC(肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因),ras（信号信号转导途径转导途径),p53（肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因)，DCC（粘附粘附因子因子)基因阶段性突变基因阶段性突变 癌基因、抑癌基因的功能效应，都从不同的癌基因、抑癌基因的功能效应，都从不同的途径最终会聚到细胞周期机制上来，直接参与途径最终会聚到细胞周期机制上来，直接参与调控或作为细胞周期调控机制的主要成分。调控或作为细胞周期调控机制的主要成分。肿瘤是一类肿瘤是一类多步骤、多基因突变多步骤、多基因突变所致的所致的细细胞周期调控机制破坏、细胞克隆性、进化性疾胞周期调控机制破坏、细胞克隆性、进化性疾病。病。第二节第二
5、节 细胞周期机制的核心细胞周期机制的核心 CDKsCDKs调控机制调控机制 间期：间期：G1、S、G2期期 有丝分裂期：有丝分裂期：M期期 细胞周期调控核心机制：细胞周期调控核心机制：依赖于细胞周期素特异性、时相性表达、依赖于细胞周期素特异性、时相性表达、累积与分解的累积与分解的CDKs 的时相激活。的时相激活。CDK 催化亚单位：底物结合部位催化亚单位：底物结合部位 含含ATP结合位点侧链结合位点侧链 细胞周期调控核心：蛋白激酶细胞周期调控核心：蛋白激酶 M M期期：CDC2 CDC2 cyclincyclin B1 B1；G2G2期期：CDK2 CDK2 cyclincyclin A A；
6、S S期期：CDK2 CDK2 cyclincyclin E;E;G1G1期期:CDK4,6-CDK4,6-cyclincyclin D1,D2,D3 D1,D2,D3 细胞周期过程中，某细胞周期过程中，某一一CDKCDK含量恒定，活含量恒定，活化与非活化化与非活化CDKCDK的总量不变。的总量不变。一、一、CyclinsCyclins是调控是调控CDKsCDKs活性的最基本成分活性的最基本成分 特异性区域：特异性区域：细胞周期素盒细胞周期素盒cyclincyclin box box：结合并激活结合并激活CDK CDK；特别区间特别区间：引导：引导CDKsCDKs到特定底物亚细胞部位。到特定底
7、物亚细胞部位。CyclinCyclin蛋白功能：蛋白功能：激活激活CDKsCDKs并并加强加强CDKsCDKs对底物的作用。对底物的作用。CyclinCyclin功能的调控：功能的调控：依赖其蛋白质水平的细胞周期特异性起伏。依赖其蛋白质水平的细胞周期特异性起伏。细胞周期调控蛋白的降解，控制着细胞周期内细胞周期调控蛋白的降解，控制着细胞周期内一系列事件的运行顺序、方向和协调。一系列事件的运行顺序、方向和协调。1.1.蛋白质降解：蛋白质降解：1983 1983年首次提出；年首次提出；19891989年进一步实验证实；年进一步实验证实；19911991年实验确认。年实验确认。2.泛肽化介导的泛肽化介
8、导的蛋白质水解蛋白质水解：多个多个泛肽链接在底物上，被蛋白酶体识别、降解泛肽链接在底物上，被蛋白酶体识别、降解 E1 激活酶：激活酶：E1泛肽羟基泛肽羟基 硫酯结合硫酯结合；E2 结合酶：结合酶：E3 连接酶：靶蛋白的赖氨酸残基连接酶：靶蛋白的赖氨酸残基 SCF：G1/S期期 APC(anaphase promoting complex)：M期期 3.G1-S转换中的蛋白质转换中的蛋白质水解水解 SCF复合物：复合物：Skp1、Cdc53/cullin、F-box(Protain)有丝分裂的关键调控蛋白有丝分裂的关键调控蛋白Weel也同样受到也同样受到SCF系统的调控：当系统的调控：当Weel
9、降解后，伴随着降解后，伴随着DNA复制的完成，细胞进入有丝分裂期。复制的完成，细胞进入有丝分裂期。SCF系统的两类底物：系统的两类底物：cdc4 Sicl 4.有丝分裂中蛋白质水解有丝分裂中蛋白质水解 APC ：有丝分裂后期促动因子复合物有丝分裂后期促动因子复合物 Cdc16,Cdc23,Cdc27 Cyclin B/Cdk1：1）驱动着细胞进入有丝分裂驱动着细胞进入有丝分裂期，阻滞细胞完成有丝分裂；期，阻滞细胞完成有丝分裂；2）灭活机制：）灭活机制：APC催化催化Cyclin B降解降解;CDK抑制物抑制物Sic1与与Cyclin BCdk1复合物结合复合物结合;CyclinB降解降解 Cf
10、i1：细胞间期，核仁，直接与细胞间期，核仁，直接与Cdc14结合；结合；使使Cdc14磷酸化失活；磷酸化失活；Cdc14：1）磷酸酶，使转录因子磷酸酶，使转录因子Swi5去磷酸化，去磷酸化，产生新的产生新的Sci1，后者被后者被Cyclin B/Cdk1磷酸化而磷酸化而降解；降解；2)使使Sci1去磷酸化，降低去磷酸化，降低CyclinB/Cdk1 活性，通过活性，通过Cdh1去磷酸化，能去磷酸化，能与与APC结合，使结合，使Cyclin B降解，降解，Cyclin B/Cdk1复合物彻底失活。复合物彻底失活。APC 激活，使激活，使Cyclin B降解，降解，Cyclin B/Cdk1复合物
11、灭活和复合物灭活和Sci1累积，使细胞出有丝累积，使细胞出有丝分裂后期，完成有丝分裂，进入早分裂后期，完成有丝分裂，进入早G1期。期。二、二、Thr 160/161 磷酸化磷酸化 Thr160/161磷酸化是磷酸化是CDK激活的重要条件。激活的重要条件。CAK(CDK-activating kinase)：CDK激活性蛋白激酶激活性蛋白激酶 1)催化亚单位蛋白激酶催化亚单位蛋白激酶MO1(CDK7);Cyclin H；2)一种一种CAK能使所有主要的能使所有主要的CDK-Cyclin底物底物 磷酸化而激活；磷酸化而激活；3)活性在细胞周期中无起伏状态；活性在细胞周期中无起伏状态；4)不是限速步
12、骤。不是限速步骤。灭活灭活CDK-Cyclin复合物重要机制：复合物重要机制：1）Cyclin的去除；的去除；2）Thr160/161 去磷酸化去磷酸化.三、三、Thr14/Tyr15 磷酸化和去磷酸化磷酸化和去磷酸化 是是CDK 激活及失活的重要环节激活及失活的重要环节。磷酸化磷酸化蛋白激酶蛋白激酶Weel,使使 CDC2上的上的 Thr14/Tyr15 磷酸化；磷酸化；磷酸酶磷酸酶CDC25 使使CDC2上的上的 Thr14/Tyr15 去磷酸化。去磷酸化。CDC2的激活过程的激活过程：Cyclin B1与与CDC2结合结合；Weel对对Thr14/Tyr15进行磷酸化，抑制进行磷酸化，抑
13、制CDC2的活性；的活性；CAK对对Thr160/161进行磷酸化进行磷酸化;CDC25 激活，使激活，使Thr14/Tyr15 去磷酸化；去磷酸化；CDC2被激活。被激活。CDK激活条件：激活条件：1.与特定与特定Cyclin结合；结合；2.Thr14/Tyr15磷酸化及去磷酸化；磷酸化及去磷酸化；3.CAK 使使Thr160/161磷酸化；磷酸化；4.Cyclin-CDK活性高于活性高于CKI。CDK失活条件：失活条件：1.Cyclin 降低；降低；2.Thr14/Tyr15磷酸化；磷酸化；3.Thr160/161去磷酸化；去磷酸化；4.TGF-11存在（存在（Cyclin D,E-CDK
14、2,A）；）；5.CKI结合并失活结合并失活Cyclin-CDK。四、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物四、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物 调控调控CDKsCDKs活性机制：活性机制：CyclinsCyclins、CAKCAK、Weel/Cdc25 Weel/Cdc25 的磷酸化和的磷酸化和去磷酸化、去磷酸化、CKIsCKIs（细胞周期依赖性蛋白激酶抑细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物）制物）CKICKI家族两大类：家族两大类：1)1)CipCip/Kip/Kip 家族：家族：p21 p27 p57p21 p27 p57 N N端端:与与CDKCDK结合的相同结构域；结合的相同结构域；与与CDKCDK结合后
15、，抑制结合后，抑制G1G1、S S期期CyclinCyclin-CDK,-CDK,是控制是控制G1/SG1/S转换的转换的CDKCDK的抑制剂的抑制剂 ；C C端端:结构与功能各不相同。结构与功能各不相同。特点：特点：p21 Cp21 C端有端有PCNAPCNA结合结构域，结合结构域，p21 p21 有两个有两个p27p27结合位点结合位点 2)2)INK4INK4家族家族：p15 p16 p18 p19p15 p16 p18 p19 主要与主要与CDK4CDK4、CDK6CDK6的抑制密切有关。的抑制密切有关。特点：特点：p16p16不随细胞周期时相变化；不随细胞周期时相变化；p19 p19
16、 随细胞周期规律性震荡。随细胞周期规律性震荡。TGF-TGF-11能促进能促进 p15 mRNA p15 mRNA 表达，抑制细表达，抑制细胞增殖。胞增殖。CKIsCKIs所识别的是多数所识别的是多数CDK-CDK-CyclinCyclin复合物，复合物，不是不是CDKCDK单体；单体；p16 INK4ap16 INK4a同同CDK4 CDK4 单体结合。单体结合。当当 DNADNA损伤及细胞衰老，具有转录因子作损伤及细胞衰老，具有转录因子作用的用的 p53p53增高，诱导增高，诱导 p21Cip1p21Cip1的转录增强，后的转录增强，后者与相应的者与相应的 CDK-CDK-CyclinCy
17、clin 复合物结合，抑制蛋复合物结合，抑制蛋白激酶的激活，阻滞细胞周期的进行。白激酶的激活，阻滞细胞周期的进行。第三节第三节 细胞周期调控的两大机制细胞周期调控的两大机制 一系列一系列CyclinsCyclins 时相性起伏，相应时相性起伏，相应CDKsCDKs依依次激活，驱动细胞通过次激活，驱动细胞通过G1G1、S S、G2G2期，到达期，到达M M期。期。一、一、细胞周期的启动机制细胞周期的启动机制 主要调控点：主要调控点：G1G1期期 酵母：酵母：“起始点起始点”STARTSTART，细胞内外信号细胞内外信号 人类细胞：人类细胞：“限制点限制点”restriction pointres
18、triction point，早期应答基因（早期应答基因（c-c-FosFos,c-Jun),c-Jun),延迟应答基因延迟应答基因 (CyclinCyclin D)D)信号转导信号转导 细胞周期的联结途径：细胞周期的联结途径：CyclinCyclin D-Cdk4/6 D-Cdk4/6 CyclinCyclin E-Cdk2 E-Cdk2 G1G1期限速步骤期限速步骤 生长信号（信号途径、早期应答基因）生长信号（信号途径、早期应答基因）CyclinCyclin D,D,CyclinCyclin D-Cdk4/6 D-Cdk4/6 CyclinCyclin D-Cdk4/6-p27Kip1 D
19、-Cdk4/6-p27Kip1复合物复合物 Cdk4/6Cdk4/6摄取、转移磷酸基团摄取、转移磷酸基团 1 1）pRBpRB低磷酸化状态：低磷酸化状态：pRBpRB与与E2FE2F结合，抑制结合，抑制S S期必须基因产物表达，阻止期必须基因产物表达，阻止G1/SG1/S、DNADNA合成，合成，阻断细胞周期；阻断细胞周期；2）pRB高磷酸化状态：高磷酸化状态：pRB失活，释放转录失活，释放转录因子（如因子（如E2F），），产生多种蛋白质，驱动细胞产生多种蛋白质，驱动细胞周期的进行；周期的进行；Cyclin E升高，升高，Cyclin E-Cdk2复合物，促使复合物，促使p27Kip1减少，减
20、少，Cdk2活化；活化；Cyclin E-Cdk2使使p27Kip1磷酸化，成为泛肽磷酸化，成为泛肽化蛋白水解的靶化蛋白水解的靶，降解。，降解。正是正是Rb pathway 的的E2F正反馈机制协同正反馈机制协同 p27Kip1降解机制，使细胞在降解机制，使细胞在“restriction point”后，越来越少地依赖生长因子或有丝后，越来越少地依赖生长因子或有丝分裂因子。分裂因子。二、二、细胞周期的监控机制细胞周期的监控机制 检测点检测点 checkpointcheckpoint 功能分类功能分类:DNADNA损伤检测点损伤检测点 时相次序检测点时相次序检测点 监控机制监控机制:探测部分（特
21、定基因产物）探测部分（特定基因产物）制动部分（细胞内信号转导）制动部分（细胞内信号转导）检修部分检修部分 处理部分处理部分 1.DNA损伤检测点损伤检测点 p53 pathway ;Cdc25 pathway DNA损伤损伤，信号传递给信号传递给p53;p53 稳定性增高，稳定性增高，p53蛋白水平升高蛋白水平升高;启动启动p21的转录，的转录，p21蛋白迅速升高，与多蛋白迅速升高，与多种种CDK-Cyclin复合物直接结合复合物直接结合,抑制抑制CDKs的的激活激活，阻滞阻滞G1/S的过渡的过渡，为修复为修复DNA提供足够提供足够的时间。的时间。ARF-Mdm2-p53 pathwayARF
22、-Mdm2-p53 pathway INK4a INK4a基因编码基因编码 p16INK4ap16INK4a、ARF/p14ARFARF/p14ARF）。）。RbRb pathway pathway激活后，激活后，E2F1E2F1、MycMyc等等将导致将导致ARFARF蛋蛋白的积累：白的积累：1 1）破坏破坏Mdm2Mdm2的功能（阻断的功能（阻断p53p53转录、转录、使使p53p53泛肽化、强制性使泛肽化、强制性使p53p53转运到胞浆中），转运到胞浆中），结果结果是是p53p53出现积累，导致细胞周期运行滞留，出现积累，导致细胞周期运行滞留，乃至发生细胞凋亡；乃至发生细胞凋亡；2 2）
23、细胞对细胞对DNADNA损伤更为敏感。损伤更为敏感。G2G2期检测点：期检测点：当当DNADNA损伤，激活损伤，激活hATMhATM/hATRhATR，使使Chk1Chk1蛋白蛋白激酶激酶磷酸化磷酸化，作用于磷酸酶作用于磷酸酶Cdc25(Ser-216Cdc25(Ser-216磷磷酸化酸化)，磷酸化后，磷酸化后Cdc25Cdc25与与14-3-314-3-3蛋白结合、扣蛋白结合、扣留、失活，不能将留、失活，不能将CDC2CDC2蛋白激酶蛋白激酶Thr-14/Tyr-Thr-14/Tyr-1515位去磷酸化，使位去磷酸化，使CDC2CDC2不能激活不能激活，导致，导致G2G2期阻期阻滞。滞。2.
24、时相次序检测点时相次序检测点 有丝分裂与有丝分裂与DNA复制严格的时相次序。复制严格的时相次序。1）有丝分裂促进因子有丝分裂促进因子MPF：G2、S期，期，诱发诱发 有丝分裂；染色体凝集。有丝分裂；染色体凝集。2）S期促进因子期促进因子SPF：诱发诱发G1期细胞核进入期细胞核进入S期；期；S期期CDKs存在于存在于S期的开始到期的开始到M期的结束；期的结束；只启动一次只启动一次DNA复制。复制。3）S期启动期启动 (1)S期开始前组装期开始前组装pre-RC（复制前复合物复制前复合物）ORC Cdc6p Mcm (2)S期期CDKs和和DDK（Cdc7-Dbf4）共同启动共同启动DNA的复制。
25、的复制。4）S期期CDKs的双重功能的双重功能：引发引发DNA复制的启复制的启动；防止动；防止pre-RC重复组装。重复组装。M期期CDKs：防止防止pre-RC重复组装重复组装。5）有丝分裂后期促进复合物）有丝分裂后期促进复合物（anaphase-promoting complex,APC,cyclosome)：调控姐妹染色体的分离和调控姐妹染色体的分离和M期期Cyclin的降解。的降解。M期期CDKs的激活并积累使的激活并积累使APC处于活化处于活化 状态，一直持续到状态，一直持续到G1期；期；G1期期CDKs的激活的激活 并积累又抑制了并积累又抑制了M期期Cyclin和和APC底物的成熟
26、底物的成熟前累积。前累积。第四节第四节 细胞周期的界面机制细胞周期的界面机制 细胞周期与信号转导、基因转录、细胞周期与信号转导、基因转录、DNA修修复、细胞凋亡、细胞分化等多种生命活动密切复、细胞凋亡、细胞分化等多种生命活动密切相关。相关。一、一、细胞周期与细胞周期与DNA修复修复 发现发现DNA损伤损伤/错误的传感器，受损细胞的错误的传感器，受损细胞的扣留，修复扣留，修复DNA，决定继续分裂或死亡。决定继续分裂或死亡。传感器传感器：人类：人类ATM，p53基因基因 ATM 编码蛋白激酶，结合在损伤的编码蛋白激酶，结合在损伤的DNA上，能将某些蛋白磷酸化，中断细胞周期。上，能将某些蛋白磷酸化，
27、中断细胞周期。信号通路：信号通路：1）激活）激活Chk1，引起引起Ser216磷酸磷酸化，抑制化，抑制CDC25，抑制抑制M-CDK，阻断细胞周阻断细胞周期；期；2）激活）激活Chk2，使使p53磷酸化，磷酸化，p21表达增表达增加，抑制加，抑制G1-S期期CDK，阻断细胞周期。阻断细胞周期。低等生物低等生物Rad24，Rad17，Mec3，DDC1，Rad9 Rad9，Rad24与单链与单链DNA结合，激活蛋白激酶结合，激活蛋白激酶Mec1，使使Rad9、Rad53、Pds1等蛋白磷酸化，等蛋白磷酸化，导致导致G2/M期过度的阻滞；期过度的阻滞；Mec1激活激活Rad53，调节调节Sml1，
28、导致导致dNTP合成增加，以供合成增加，以供DNA修修复需要；复需要；Mec1、Rad53及及Dun1的激活，使的激活，使Crt1磷酸化，解除转录抑制，开始磷酸化，解除转录抑制，开始DNA修复。修复。DNA修复的两大类形式修复的两大类形式：1）切除修复切除修复(excision repair)：碱基切除修复碱基切除修复BER：酶切错误的碱基并替换酶切错误的碱基并替换 核苷酸切除修复核苷酸切除修复NER：单个核苷酸或一段寡单个核苷酸或一段寡核苷酸切除、修复。核苷酸切除、修复。全基因组切除修复全基因组切除修复：蛋白质蛋白质/DNA直接作用直接作用识别、修复，可发生在基因的任何部位；识别、修复，可发
29、生在基因的任何部位；转录切除修复转录切除修复：在转录过程中完成切除、修复在转录过程中完成切除、修复 TFIIH，是一个多功能蛋白复合物，由是一个多功能蛋白复合物，由XP-B、XP-D和和TTD-A基因的蛋白产物构成，基因的蛋白产物构成，与基因转录的启动密切相关。在与基因转录的启动密切相关。在CAK的作用下，的作用下，TFIIH被激活。被激活。TFIIH将细胞周期、基因转录、将细胞周期、基因转录、DNA修复修复联系在一起。联系在一起。2）错配修复错配修复(mismatch repair)：MSH2基因产物识别基因产物识别;与与DNA直接形成复合物直接形成复合物;内源性核酸酶和核酸多聚酶作用内源性
30、核酸酶和核酸多聚酶作用,去除重复去除重复错配的错配的DNA链链 二、细胞周期与细胞凋亡二、细胞周期与细胞凋亡 不同因素诱导的细胞凋亡，发生在细胞周不同因素诱导的细胞凋亡，发生在细胞周期的不同时相。期的不同时相。三、细胞周期与细胞分化三、细胞周期与细胞分化 角化细胞分化角化细胞分化:p21Cip1与细胞分化有关与细胞分化有关;角化细胞分化时，角化细胞分化时，p21Cip1水平下降；水平下降；当细胞增殖时，当细胞增殖时，p21Cip1能抑制角化细胞分化，能抑制角化细胞分化，同时与同时与DNA多聚酶的主要成分多聚酶的主要成分PCNA结合，影结合，影响细胞周期中响细胞周期中DNA合成期的进行。合成期的
31、进行。Rb的研究中发现，的研究中发现，Rb磷酸化时，能释放所磷酸化时，能释放所“扣留扣留”的转录因子的转录因子E2F，驱动细胞周期的进驱动细胞周期的进行；当行；当Rb处于去磷酸化状态时，促使成肌细胞处于去磷酸化状态时，促使成肌细胞/脂肪细胞分化脂肪细胞分化 第五节第五节 肿瘤细胞周期机制的破坏肿瘤细胞周期机制的破坏 甲状旁腺腺瘤甲状旁腺腺瘤-Cyclin D1基因突变基因突变 肝细胞癌肝细胞癌-乙肝病毒嵌入乙肝病毒嵌入Cyclin A基因序列基因序列 乳腺癌乳腺癌-Cyclin E 过度表达过度表达 从三个方向（细胞分子生物学、肿瘤生物从三个方向（细胞分子生物学、肿瘤生物学和临床肿瘤学）、三类
32、基因（癌基因、抑癌学和临床肿瘤学）、三类基因（癌基因、抑癌基因和肿瘤易感基因）、三种细胞归宿（细胞基因和肿瘤易感基因）、三种细胞归宿（细胞分裂、细胞分化和细胞死亡）会聚到细胞周期分裂、细胞分化和细胞死亡）会聚到细胞周期调控机制，对肿瘤发生、发展的认识集中在三调控机制，对肿瘤发生、发展的认识集中在三个层面：个层面：监控机制监控机制/保真性（保真性（fidelity）驱动机制驱动机制/决策性（决策性（decision）相关生物学相关生物学/延伸性（延伸性（expanding）一、细胞周期监控机制的破坏一、细胞周期监控机制的破坏 肿瘤是一类多基因疾病：肿瘤是一类多基因疾病：1）遗传物质）遗传物质DN
33、A（或基因）的改变；或基因）的改变；2）多步骤、多基因变化；）多步骤、多基因变化；3）最终导致细胞的失控性生长。）最终导致细胞的失控性生长。DNA损伤检测点损伤检测点 1）G1-S过渡期过渡期：防止防止DNA受损细胞进入受损细胞进入S期，期，2）G2-M过渡期过渡期：防止受损的防止受损的DNA和未完成复制和未完成复制的的DNA进入有丝分裂。进入有丝分裂。DNA损伤检测点的主要机制损伤检测点的主要机制 1）p53依赖性机制依赖性机制 2）p53非依赖性机制非依赖性机制 检测点的四部分功能检测点的四部分功能：发现发现detect、制动制动stop、工作工作work、决定决定decision 典型例
34、子典型例子-p53基因的突变基因的突变 DNA病毒（病毒（SV40、HPV、腺病毒等），腺病毒等），首先导致遗传的不稳定性，通过其产物，结合首先导致遗传的不稳定性，通过其产物，结合并使并使p53蛋白灭活，减弱细胞周期检测点功能；蛋白灭活，减弱细胞周期检测点功能；缺乏缺乏p53或或AT基因的细胞基因的细胞，经放射线照射，经放射线照射后，遗传的不稳定性明显增加，即使该基因是后，遗传的不稳定性明显增加，即使该基因是杂合性丢失，也将导致乳腺癌。杂合性丢失，也将导致乳腺癌。二、细胞周期驱动机制的破坏二、细胞周期驱动机制的破坏 在正常细胞在正常细胞S期，期，Cyclin A蛋白与转录因子蛋白与转录因子E2
35、F结合。结合。研究发现，肝细胞癌的细胞中，乙肝病毒研究发现，肝细胞癌的细胞中，乙肝病毒的的DNA片段整合到了片段整合到了Cyclin A 基因中；在腺基因中；在腺病毒转化的细胞中，病毒转化的细胞中，Cyclin A与腺病毒转化蛋与腺病毒转化蛋白白EIA结合在一起。结合在一起。PRAD1与与bcl-1基因序列联在一起，在基因序列联在一起，在B淋淋巴细胞白血病时，巴细胞白血病时，bcl-1移位到免疫球蛋白基移位到免疫球蛋白基因增强子而被激活；因增强子而被激活；在甲状旁腺肿瘤细胞中，染色体重排，使在甲状旁腺肿瘤细胞中，染色体重排，使PRAD1与甲状旁腺激素基因的增强子并置，与甲状旁腺激素基因的增强子
36、并置，导致导致PRAD1大量表达。大量表达。正常情况下，正常情况下，PRAD1产物能激活产物能激活Cdc2/Cdc2类蛋白激酶（类蛋白激酶（Cyclin D1）。）。直接的直接的CKIs、Rb和和p53的破坏更常见。的破坏更常见。DNA损伤所致的经典途径损伤所致的经典途径 p53-p21-CDKs-Cyclins DNA损伤损伤p53表达增加表达增加 p21Cip1转录转录增加增加细胞周期运行受阻细胞周期运行受阻 p53突变时，丧失了促进突变时，丧失了促进p21Cip1转录的功转录的功能，导致含有受损能，导致含有受损DNA的细胞，仍然处于细胞的细胞，仍然处于细胞周期运行中复制。周期运行中复制。
37、p21Cip1的双重制动作用：的双重制动作用：1）抑制）抑制CDKs的活性；的活性；2）直接结合，抑制增殖细胞核抗原。）直接结合，抑制增殖细胞核抗原。“多肿瘤抑制基因多肿瘤抑制基因”MTS1（multipletumor suppressor）：）：编码蛋白产物为编码蛋白产物为p16，一种蛋白激酶抑制物，一种蛋白激酶抑制物，1）特异性抑制）特异性抑制Cdk4-Cyclin D蛋白激酶的活性；蛋白激酶的活性；2）不能对其底物）不能对其底物Rb进行磷酸化，阻止了进行磷酸化，阻止了G1-S 的过渡；的过渡；3）使）使Cyclin D不能连接生长因子信号转导与细不能连接生长因子信号转导与细 胞周期调控机
38、制，阻碍胞周期调控机制，阻碍 细胞的生长、复细胞的生长、复 制与分裂。制与分裂。第六节第六节 问题与展望问题与展望 细胞周期细胞周期核心机制核心机制的精确解剖的精确解剖 细胞周期细胞周期界面联系界面联系的精确解剖的精确解剖 第一节第一节 历史回顾历史回顾 第二节细胞周期机制的核心第二节细胞周期机制的核心CDKs调控机制调控机制 Cyclins是调控是调控CDK活性的最基本成分活性的最基本成分 Thr160/161磷酸化磷酸化 Thr14/Tyr15磷酸化和去磷酸化磷酸化和去磷酸化 细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物 第三节第三节 细胞周期调控的两大机制细胞周期调控的两大机
39、制 细胞周期的启动机制细胞周期的启动机制 细胞周期的监控机制细胞周期的监控机制 第四节第四节 细胞周期的界面机制细胞周期的界面机制 细胞周期与细胞周期与DNA修复修复 细胞周期与细胞凋亡细胞周期与细胞凋亡 细胞周期与细胞分化细胞周期与细胞分化 第五节第五节 肿瘤细胞周期机制的破坏肿瘤细胞周期机制的破坏 细胞周期监控机制的破坏细胞周期监控机制的破坏 细胞周期驱动机制的破坏细胞周期驱动机制的破坏 第六节第六节 问题与展望问题与展望 第九章第九章 细胞凋亡与肿瘤细胞凋亡与肿瘤 1858年年 细胞细胞退化、坏疽、软化、坏死；退化、坏疽、软化、坏死；1885年年 “染色体裂解染色体裂解”；1914年年
40、提出了提出了平衡机制平衡机制，认为是生理性认为是生理性 清除细胞；清除细胞；1951年年 提出提出“程序化细胞死亡程序化细胞死亡”；20年后年后 提出提出“固缩性坏死固缩性坏死”1972年年 正式以正式以“细胞凋亡细胞凋亡”（apoptosis）命命名名 1976-1981年年 发现发现“梯样梯样”DNA电泳图谱；电泳图谱；1984年年 发现发现内源性核酸酶内源性核酸酶的激活；的激活；直到直到20世纪世纪80年代末期，才真正开始认识到细年代末期，才真正开始认识到细胞凋亡的生物学意义。胞凋亡的生物学意义。第一节第一节 细胞凋亡的特点及其意义细胞凋亡的特点及其意义 一、细胞凋亡的基本特点及其评价方
41、法一、细胞凋亡的基本特点及其评价方法 （一）凋亡细胞的（一）凋亡细胞的形态学形态学特特征征 胞浆空泡，膜发泡，空泡排出，细胞固缩，胞浆空泡，膜发泡，空泡排出，细胞固缩，细胞体积缩小；细胞膜和核膜保持完整细胞体积缩小；细胞膜和核膜保持完整；线粒；线粒体超浓缩、染色质进行性固缩，体超浓缩、染色质进行性固缩，核凝聚核凝聚；核周核周出现块状结构、出现块状结构、“致密球体致密球体”或葡萄串样小球或葡萄串样小球体或半月形，体或半月形，凋亡小体凋亡小体存在。存在。（二）（二）非随机性非随机性DNA降解降解 琼脂糖凝胶电泳呈现琼脂糖凝胶电泳呈现DNA梯状图谱梯状图谱（DNA ladder），），是细胞凋亡的重
42、要生物化学标志。是细胞凋亡的重要生物化学标志。原位末端标记原位末端标记（in site end labeling，ISEL）技术技术：根据根据DNA聚合酶能够填补双链聚合酶能够填补双链DNA中中单链的缺失部分，应用标记的三磷酸核苷酸形单链的缺失部分，应用标记的三磷酸核苷酸形成新的成新的DNA。）DNA缺口平移法：缺口平移法：）原位末端标记法：）原位末端标记法：）末端）末端DNA转移酶转移酶dUTP缺口末端标记法。缺口末端标记法。（三）（三）细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻胆碱类磷脂（磷脂酰胆碱、鞘磷脂）胆碱类磷脂（磷脂酰胆碱、鞘磷脂）氨基类磷脂（磷脂酰丝氨酸氨基类磷脂（磷脂酰丝氨酸
43、PS、磷脂酰乙醇胺）磷脂酰乙醇胺）PS外翻现象是早期凋亡细胞重要特征之一。外翻现象是早期凋亡细胞重要特征之一。由于由于Ca+依赖的磷脂结合蛋白依赖的磷脂结合蛋白annexin V 能与能与PS高亲和结合，同时结合膜非通透性高亲和结合，同时结合膜非通透性DNA染料（染料（PI）则能从染色细胞中将凋亡和坏则能从染色细胞中将凋亡和坏死细胞区分开来。死细胞区分开来。（四）（四）保持充足的能量代谢直至细胞凋亡末期保持充足的能量代谢直至细胞凋亡末期 在在ATP存在下，钙亲合剂诱导细胞凋亡；存在下，钙亲合剂诱导细胞凋亡；反之，诱导细胞发生坏死。反之，诱导细胞发生坏死。在预先耗竭在预先耗竭ATP的情况下，凋亡
44、诱导剂和的情况下，凋亡诱导剂和Fas配体诱导的配体诱导的T细胞死亡形式由凋亡转向死亡。细胞死亡形式由凋亡转向死亡。（五）（五）细胞凋亡的结局细胞凋亡的结局 凋亡小体凋亡小体（apoptotic body）细胞凋亡与细胞坏死的细胞凋亡与细胞坏死的区别区别：1）形态学形态学：细胞体积细胞体积 细胞膜、细胞器、细胞核细胞膜、细胞器、细胞核 溶酶体、线粒体溶酶体、线粒体 2）生物化学生物化学：DNA、蛋白质（蛋白质（Caspases）底物、抗死亡分子底物、抗死亡分子 对对ATP的需求的需求 3)组织分布、组织反应组织分布、组织反应 特特 点点 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死细胞膜细胞膜通透性正常通
45、透性正常完整性破坏完整性破坏染色质染色质凝聚，半月状凝聚，半月状絮状絮状细胞器细胞器完整完整损伤损伤细胞核细胞核固缩，降解固缩，降解溶解溶解溶酶体溶酶体完整完整裂解裂解线粒体线粒体浓缩，浓缩，cytocyto C C释放释放肿胀、破坏肿胀、破坏DNADNA核小体间剪切核小体间剪切非特征性剪切非特征性剪切蛋白质蛋白质CaspasesCaspases活化活化非特异性降解非特异性降解ATPATP必需必需无需无需分布分布单个细胞单个细胞细胞群体细胞群体凋亡小体凋亡小体有有，被吞噬，被吞噬无，细胞自溶无，细胞自溶炎症反应炎症反应无无，补释放内容物，补释放内容物有，释放内容物有，释放内容物 形态学改变的检
46、测方法形态学改变的检测方法 1.普通光学显微镜；普通光学显微镜；2.荧光显微镜；荧光显微镜；3.电镜；电镜；4.凋亡指数和细胞活力定量测定凋亡指数和细胞活力定量测定 生物化学方法生物化学方法 （琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳）免疫学方法免疫学方法（ELISA法法）原位末端转移酶标记技术原位末端转移酶标记技术（荧光酶标记荧光酶标记）靶细胞靶细胞DNA片段定量分析及细胞溶解试验片段定量分析及细胞溶解试验 流式细胞分析技术流式细胞分析技术 二、流式细胞仪在细胞凋亡研究中的应用二、流式细胞仪在细胞凋亡研究中的应用 流式细胞仪是流式细胞仪是分析细胞学分析细胞学研究的重要工具。研究的重要工具。三、细胞凋亡的
47、生物学意义概述三、细胞凋亡的生物学意义概述 细胞凋亡具有极其广泛的生物学意义，涉细胞凋亡具有极其广泛的生物学意义，涉及及胚胎发育胚胎发育、形态发生形态发生、细胞稳定细胞稳定及及免疫防御免疫防御机制机制等诸多方面等诸多方面。细胞凋亡的异常，可引起多种疾病（自身细胞凋亡的异常，可引起多种疾病（自身免疫性疾病、神经退行性疾病、恶性肿瘤等发免疫性疾病、神经退行性疾病、恶性肿瘤等发生）。生）。研究细胞凋亡具有重要的生物学意义：研究细胞凋亡具有重要的生物学意义：细胞凋亡在细胞凋亡在维持组织及器官的正常形态和维持组织及器官的正常形态和功能功能方面起着重要作用；方面起着重要作用；细胞凋亡在细胞凋亡在肿瘤形成和
48、治疗肿瘤形成和治疗中具有重要作中具有重要作用；用；细胞凋亡细胞凋亡与免疫学关系与免疫学关系十分密切。十分密切。第二节第二节 Caspases和死亡受体相关的和死亡受体相关的 细胞凋亡途径细胞凋亡途径 细胞凋亡的过程分为三个时期细胞凋亡的过程分为三个时期：诱导期诱导期 效应期效应期 降解期降解期 在研究模型中，发现三个重要基因在研究模型中，发现三个重要基因：促进促进细胞凋亡基因：细胞凋亡基因：ced-3、ced-4 抑制抑制细胞凋亡基因：细胞凋亡基因：ced-9 CED-3：半胱氨酸蛋白酶，激活的半胱氨酸蛋白酶，激活的CED-3 特异特异 性降解蛋白底物；性降解蛋白底物；CED-4：与与CED-
49、3结合并促进结合并促进CED-3激活，激活，CED-9：与与CED-4结合并阻止它激活结合并阻止它激活CED-3 诱导、调控凋亡的基本机制：诱导、调控凋亡的基本机制：在凋亡诱导信号作用下，在凋亡诱导信号作用下，Ced-9自三体复自三体复合物合物（Ced-3-Ced-4-Ced-9）中解离，导致中解离，导致Ced-4 激活激活Ced-3，活化的活化的Ced-3特异地降解蛋特异地降解蛋白底物，最终发生细胞凋亡。白底物，最终发生细胞凋亡。哺乳动物体内，哺乳动物体内，caspases与与ced-3同源同源；Apaf-1基因与基因与ced-4同源同源；Bcl-2基因家族与基因家族与 ced-9在结构和功
50、能上相似在结构和功能上相似(分为促进和抑制亚分为促进和抑制亚群群)哺乳动物细胞凋亡的主要途径：哺乳动物细胞凋亡的主要途径：死亡受体途径、线粒体途径。死亡受体途径、线粒体途径。凋亡后期的共同途径：凋亡后期的共同途径：Caspases激活激活 一、一、Caspases的结构和活性特点的结构和活性特点 1993年，发现白细胞介素年，发现白细胞介素-1转化酶转化酶 ICE（interleukin-1B-converting enzyme）与与Ced-3基因存在功能和序列相似性。基因存在功能和序列相似性。1996年，统一命名为年，统一命名为天冬氨酸特异性半胱天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶氨酸蛋白酶(cas
