1、实验九，十大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 在自然条件下在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种一般缺乏此种转移所必需的转移所必需的mobmob基因基因,因此不能自行完成从一个细胞到另因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，
2、成为能允许外源细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。分子进入的细胞，称感受态细胞。一一.实验原理实验原理1.概念概念感感 受受 态态 细细 胞胞大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 转化转化(Transformation)(Transformation)是将外源是将外源DNADNA分子引入分子引入受体细胞受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段使之获得新的遗传性状的一种手段,它它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。的基本实验技术。转转 化化大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 转化过程所用的受体细
3、胞一般是限制修饰系统缺陷的变转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它它可以容忍外源可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法受体细胞经过一些特殊方法(如电击法如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法等化学试剂法)的处理后的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改细胞膜的通透性发生了暂时性的改变变,成为能允许外源成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞
4、的进入受体细胞的DNA分子通过复制分子通过复制,表达实现遗传信息的表达实现遗传信息的转移转移,使受体细胞出现新的遗传性状。使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子转化子(Transformant,即带有异源即带有异源DNA分子的受体细胞分子的受体细胞)。转转 化化转化过程转化过程大肠杆菌感受态细胞的制备和转化RbCl(KCl)法，法，CaCl2法，电击感受态制备等法，电击感受态制备等 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，法制备的感受态细胞转化效率较高，但制备较复杂，不适合实验室用但制备较复杂
5、，不适合实验室用 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击仪电击仪 CaCl2法简便易行法简便易行，且其转化效率完全可以满足，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积时，可加入占总体积15的无菌甘油于的无菌甘油于-70以下以下保存半年，因此保存半年，因此CaCl2法使用更为广泛法使用更为广泛.常用的感受态细胞制备方法常用的感受态细胞制备方法大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 CaCl2法是以法是以Mendel和和Higa（1970）的发现为基）的发现为基础，其基本原理是
6、：细胞处于础，其基本原理是：细胞处于 0 4，CaCl2 低低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的中的 DNA 形成抗形成抗 DNA 酶的羟基酶的羟基-钙磷酸复合物粘钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经附于细胞表面，经 42 90 秒热激处理，促进细胞秒热激处理，促进细胞吸收吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（型，如氨苄青霉素耐药（Amp r）得到表达，然后）得到表达，然后将此细菌培养物涂在
7、含将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。CaCl 2 法制备感受态细胞原理法制备感受态细胞原理大肠杆菌感受态细胞的制备和转化提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度 试剂的质量试剂的质量 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染的污染大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从的培养菌，最好从7070或或-20-20甘油保存的菌种中直接转接用于
8、制备甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的长期时为好，可通过监测培养液的ODOD600600 来控制。来控制。DH5DH5菌株的菌株的ODOD600600 为为0.50.5时时,细胞密度在细胞密度在5 510107 7 个个/ml/ml左右左右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同),),这时比较合适。密这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。度过高或不足均会影响转化效率。提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 质粒的质量和浓度质粒的
9、质量和浓度:用 于 转 化 的 质 粒用 于 转 化 的 质 粒 D N A 应 主 要 是 超 螺 旋 态应 主 要 是 超 螺 旋 态DNA(cccDNA)。转化效率与外源。转化效率与外源DNA的浓度在一定的浓度在一定范围内成正比范围内成正比,但当加入的外源但当加入的外源DNA的量过多或体积的量过多或体积过大时过大时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。1ng的的cccDNA即可使即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液溶液的体积不应超过感受态细胞体积的的体积不应超过感受态细胞体积的5。提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素大肠杆菌感
10、受态细胞的制备和转化 试剂的质量试剂的质量:所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 等均需是最高纯度的等均需是最高纯度的(GR.或或AR.),并用超纯水配制并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处最好分装保存于干燥的冷暗处 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿所用器皿,如如离心管离心管,tip头等最好是新的头等最好是新的,并经高压灭菌处理并经高压灭菌处理,所有所有的试剂都要灭菌的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNA酶或酶或杂杂DNA所污染所污染,否则均会影响转化效率或杂否则均会影响转
11、化效率或杂DNA的的转入转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。提高转化效率的几个因素提高转化效率的几个因素大肠杆菌感受态细胞的制备和转化1）材料）材料E.coli DH5菌株；菌株；pBS质粒、1.5ml 离心管（又称离心管（又称eppendorf管）管）Amp；2）设备）设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪，计，微量移液枪，eppendorf管等。管等。二二.材料，设备及试剂材料，设备及
12、试剂大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 0.1mol/L的的CaCl2 LB液体培养基液体培养基 LB固体培养基固体培养基 Amp母液：氨苄青霉素母液：氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配母液：配成成 100mg/ml水溶液水溶液,-20保存备用保存备用 3.试试 剂剂大肠杆菌感受态细胞的制备和转化三三.操作步骤操作步骤 本实验以本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞菌株为受体细胞,并用并用CaCl2处理处理,使其处于感受态使其处于感受态,然后与质粒共保温然后与质粒共保温,实现实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过可通过
13、Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入质粒，则在含质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。能在的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。泳、酶切等进一步鉴定。大肠杆菌感受态细胞的制备和转化1.受体菌的培养受体菌的培养 1)从从LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E.coli DH5单菌落单菌落,接种接种于于3-5ml LB液体培养基中液体培养基中,37,180r
14、pm振荡培养过夜；振荡培养过夜；2)将该菌悬液以将该菌悬液以1:30-100的比例接种于的比例接种于100ml LB液体液体培养基中，培养基中，37振荡培养振荡培养23小时至小时至OD600在在0.3-0.4左右左右;3)无菌条件下取无菌条件下取1.5 ml菌液到菌液到eppendorf管管中，冰浴中，冰浴10min，4,8000rpm离心离心5min;4)彻底彻底弃上清液，在冰浴上加入弃上清液，在冰浴上加入500ul预冷的无菌预冷的无菌CaCl2(0.lmol/L)使细胞悬浮；使细胞悬浮；大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 5)4,8000 rpm离心离心4min，弃上清液，弃上清液(4,5步步
15、可重复可重复1-2次）次）;6)用用100l预冷的无菌预冷的无菌CaC12(0.lmol/L)重新悬重新悬浮细胞，冰上备用；浮细胞，冰上备用；注：如果需要保存，用注：如果需要保存，用80ul 预冷的无菌预冷的无菌CaC12(O.lmol/L)和和20ul无菌的无菌的70%甘油悬浮细胞，液氮甘油悬浮细胞，液氮冷激冷激10min后，后，-70以下保存备用。以下保存备用。大肠杆菌感受态细胞的制备和转化2.转化转化 取取100l100l感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，加入加入10l10l连接产物（或质粒连接产物（或质粒DNADNA）(含量不超过含量不超过50ng,5
16、0ng,体积不超过体积不超过10l)10l)，轻轻摇匀，冰上，轻轻摇匀，冰上30-30-40min40min；A.A.质粒质粒DNADNA组：组：10l 10l pBSpBS质粒质粒DNA+100lDNA+100l感受态细感受态细胞悬液胞悬液B.B.空白对照组空白对照组:10ul10ul无菌水无菌水100l100l感受态细胞悬感受态细胞悬液液大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 42水浴中热击水浴中热击90秒（勿摇动），热击后秒（勿摇动），热击后迅速置于冰上冷却迅速置于冰上冷却2min；向管中加入向管中加入400L LB液体培养基液体培养基(不含不含Amp)，混匀后，混匀后37，180rpm振荡培养
17、振荡培养40min，使细菌恢复正常生长状态，并表达，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)；涂平板：将上述菌液摇匀后取涂平板：将上述菌液摇匀后取100ul涂布于涂布于含含Amp的筛选平板上，的筛选平板上，在菌液完全被培养基吸收后，37倒置培养皿培养倒置培养皿培养1216h。大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 注意：注意：1、含、含Amp的的LB固体培养基的配制固体培养基的配制:将灭菌的将灭菌的LB固固体培养基水浴溶解后冷却至体培养基水浴溶解后冷却至60左右左右,加入加入Amp储存液储存液,使终浓度为使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后倒平板；摇匀后倒平板；2、1 1小时空间：转化后温浴小时空间：转化后温浴45min45min左右，让抗性基左右，让抗性基因得以表达，再涂抗性平板因得以表达，再涂抗性平板 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化四四.问题与讨论问题与讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
